2. 401147 重庆,中国科学院大学重庆医院(重庆市人民医院)妇产科
2. Department of Gynecology and Obstetrics, Chongqing Hospital of University of Chinese Academy of Sciences (Chongqing General Hospital), Chongqing, 401147, China
孕酮促进子宫肌层松弛,大多数哺乳动物临产时血浆孕酮(P4)水平急剧下降;但人类血浆P4水平随妊娠进展增加,妊娠临产后,子宫平滑肌收缩,血浆P4水平无下降,推测P4发生功能性撤退导致分娩启动,为临产重要机制之一[1-2]。分娩启动的关键是子宫平滑肌从松弛状态转变到强有力的收缩状态,平滑肌发生收缩的细胞内机制包括钙依赖途径,在钙依赖途径中平滑肌细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)是调控平滑肌收缩的重要分子,平滑肌肌球蛋白轻链20磷酸化(phosphorylation of myosin light chain 20, p-MLC20)水平上升,促进细胞内[Ca2+]i增加,是平滑肌收缩的关键步骤[3]。已有研究表明孕酮可以快速增加细胞内[Ca2+]i,促进子宫平滑肌细胞收缩[4-5]。
除细胞外Ca2+通过钙通道内流引起细胞内Ca2+的浓度升高外,多种信号通路的激活引起细胞内肌浆网Ca2+释放是子宫平滑肌收缩的关键,其中最受关注的是与G蛋白偶联受体激活相关的信号通路。KARTERIS等[1]报道孕酮可以通过MAPK/P38信号通路参与子宫平滑肌收缩,该过程不依赖于细胞核内基因转录和蛋白翻译,称为孕酮的非基因组效应。多项研究证实RhoA/ROCK信号通路在血管平滑肌收缩中发挥重要作用[6-7]。国内有学者报道临产时子宫平滑肌组织中ROCK蛋白表达高于未临产组织[6]。目前关于RhoA/ROCK信号通路参与子宫平滑肌细胞收缩的分子机制尚未探明。本研究以子宫平滑肌细胞为研究对象,探讨孕酮通过RhoA/ROCK信号通路促进子宫平滑肌细胞收缩的分子机制,为了解分娩启动机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 组织取材选择2020年10月至2021年4月入住陆军军医大学第一附属医院妇产科的低危足月龄临产孕妇(临产组,n=5)和足月龄未临产孕妇(未临产组,n=5)。临产定义参照第9版《妇产科学》:有规律且逐渐增强的子宫收缩,同时伴进行性宫颈管扩张和胎先露部下降;妊娠足月的定义为:孕周≥37周。本研究已通过陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准(KY201987),研究对象签署知情同意书。获取剖宫产术中需修剪废弃的子宫切口平滑肌组织,分成3份,大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,分别置入灭菌预冷、含双倍青霉素-链霉素溶液的PBS中,取材后3 h内,采用液氮速冻及甲醛固定制备组织切片,分离培养子宫平滑肌细胞。
1.1.2 主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司;ROCK抑制剂(Y-27632)、孕酮(P4)、米非司酮(Mifepristone,M)购自Selleck公司;5×Loading buffer、青霉素-链霉素溶液(penicillin-streptomycin solution, 100×;PS)、Fura-2AM(2mmol/L)钙离子荧光探针购自碧云天生物技术有限公司;蛋白电泳凝胶试剂盒购自深圳市达科为生物工程公司;α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体购自美国Abcam公司;p-MLC20抗体购自美国CST公司;ROCK1、ROCK2、Tubulin购自武汉Proteintech公司;辣根过氧化酶标记的抗兔、抗鼠二抗购自美国Bioword公司。
1.2 方法 1.2.1 Western blot检测子宫平滑肌组织p-MLC20、ROCK1、ROCK2表达根据样品量提前配制RIPA裂解液,加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,冰上保存备用;取0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm大小组织,液氮速冻,放入研钵中碾碎后,转移至1.5 mL EP管中,加200 μL RIPA震荡混匀、超声波粉碎,冰上裂解30 min;离心机预冷,4 ℃,12 000 r/min离心15 min;取上清,即为总蛋白;通过BCA法测定蛋白浓度,将所有样品调整至相同浓度,以蛋白∶5×loading buffer为4 ∶1的比例制样,金属浴中100 ℃煮10 min,-80 ℃保存备用。制备好的蛋白样品总上样量20 μg,根据浓度计算上样体积。配制10%分离胶,上样,80 V,30 min,130 V,40 min电泳分离总蛋白样品,2.0 A,25 V半干转将检测蛋白转印至PVDF膜上,5%胎牛血清蛋白(5% BSA)室温封闭2 h,4 ℃孵育一抗过夜(p-MLC20、ROCK1、ROCK2稀释比例均为1 ∶1 000);TBST洗膜3次,每次5 min,室温孵育二抗(1 ∶5 000), TBST洗膜3次,每次5 min,ECL显影液显影,使用Image Lab分析条带灰度值。
1.2.2 免疫组化(IHC)检测子宫平滑肌组织ROCK1、ROCK2、p-MLC20表达取临产组及未临组产各2例平滑肌组织,处理、切片由陆军军医大学第一附属医院病理科完成。将组织切片进行脱蜡,柠檬酸缓冲液抗原修复,山羊血清室温封闭2 h,一抗ROCK1(1 ∶200)、ROCK2(1 ∶200)、p-MLC20(1 ∶50)孵育过夜,室温孵育二抗(生物素标记山羊抗兔)30 min,PBS清洗3次,滴加辣根酶标记链霉卵白素,室温孵育20 min,PBS洗3次,进行DAB显色,在显微镜下观察,待组织切片开始显现浅棕色时洗去显色液,苏木精复染,自来水冲洗10 min,树胶封片、风干,显微镜采集图片并进行定量分析。
1.2.3 子宫平滑肌细胞的分离培养用含1%PS的PBS清洗干净新鲜子宫平滑肌组织血迹后,在培养皿中用眼科剪将组织剪碎、加8 mL基础培养基(含1%PS),转移至15 mL离心管,加胶原酶Ⅱ(2 mg/mL),37 ℃摇床摇晃消化30 min后,第1次用70 mm过滤筛过滤,剩余组织加胶原酶Ⅱ(2 mg/mL)继续消化,30 min后再次过滤。两次收集的滤液1 000 r/min离心5 min,沉淀即为细胞,加2 mL完全培养基(含1%PS和20%FBS)重悬细胞沉淀,接种于6孔板中,在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后,观察到有贴壁细胞,于48 h时细胞完全贴壁后换液,之后2~3 d更换1次培养液。
1.2.4 免疫荧光鉴定子宫平滑肌细胞在24孔板中提前铺细胞爬片,平滑肌细胞生长至对数生长期后,取2×105个细胞铺24孔板,增殖至密度约50%~60%时,取出24孔板,预冷PBS清洗2次,每孔加4%多聚甲醛固定20 min,PBS清洗3次,每次5 min;0.5% Triton X-100室温通透20 min,PBS清洗3次,每次5 min;5%BSA室温封闭30 min,去除封闭液,4 ℃孵育一抗过夜(α-SMA,根据说明书稀释);取出24孔板,PBS清洗3次,每次5 min,室温孵育FITC标记荧光二抗(1 ∶800)2 h,避光操作,PBS清洗3次,每次5 min;DAPI稀释1 000倍后,室温避光染核5 min,PBS洗清3次,每次5 min;在载玻片上加抗荧光猝灭剂,从24孔板中取出细胞爬片,倒置于载玻片上,荧光显微镜拍照采集图片。
1.2.5 细胞传代及分组子宫平滑肌细胞生长至80%~90%密度后,弃去培养基,PBS清洗细胞2次,加0.25%胰蛋白酶消化细胞,室温放2 min后,弃去胰蛋白酶,加4 mL完全培养基终止消化,将细胞吹打成单细胞悬液并转移至15 mL离心管中,1 000 r/min离心5 min,弃上清,加完全培养基重悬细胞沉淀,以1 ∶3比例传代,在37 ℃、5%CO2条件下培养。
文献[1]报道外源性孕酮(P4 100 nmol/L)诱导培养的子宫平滑肌细胞收缩(15 min后可检测到细胞内p-MLC20水平明显升高),可模拟分娩时子宫平滑肌收缩状态,因此将其作为本实验研究模型。将培养的子宫平滑肌细胞分为3组:对照组、孕酮组(加孕酮100 nmol/L)、孕酮+米非司酮组(米非司酮100 μmol/L干预4 h后加用孕酮100 nmol/L,米非司酮为孕酮核受体拮抗剂),15 min后收集各组细胞蛋白样品。
为研究孕酮通过RhoA/ROCK信号通路促进子宫平滑肌收缩的机制,将培养的子宫平滑肌细胞分为3组:对照组、孕酮组(100 nmol/L)、孕酮+ ROCK抑制剂组(ROCK抑制剂Y-27632 200 nmol/L干预24 h后,加用孕酮100 nmol/L),15 min后收集各组细胞蛋白样品。
1.2.6 细胞蛋白提取与Western blot检测根据实验需要处理子宫平滑肌细胞后,预冷PBS清洗2次,根据细胞密度每孔加入100~150 μL RIPA,用细胞刮收取细胞,转移至1.5 mL EP管中,冰上裂解30 min;离心机预冷,4 ℃,12 000 r/min离心15 min;取上清,即为总蛋白;通过BCA法测定蛋白浓度,将所有样品调整至相同浓度,以蛋白∶5×loading buffer为4 ∶1的比例制样,金属浴中100 ℃煮10 min,-80 ℃保存备用。Western blot检测ROCK1(1 ∶1 000)、ROCK2(1 ∶1 000)、p-MLC20(1 ∶1 000)蛋白表达(操作同1.2.1)。
1.2.7 子宫平滑肌细胞内Ca2+浓度检测在24孔板中铺细胞贴壁后,根据实验需要处理分组,进行Ca2+检测。取出24孔板,PBS清洗1次,将Fura-2 AM ∶PBS(含2%FBS)以1 ∶400比例稀释,37 ℃孵育1 h,PBS清洗1次,DAPI稀释1 000倍后,室温避光染核5 min,PBS清洗3次,在载玻片上加抗荧光猝灭剂,从24孔板中取出细胞爬片,倒置于载玻片上,立即进行激光共聚焦显微镜拍照,采集图片,核定位(即DAPI,蓝色荧光)图片采集时间为150 ms,[Ca2+]i(绿色荧光)信号采集时间为3 s。
1.3 统计学分析采用GraphPad 5.0统计软件,数据以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。实验均进行3次独立重复。
2 结果 2.1 临产子宫平滑肌组织中p-MLC20表达升高临产子宫平滑肌组织中p-MLC20表达显著高于未临产组(P < 0.05,图 1)。
2.2 子宫平滑肌细胞的鉴定及两组子宫平滑肌细胞内[Ca2+]i的测定
分离所得的子宫平滑肌细胞呈圆形或椭圆形、透亮,24 h后有少量细胞贴壁,48 h后细胞基本完全贴壁,细胞呈长梭形,不规则排列,72 h细胞开始增殖。采用免疫荧光检测培养的子宫平滑肌细胞中平滑肌细胞标志蛋白α-SMA的表达。结果显示:在临产及未临产组子宫平滑肌细胞中均可检测α-SMA蛋白(图 2A绿色荧光),且在临产组细胞内观察到明显肌丝聚集(图 2A箭头所示),证明分离的细胞为平滑肌细胞。
[Ca2+]i是调控平滑肌收缩的重要分子。分别检测临产组与未临产组子宫平滑肌细胞中[Ca2+]i。激光共聚焦显微镜检测结果显示:临产组细胞中[Ca2+]i显著高于未临产组细胞(P < 0.05,图 2B、C),表明分离培养的子宫平滑肌细胞具有子宫平滑肌收缩的特征。
2.3 孕酮诱导子宫平滑肌细胞收缩Western blot检测对照组、孕酮组(100 nmol/L)、孕酮+米非司酮组(米非司酮100 μmol/L+孕酮100 nmol/L)子宫平滑肌细胞内p-MLC20的表达,结果显示:孕酮组及孕酮+米非司酮组细胞内p-MLC20表达明显高于对照组(P < 0.05),孕酮组与孕酮+米非司酮组间比较差异无统计学意义(图 3)。提示孕酮可快速诱导子宫平滑肌细胞收缩。
2.4 孕酮可能通过RhoA/ROCK信号通路诱导子宫平滑肌细胞收缩
Western blot及免疫组化检测ROCK蛋白的两种亚型ROCK1、ROCK2及p-MLC20在临产组和未临产子宫平滑肌组织中的表达,结果显示:ROCK1、ROCK2、p-MLC20在临产组中显著高表达(P < 0.05,图 4A~E)。
Western blot检测对照组、孕酮组、孕酮+米非司酮组子宫平滑肌细胞内ROCK1、ROCK2的表达。结果显示:孕酮组与孕酮+米非司酮组ROCK1、ROCK2表达显著高于对照组(P < 0.05),孕酮组与孕酮+米非司酮组间比较差异无统计学意义(图 4F、G)。表明ROCK蛋白在子宫平滑肌收缩过程中起重要作用,孕酮可能通过RhoA/ROCK信号通路诱导子宫平滑肌细胞收缩。
2.5 孕酮通过RhoA/ROCK信号通路促进子宫平滑肌收缩的机制Western blot检测对照组、孕酮组(孕酮100 nmol/L)、孕酮+ROCK抑制剂组(ROCK抑制剂Y-27632 200 nmol/L干预24 h后加用孕酮100 nmol/L)子宫平滑肌细胞中p-MLC20的表达。结果显示:孕酮组p-MLC20表达明显高于对照组(P < 0.05),孕酮+ROCK抑制剂组p-MLC20表达水平明显低于孕酮组(P < 0.05,图 5)。表明孕酮诱导的子宫平滑肌收缩能被ROCK抑制剂Y-27632抑制,孕酮可通过RhoA/ROCK信号通路促进子宫平滑肌收缩。
3 讨论
分娩启动原因复杂,机制不明。调控分娩启动的分子机制包括炎症诱发机制、内分泌学说、钙敏感机制等[8]。对分娩启动的临床、基础研究发现:足月临产或早产分娩启动存在多因素-多机制的复杂体系,但最终均诱发子宫平滑肌收缩,胎儿娩出。早产是妊娠期的常见并发症,全球早产发病率为6.2%~11.9%,是新生儿死亡、致残的主要原因[9-10]。目前早产分娩启动机制不明,尚无有效药物预防和治疗。研究子宫平滑肌的收缩与舒张机制对防治早产具有重要意义。
Ca2+是细胞内普遍存在的二级信使,负责调控关键过程,包括细胞增殖、神经信号传导和细胞收缩等[11-12]。平滑肌细胞内[Ca2+]i和肌球蛋白轻链磷酸化水平的改变是导致各器官和组织平滑肌细胞收缩的关键因素[13-14]。平滑肌细胞在激动剂刺激下,细胞内[Ca2+]i上升,与钙调蛋白结合,激活肌球蛋白轻链激酶使MLC20磷酸化,平滑肌细胞收缩。平滑肌细胞收缩的前提是细胞骨架发生变化,肌细胞中的细肌丝、粗肌丝、中间丝等各自发挥其功能,相互作用,促进子宫平滑肌收缩[15-16]。本研究在临产组子宫平滑肌组织及培养的子宫平滑肌细胞检测出p-MLC20表达升高,[Ca2+]i明显升高,并且在临产组子宫平滑肌细胞中观察到明显肌丝聚集,说明p-MLC20水平上升和[Ca2+]i可以作为平滑肌细胞收缩的代表性指标。
研究表明孕酮所属的甾体类激素可在数秒内激活某些跨膜信号传导通路,或者数分钟内激活环核苷酸和/或蛋白激酶而产生快速生物学效应;孕酮快速增加细胞内[Ca2+]i,促进分娩启动后子宫平滑肌收缩且不受转录抑制物抑制,该效应称为孕酮的非基因组效应[17]。研究报道体外培养的子宫平滑肌细胞加入与牛血清蛋白偶联的孕酮(孕酮不能与核受体结合),15 min后在细胞内检测到p-MLC20水平明显升高,证实孕酮在体外可快速诱导子宫平滑肌细胞收缩[1]。本研究采用孕酮核受体抑制剂米非司酮干预培养的子宫平滑肌细胞,再加用孕酮干预15 min后,在细胞内检测到p-MLC20水平明显升高,证实孕酮在体外可诱导子宫平滑肌细胞收缩(图 3)。
MLC20的磷酸化水平除受肌球蛋白轻链激酶调节外,还受Ca2+非依赖的肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin- light-chain phosphatase,MLCP)调节,抑制MLCP可以进一步增强MLC磷酸化和平滑肌收缩,增加收缩对Ca2+的敏感性,称为“钙敏化”[18-19]。RhoA/ROCK信号传导通路是子宫平滑肌细胞钙敏化的主要调节因素,ROCK有两种异构体: ROCK1和ROCK2[20]。本研究结果显示:临产子宫平滑肌组织中ROCK1、ROCK2蛋白表达显著上升;孕酮干预培养的子宫平滑肌细胞,可检测到p-MLC20水平快速上升,同时ROCK1、ROCK2蛋白表达增加(图 4),表明分娩启动时孕酮在通过RhoA/ROCK信号通路促进子宫平滑肌收缩过程中同时发挥基因组和非基因组作用。
Y-27632是合成的ROCK特异性抑制剂, 能够抑制ROCK介导的多种生物效应, 其中包括平滑肌收缩。目前已经发现ROCK在多种器官的平滑肌组织收缩中起作用。研究表明ROCK在气管平滑肌细胞中磷酸化MLCP的MYPT1亚基,抑制其活性并维持平滑肌收缩[19];RhoA/ROCK信号通路诱导MLC20磷酸化水平升高,导致血管平滑肌收缩[20];ROCK蛋白在临产的子宫平滑肌组织中高表达[21],但相关信号通路的细胞机制不明。本研究证实孕酮可激活RhoA/ROCK信号通路,促进子宫平滑肌细胞收缩,加入ROCK抑制剂Y-27632后,细胞内p-MLC20水平明显下降(图 5),推测Y-27632可通过抑制ROCK影响子宫平滑肌收缩;提示RhoA/ROCK信号通路与分娩启动相关,可为精准诊治早产临产提供参考。
早产是产科医生面临的难题之一。妊娠子宫收缩导致早产分娩的确切触发机制尚不明确。本研究通过信号转导通路研究早产分娩启动的机制,验证了RhoA/ROCK信号通路参与早产分娩启动的分子机制,期望为今后能够精准防治早产提供理论依据。妊娠临产、子宫平滑肌收缩存在孕激素非基因组和基因组效应共同作用。本研究样本量有限,未进行大量组织样本验证,细胞间可能存在个体差异,且尚未深入研究该通路的上下游调节机制。此外,分娩启动时孕酮是否还有其他作用途径及分子机制,在临床上是否能通过阻断这些快速反应机制来防治早产有待进一步研究。
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