2. 100142 北京,空军特色医学中心消化内科;
3. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院消化内科
2. Department of Gastroenterology, Air Force Medical Center of PLA, Beijing, 100142;
3. Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
肝脏作为人体最大的器官,在代谢过程中发挥着重要作用,包括物质合成、葡萄糖稳态、胆汁生成/失活、解毒以及免疫反应调节。肝脏疾病包括肝炎、阻塞性黄疸或胆汁淤积、肝硬化、酒精性和非酒精性脂肪肝以及肝癌等[1]。胆汁淤积(cholestasis)是由各种原因导致胆道系统功能失调、代谢产物蓄积而诱发的一类临床综合征,分为肝内胆汁淤积和肝外胆汁淤积[2-3]。病理表现为疏水性胆汁酸长期在肝脏内蓄积,加速细胞死亡、炎症及纤维化,最终发展为肝硬化甚至肝癌[4]。目前针对胆汁淤积性肝病的药物治疗方法比较有限,而肝移植作为最后选择也存在着诸如供体不足、并发症多及术后复发率高等缺点[5]。因此,探索针对胆汁淤积性肝病的新型有效药物具有重要意义。
α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate,AKG,图 1A)是三羧酸循环的关键中间代谢产物,也是谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸等氨基酸、维生素和有机酸的合成前体,具有生物利用度高、易于合成等特点[6]。既往研究发现,动物饮食中添加AKG可以刺激生物合成过程并有助于组织恢复[7],补充AKG可以维持老年动物的氧化还原稳态,改善细胞能量代谢,从而保持血管弹性[8];同时还能减少自由基,防止缺血导致的大脑氧化应激损伤[9];此外,AKG具有减弱氨毒性的作用[10],也是氰化物的有效解毒剂[11]。近年来AKG已被证明对酒精性肝损伤[12]、药物性肝损伤[13]及LPS诱导的肝损伤[14]具有一定的保护作用,然而,AKG在胆汁淤积性肝病中的作用却尚少见报道[15]。
本研究通过胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)建立胆汁淤积性肝损伤小鼠模型,评价该模型的病理学特征,同时研究饮食补充AKG对上述小鼠肝损伤的缓解作用及其可能涉及的分子机制,最终为开发新型抗胆汁淤积性肝损伤药物提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物32只雄性C57BL/6小鼠(6~8周,体质量20~25 g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号SCXK(京)2021-0011,饲养于陆军军医大学第二附属医院实验动物房,环境温度20~25 ℃,相对湿度(50±5)%,光照周期12 h/12 h,自由进食饲料和水,预适应环境7 d。
1.1.2 试剂α-酮戊二酸钙盐(英国Carbosynth公司),AIN-93G标准饲料(深圳睿迪生物科技公司),异氟烷(深圳瑞沃德公司),总RNA提取试剂盒、反转录反应试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),qRT-PCR引物(上海生物工程公司),F4/80一抗(美国BIO-RAD公司),MPO一抗(美国Abcam公司),TUNEL检测试剂盒(英国Roche公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物造模及分组采用随机数字表法将32只小鼠分为假手术(Sham)组、假手术+AKG(Sham+AKG)组、胆管结扎(BDL)组和胆管结扎+AKG(BDL+AKG)组,每组8只。考虑到α-酮戊二酸是一种具有胃肠道腐蚀性的强酸[16],选用其钙盐化合物,可以有效模拟单体α-酮戊二酸在体内的药理学作用[17],以AIN-93G标准饲料为基础添加2% (质量分数)α-酮戊二酸钙盐(实验饲料)进行实验,Sham+AKG组和BDL+ AKG组小鼠自由进食实验饲料,其余两组正常进食标准饲料,直至14 d实验结束。进食实验饲料7 d,BDL组和BDL+AKG组小鼠按文献[18]所述行BDL手术:小鼠开腹后轻轻剥开肝脏,在与肝门静脉伴行的一条透明胆管上用4-0手术线行两次结扎,肝脏复位后关腹;其余两组动物接受剖腹手术分离胆管但不进行结扎。术后存活7 d的小鼠被纳入研究,如早期死亡则归因于外科手术。实验结束后,小鼠称重,经异氟烷吸入性麻醉,下腔静脉采血后颈椎脱位实施安乐死,收集肝脏组织,分别用4%多聚甲醛固定及-80 ℃冰箱保存。
1.2.2 肝脏指数小鼠处死后快速分离整个肝脏并称重,计算肝脏质量与体质量之比,即肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量(mg)/体质量(g)。
1.2.3 血清生化指标检测小鼠血液置于室温下4 h,在4 ℃、3 000 r/min条件下离心10 min,收集血清,全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)及碱性磷酸酶(ALP)水平,由陆军军医大学第二附属医院检验科检测。
1.2.4 HE染色小鼠肝右叶经4%多聚甲醛固定,梯度酒精脱水及二甲苯透明处理后,石蜡包埋并用组织切片机进行组织切片。用苏木精-伊红行组织染色,光学显微镜下观察病理改变。病理诊断由两位资深病理医师担任,读片后揭盲。使用Image J软件(1.8.0)对胆汁性损伤面积进行统计。
1.2.5 TUNEL染色肝组织切片滴加4%多聚甲醛,室温固定10 min,弃去甲醛,用PBS洗2次,每次5 min;滴加3%过氧化氢-甲醇,室温孵育10 min,消除内源性过氧化物酶干扰后弃去,PBS洗2次,每次5 min;滴加100 μL由PBS配制的0.2% Triton X-100,于湿盒中室温孵育5 min,弃去通透液,PBS洗2次,每次5 min;按照TUNEL试剂盒说明书配制好标记反应体系,滴加50 μL标记反应混合物,避光孵育30 min,PBS洗2次,每次10 min;滴加50 μL转化剂POD,避光反应30 min,PBS洗2次,每次5 min;滴加现配的DAB工作液,结合显微镜下观察背景颜色变化,控制显色时间,载玻片放入蒸馏水切片缸内,水洗终止显色;苏木精复染;光学显微镜观察凋亡细胞数量。
1.2.6 免疫组化检测肝组织F4/80及MPO将肝组织石蜡切片与F4/80(1∶100稀释)、MPO(1∶50稀释)一抗和生物素化二抗(1∶200稀释)孵育适当时间,DAB显色,在光学显微镜下观察所有切片,使用Image J软件(1.8.0)对免疫组化染色阳性细胞进行统计。
1.2.7 qRT-PCR法检测基因mRNA表达水平TRIzol法提取细胞总RNA,经TaKaRa反转录酶试剂盒逆转录得到cDNA,按说明书使用TaKaRa的SYBR Ⅱ试剂检测基因mRNA水平,PCR反应体系为20 μL。β-actin作为内参,引物序列见表 1,数据分析采用-2ΔΔCt法。
基因名称 | 引物序列(5′→3′) | 扩增片段长度/bp |
β-actin | 上游: GTGACGTTGACATCCGTAAAGA 下游: GCCGGACTCATCGTACTCC |
245 |
IL-6 | 上游: CCTCTCTGCAAGAGACTTCCAT 下游: AGTCTCCTCTCCGGACTTGT |
95 |
IL-1β | 上游: AACCTGCTGGTGTGTGACGTTC 下游: CAGCACGAGGCTTTTTTGTTGT |
78 |
TNF-α | 上游: CAGGCGGTGCCTATGTCTC 下游: CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG |
89 |
MCP-1 | 上游: CCAAAGAAGCTGTGATCTTCAA 下游: TGGAATCCTGAACCCACTTC |
81 |
1.3 统计学分析
各组数据以x±s表示,采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理及统计分析,多组间差异使用单因素方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况和肝脏指数实验期间Sham组和Sham+AKG组小鼠精神状态良好,活动无明显异常,无皮毛掉落现象。BDL组和BDL+AKG组小鼠活动性减弱,精神状态变差,皮毛变暗,抓取易掉毛,黏膜黄染,粪便颜色变浅,尿液呈金黄色。各组小鼠均未出现死亡。
肝脏大体显示(图 1B),Sham组和Sham+AKG组小鼠肝脏柔润,外观呈红褐色,大小正常,表面平滑有光泽。BDL组小鼠肝脏肿大,光泽较暗,表面出现白色结节,增大的胆囊中充满大量墨绿色胆汁。BDL+AKG组小鼠胆囊与BDL组相比略有减小,肝脏表面结节有所减少,但与Sham组形态学上仍存在一定差异。
称重结果显示(图 1C),与Sham组相比,BDL组肝脏指数显著增加(P<0.01),AKG处理后有减小趋势,但无统计学差异。
2.2 AKG对BDL小鼠血清转氨酶水平的影响BDL组ALT和AST显著高于Sham组(P<0.01),BDL+AKG组血清ALT和AST明显低于BDL组(P<0.05),Sham+AKG组与Sham组无统计学差异。见图 2。
2.3 AKG对BDL小鼠血清总胆红素、总胆汁酸及碱性磷酸酶水平的影响
与Sham组相比,BDL组血清TBIL、TBA、ALP水平明显增高(P<0.01),而BDL+AKG组TBIL、TBA、ALP水平较BDL组明显降低(P<0.05)。见图 3。
2.4 AKG对BDL小鼠肝脏组织学的影响
肝组织HE染色结果显示(图 4A),Sham组可见一定数量的肝细胞和细胞核结构,肝小叶结构清晰,无炎性细胞浸润,而BDL组中肝细胞肿胀且排列紊乱,可见大量炎性细胞浸润,肝细胞散在变性、坏死,胆管增生,部分肝小叶中可见淤积的红细胞。与BDL组相比,BDL+AKG组小鼠肝细胞坏死及炎性细胞浸润情况明显减轻,胆汁性损伤面积明显减少(P<0.01,图 4B)。
2.5 AKG对BDL小鼠肝脏炎症反应的影响
免疫组化结果显示(图 5),与BDL组相比,补充AKG可明显减少巨噬细胞标记物F4/80以及中性粒细胞标记物MPO的表达,减轻BDL诱导的炎症细胞浸润,表明AKG对BDL诱导的肝脏炎症具有抑制作用。
2.6 AKG对BDL小鼠肝脏炎症因子基因表达水平的影响
为了研究AKG是否具有抗炎作用,通过实时荧光定量PCR检测肝组织中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平。结果显示(图 6),BDL组小鼠肝组织IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1 mRNA水平较Sham组显著上调(P<0.01);与BDL组比较,BDL+AKG组上述促炎细胞因子mRNA水平明显下调(P<0.05),说明AKG能抑制炎症因子基因表达水平。
2.7 AKG对BDL小鼠肝细胞凋亡的影响
Sham组及Sham+AKG组之间仅有极少量棕黄色TUNEL阳性细胞,BDL组中TUNEL阳性细胞数量显著增加(P<0.05),而BDL+AKG组其数量明显少于BDL组(P<0.01)。结果表明,AKG使BDL诱导的胆汁淤积模型的肝细胞凋亡情况有所缓解。见图 7。
3 讨论
胆汁淤积性肝损伤是由于胆汁从肝脏到小肠的自然流出道受损,胆汁形成、分泌或排泄障碍,有毒的胆汁酸在肝脏内蓄积,从而导致炎症、细胞凋亡、纤维化,最终进展为肝硬化甚至肝癌。胆汁淤积可由多种不同的原发病因引起,也可以是许多慢性肝病的继发病变。成人胆汁淤积的主要病因是原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)。治疗PBC的药物仅限于熊去氧胆酸(UDCA),以及最近获得作为二线药物许可的奥贝胆酸(OCA)。尽管如此,仍有部分患者对药物治疗无反应;而对于PSC而言,目前尚无有效的治疗药物。因此,寻找治疗胆汁淤积性肝病的新型药物显得非常重要。
随着对胆汁淤积性肝病治疗的需求越来越高,利用动物模型来进行肝病的相关研究已十分广泛。啮齿动物的胆管结扎是研究胆汁淤积性肝病的经典实验模型[19-20]。小鼠胆管结扎后,由于胆汁不能正常分泌至十二指肠,胆汁的有害成分大量蓄积在肝组织中并反流入血,造成黄疸和机体损伤,类似于人类胆汁淤积症的病理生理过程[21]。本实验对小鼠胆总管结扎,肝脏明显充血肿胀,表面出现白色结节欠光泽,胆囊肿大呈墨绿色,肝脏指数明显增加,肝脏病理及血生化均提示肝功能异常,表明造模成功。
胆汁酸的蓄积是各种胆汁淤积性肝损伤的重要起始因素,其中肝细胞和胆管上皮细胞都是毒性胆汁酸的损伤靶点。在本实验中,BDL组小鼠的肝脏组织病理学检查可见明显的胆汁性梗死灶及汇管区大量炎性细胞浸润,以及ALT、AST、ALP、TBIL、TBA和ALP的升高,均提示胆汁淤积,肝功能明显异常;给予AKG后肝脏组织学损伤有所减轻,血清生化指标明显下降,说明AKG能减轻胆汁淤积导致的肝细胞炎症损伤。
近年来,以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润在胆汁淤积性肝损伤中的作用日益受到关注。有毒的胆汁酸损伤胆管细胞和肝细胞,并通过募集大量的中性粒细胞产生活性氧,引发肝脏的炎症反应,从而加重胆汁淤积和肝坏死[22]。通过抑制中性粒细胞的浸润可明显减轻胆汁酸对肝脏细胞的损伤。MPO主要存在于中性粒细胞等髓系细胞中,是中性粒细胞特异性标志分子。外部刺激可导致中性粒细胞聚集并释放MPO。MPO不仅能杀灭吞噬侵入机体的微生物,还能破坏机体的正常组织[23]。免疫组化实验显示,BDL小鼠肝脏中MPO阳性细胞数目明显增多,而AKG可显著减少MPO的表达。同时,研究发现毒性胆汁酸对肝实质细胞造成的损害往往由巨噬细胞激活引起。肝脏巨噬细胞激活后,能发挥调节炎症细胞、缓解组织损伤及细胞杀伤等作用。本实验结果提示AKG能抑制巨噬细胞标志物F4/80的表达。此外,qRT-PCR结果显示,AKG显著降低了炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达水平,说明AKG可以通过抑制BDL诱导的炎性细胞聚集、活化,减少促炎细胞因子的过度产生,防止炎症级联放大反应的发生,从而缓解胆汁淤积小鼠的肝脏炎症和肝细胞损伤。
胆汁酸在胆固醇分泌、脂肪吸收、胆固醇胆结石生成等生理过程中发挥重要作用[24]。然而,胆汁酸在肝细胞内的积累也可以导致细胞膜破坏、炎性坏死以及细胞凋亡等一系列组织损害[25]。研究表明,肝细胞内胆汁酸积累导致的细胞凋亡对胆汁淤积过程中肝损伤的进展至关重要[26-27]。细胞凋亡,即细胞的有序死亡,受多种调节分子的控制。过去认为细胞凋亡是胆汁酸介导的肝损伤[28],同时炎症反应也可通过诱导细胞凋亡进一步加重肝损伤[29]。肝脏组织的TUNEL染色提示,AKG处理后肝组织内TUNEL阳性凋亡细胞数目明显减少,说明AKG对BDL诱导的胆汁淤积性肝损伤的缓解作用可能与其抗细胞凋亡有关。
综上所述,本研究建立了模拟临床状态胆汁淤积性肝病的小鼠模型,初步观察了AKG对胆汁淤积性肝损伤的缓解作用,结果表明其可通过抑制炎症反应和减少肝细胞凋亡来减轻胆管结扎诱导的肝损伤,为临床上有效治疗胆汁淤积性肝病提供新的分子靶点和治疗策略。
[1] |
WILLIAMS R. Global challenges in liver disease[J]. Hepatology, 2006, 44(3): 521-526. |
[2] |
DE OLIVEIRA COSTA E L, DE AZEVEDO G M Jr, PETROIANU A. Morphological changes in the liver and kidneys of rats subjected to terminal ileum exclusion during obstructive cholestasis[J]. Acta Cir Bras, 2014, 29(6): 353-358. |
[3] |
LIN T K, HUANG L T, HUANG Y H, et al. The effect of the red wine polyphenol resveratrol on a rat model of biliary obstructed cholestasis: involvement of anti-apoptotic signalling, mitochondrial biogenesis and the induction of autophagy[J]. Apoptosis, 2012, 17(8): 871-879. |
[4] |
BEUERS U, TRAUNER M, JANSEN P, et al. New paradigms in the treatment of hepatic cholestasis: from UDCA to FXR, PXR and beyond[J]. J Hepatol, 2015, 62(1 Suppl): S25-S37. |
[5] |
ALABRABA E, NIGHTINGALE P, GUNSON B, et al. A re-evaluation of the risk factors for the recurrence of primary sclerosing cholangitis in liver allografts[J]. Liver Transpl, 2009, 15(3): 330-340. |
[6] |
MEHRA L, RAWAT H, JAIMINI A, et al. Alpha-ketoglutarate mediated hepatoprotection against alcohol induced toxicity: in vivo functional observation studies in Sprague Dawley rats using gamma scintigraphy[J]. Drug Chem Toxicol, 2020, 43(5): 546-551. |
[7] |
BAYLIAK M M, LUSHCHAK V I. Pleiotropic effects of alpha-ketoglutarate as a potential anti-ageing agent[J]. Ageing Res Rev, 2021, 66: 101237. |
[8] |
NIEMIEC T, SIKORSKA J, HARRISON A, et al. Alpha-ketoglutarate stabilizes redox homeostasis and improves arterial elasticity in aged mice[J]. J Physiol Pharmacol, 2011, 62(1): 37-43. |
[9] |
KOVALENKO T N, USHAKOVA G A, OSADCHENKO I, et al. The neuroprotective effect of 2-oxoglutarate in the experimental ischemia of hippocampus[J]. J Physiol Pharmacol, 2011, 62(2): 239-246. |
[10] |
DAKSHAYANI K B, SUBRAMANIAN P, MANIVASAGAM T, et al. Metabolic normalization of alpha-ketoglutarate against N-nitrosodiethylamine-induced hepatocarcinogenesis in rats[J]. Fundam Clin Pharmacol, 2006, 20(5): 477-480. |
[11] |
LONG L, HALLIWELL B. Artefacts in cell culture: α-ketoglutarate can scavenge hydrogen peroxide generated by ascorbate and epigallocatechin gallate in cell culture media[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 406(1): 20-24. |
[12] |
ZHAO J J, PENG L, CUI R B, et al. Dimethyl α-ketoglutarate reduces CCl4-induced liver fibrosis through inhibition of autophagy in hepatic stellate cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 481(1/2): 90-96. |
[13] |
TULSAWANI R K, DEBNATH M, PANT S C, et al. Effect of sub-acute oral cyanide administration in rats: protective efficacy of alpha-ketoglutarate and sodium thiosulfate[J]. Chem Biol Interact, 2005, 156(1): 1-12. |
[14] |
WANG L, HOU Y Q, YI D, et al. Dietary supplementation with glutamate precursor α-ketoglutarate attenuates lipopolysaccharide-induced liver injury in young pigs[J]. Amino Acids, 2015, 47(7): 1309-1318. |
[15] |
GYANWALI B, LIM Z X, SOH J, et al. Alpha-ketoglutarate dietary supplementation to improve health in humans[J]. Trends Endocrinol Metab, 2022, 33(2): 136-146. |
[16] |
PERNA S, ALALWAN T A, ALAALI Z, et al. The role of glutamine in the complex interaction between gut microbiota and health: a narrative review[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(20): 5232. |
[17] |
ASADI SHAHMIRZADI A, EDGAR D, LIAO C Y, et al. Alpha-ketoglutarate, an endogenous metabolite, extends lifespan and compresses morbidity in aging mice[J]. Cell Metab, 2020, 32(3): 447-456. |
[18] |
SHARAWY M H, ABDEL-RAHMAN N, MEGAHED N, et al. Paclitaxel alleviates liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats: role of TGF-β1, IL-10 and c-Myc[J]. Life Sci, 2018, 211: 245-251. |
[19] |
GEORGIEV P, JOCHUM W, HEINRICH S, et al. Characterization of time-related changes after experimental bile duct ligation[J]. Br J Surg, 2008, 95(5): 646-656. |
[20] |
HEINRICH S, GEORGIEV P, WEBER A, et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis[J]. Surgery, 2011, 149(3): 445-451. |
[21] |
ABSHAGEN K, KÖNIG M, HOPPE A, et al. Pathobiochemical signatures of cholestatic liver disease in bile duct ligated mice[J]. BMC Syst Biol, 2015, 9: 83. |
[22] |
CAI S Y, OUYANG X S, CHEN Y L, et al. Bile acids initiate cholestatic liver injury by triggering a hepatocyte-specific inflammatory response[J]. JCI Insight, 2017, 2(5): e90780. |
[23] |
SEN A L, OZKAN S, RECEBOVA K, et al. Effects of myrtus communis extract treatment in bile duct ligated rats[J]. J Surg Res, 2016, 205(2): 359-367. |
[24] |
WU J S, LI Y F, LI Y Y, et al. Huangqi Decoction alleviates alpha-naphthylisothiocyanate induced intrahepatic cholestasis by reversing disordered bile acid and glutathione homeostasis in mice[J]. Front Pharmacol, 2017, 8: 938. |
[25] |
WU J S, FANG S, LI W K, et al. Metabolomics research on the hepatoprotective effect of cultured bear bile powder in α-naphthylisothiocyanate-induced cholestatic mice[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2020, 1153: 122269. |
[26] |
GUICCIARDI M E, MALHI H, MOTT J L, et al. Apoptosis and necrosis in the liver[J]. Compr Physiol, 2013, 3(2): 977-1010. |
[27] |
OGAWA A, TAGAWA T, NISHIMURA H, et al. Toll-like receptors 2 and 4 are differentially involved in Fas dependent apoptosis in Peyer's patch and the liver at an early stage after bile duct ligation in mice[J]. Gut, 2006, 55(1): 105-113. |
[28] |
ZHOU H Q, LIU W, WANG J, et al. Paeoniflorin attenuates ANIT-induced cholestasis by inhibiting apoptosis in vivo via mitochondria-dependent pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 89: 696-704. |
[29] |
HAN Y, LUO H N, WANG H, et al. SIRT1 induces resistance to apoptosis in human granulosa cells by activating the ERK pathway and inhibiting NF-κB signaling with anti-inflammatory functions[J]. Apoptosis, 2017, 22(10): 1260-1272. |