2. 400016 重庆，中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室;
3. 400016 重庆，重庆医科大学:中医药学院
2. Chongqing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Cure of Metabolic Diseases, Chongqing, 400016, China;
3. College of Traditional Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
老龄化是全球人口发展的普遍趋势，也是当前我国面临的重大挑战[1]。与此同时，衰老相关的疾病受到越来越多关注，特别是代谢综合征[2](metabolic syndrome，MS)，一种以肥胖、糖代谢异常、质代谢紊乱等为临床反应的症候群，会增加糖尿病、心血管疾病、中风和某些癌症的发病风险。随着近代工业化发展，以高果糖和高果糖玉米糖浆为主要成分的食品越来越多，可能是导致代谢综合征在人群中流行的原因之一[3]。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)被普遍认为是MS发生的主要机制[4]。骨骼肌是胰岛素作用的主要靶组织之一[5]，有研究指出，骨骼肌异位脂质沉积在IR中起重要作用[6]。因此，研究改善骨骼肌异位脂质沉积对改善IR有重要意义。
6-姜辣素是传统中药材、经典药食同源植物生姜的主要活性成分之一。中医认为生姜性辛、微温，归肺、脾、胃经，具有调理肺胃功能、促进津液运行输布的作用。现代西医认为，其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、改善IR等生物学活性的作用[7]。本课题组前期结果证实，姜提取物改善果糖所致大鼠脂肪肝[8]，生姜提取物能够改善高果糖饮食大鼠骨骼肌胰岛素敏感性[9]，6-姜辣素能够改善老年大鼠骨骼肌异位脂质沉积[10]，但6-姜辣素对果糖诱导的中年大鼠骨骼肌异位脂质沉积的作用及机制尚不明确。本研究将结合体内和体外实验，探究6-姜辣素对果糖所致中年大鼠骨骼肌异位脂质沉积的作用及机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物和细胞SPF级Sprague-Dawley大鼠24只，雄性，15月龄，购自重庆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(渝)2018-0003。采用分笼饲养方式，置于温度(21±1)℃，相对湿度(55±5)%环境中，12 h明暗交替，自由饮水。所有操作按照《医学实验动物管理实施细则》要求，符合动物福利与伦理原则，适应性饲养1周后开始实验。L6大鼠成肌细胞购于上海吉凯基因。
1.2 主要试剂6-姜辣素(用于动物实验，日本Pharmafood研究所馈赠)；6-姜辣素(用于细胞实验，上海源叶生物)；阿拉伯胶(上海生工)；甘油三酯测定试剂盒(南京建成)；葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物)；大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒(泉州九邦生物)；油红O粉末(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物)；青霉素+链霉素双抗、0.25%胰酶消化液(上海碧云天生物)；D-果糖(美国Sigma公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、5X蛋白上样缓冲液、RIPA细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物)；AMPK抗体、p-AMPK抗体、ACC抗体、p-ACC抗体(美国CST公司)；CPT1A抗体、PPARα抗体、PGC1α抗体(美国Abcam公司)；α-Tubulin抗体、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物)。
1.3 主要仪器设备超净水系统(德国Sartorius公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；-80 ℃冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey® Fc双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)；细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；显微摄影装置(日本Nikon公司)。
1.4 动物分组及给药将24只15月龄雄性SD大鼠适应性喂养1周后采用随机数字表法分为3组：对照组(CON，正常饮水)，模型组(FRU，10%果糖水)，6-姜辣素组(GIN，10%果糖水，0.2 mg/kg姜辣素)，每组8只，各组均给予大鼠普通维持饲料。6-姜辣素由5%阿拉伯胶混悬液配制而成。本课题组前期研究表明，0.2 mg/kg姜辣素浓度为最佳灌胃剂量[10-11]，因此本实验中6-姜辣素组使用0.2 mg/kg姜辣素灌胃，对照组和模型组给予相应体积的5%阿拉伯胶混悬液灌胃，每日灌胃1次，持续49 d。实验过程中记录大鼠摄食量、果糖摄入量及体质量变化，实验结束称定各组织质量并记录。
1.5 生化指标检测实验第7周末禁食12 h后处死所有大鼠，收集血浆，按试剂盒说明检测血浆GLU、TG及Insulin水平。计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，公式：HOMA-IR= FBG(空腹血糖水平，mmol/L) × FINS(空腹胰岛素水平，mIU/L) /22.5。
1.6 骨骼肌TG测定及油红O染色取骨骼肌组织80 mg，剪碎，按比例(组织∶异丙醇=50 mg ∶1 mL)加入异丙醇，匀浆，4 ℃振荡过夜，离心取上清，按试剂盒说明测定TG含量。4%多聚甲醛固定骨骼肌组织，蔗糖梯度脱水，OCT包埋，冰切厚度约8 μm，油红O染色，60%异丙醇分化，苏木精复染，封片，观察并拍照。用Image J统计分析染色阳性区域面积。
1.7 Western blot检测骨骼肌相关蛋白表达取骨骼肌组织约50 mg，剪碎，加入RIPA裂解液，冰上匀浆、超声，离心取上清，BCA法测蛋白浓度，8%或10% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，冰水浴湿转，5% 脱脂牛奶常温封闭2 h，一抗(稀释比例1 ∶1 000) 4 ℃孵育过夜，TBST洗涤6次，每次5 min，二抗(稀释比例1 ∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗涤6次，每次5 min，ECL发光，Image J分析条带灰度值。目的条带的灰度值与相应内参(α-Tubulin)条带的灰度值比值，即为相应目的蛋白的相对表达量。
1.8 细胞培养、诱导分化及分组L6大鼠成肌细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中。用含2%马血清的完全培养基诱导L6成肌细胞分化3~4 d成为成熟的大鼠骨骼肌细胞。本课题组前期研究表明，10 μmol/L 6-姜辣素为最佳浓度[10]。将分化成熟的骨骼肌细胞用无血清培养基饥饿处理12 h后，分为对照组(CON)，模型组(FRU，25 mmol/L果糖)，6-姜辣素组(GIN，25 mmol/L果糖，10 μmol/L 6-姜辣素)，处理24 h。
1.9 细胞内TG测定及油红O染色用预冷PBS漂洗并收集细胞，加入裂解液，辅以超声裂解，按试剂盒说明测定细胞内TG，BCA法测定蛋白浓度以标准化细胞内TG。室温下PBS漂洗细胞，4%多聚甲醛固定，60%异丙醇预分化，油红O染色，苏木精复染，封片，观察并拍照。用Image J软件统计分析染色阳性区域面积。
1.10 Western blot检测L6大鼠骨骼肌细胞相关蛋白表达用预冷PBS漂洗细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，吹打收集细胞，辅以超声裂解，离心取上清，后续步骤同1.7 Western blot检测骨骼肌蛋白表达。
1.11 统计学方法用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，组间数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05被认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 6-姜辣素对大鼠一般情况的影响与CON组比较，FRU组和GIN素组平均每日摄食量均减少；FRU与GIN组平均每日摄食量和果糖摄入量无统计学差异。与CON组比较，FRU组与GIN组大鼠平均体质量呈时间依赖性增加。与CON组比较，FRU组大鼠第7周末平均体质量增加(P < 0.05)；与FRU组比较，GIN组大鼠第7周末平均体质量稍降低。与CON组比较，FRU组大鼠肝指数升高(P < 0.05)；与FRU组比较，GIN组大鼠肝指数降低(P < 0.05)。3组大鼠骨骼肌指数无明显差异。见图 1。
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| A：平均每日摄食量；B：平均每日果糖摄入量；C：平均体质量；D：第7周末大鼠的平均体质量；E：骨骼肌指数(大鼠骨骼肌与体质量之比)；F：肝指数(大鼠肝脏与体质量之比)；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 1 6-姜辣素对大鼠一般情况的影响 |
2.2 6-姜辣素对大鼠血浆生化指标的影响
与CON组比较，FRU组大鼠血浆GLU、TG、Insulin水平及HOMA-IR升高(P < 0.05)；与FRU组比较，GIN组大鼠血浆GLU、TG、Insulin水平及HOMA-IR降低(P < 0.05)。见图 2。
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| A：空腹血浆甘油三酯；B：空腹血浆葡萄糖；C：空腹血浆胰岛素水平；D：胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 2 6-姜辣素对大鼠血浆生化指标的影响 |
2.3 6-姜辣素对大鼠骨骼肌异位脂质沉积的影响
与CON组比较，FRU组大鼠骨骼肌TG含量和油红O染色阳性面积增加(P < 0.05)；与FRU组比较，GIN组大鼠骨骼肌TG含量和油红O染色阳性面积减少(P < 0.05)。见图 3。
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| A：大鼠骨骼肌油红O染色；B：骨骼肌油红O染色阳性区域面积统计；C：骨骼肌内甘油三酯水平；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 3 6-姜辣素对大鼠骨骼肌异位脂质沉积的影响 |
2.4 6-姜辣素对大鼠骨骼肌PPARα、PGC1α蛋白表达的影响
与CON组比较，FRU组PPARα、PGC1α蛋白表达降低(P < 0.05)。与FRU组比较，GIN组PPARα、PGC1α蛋白表达升高(P < 0.05)。见图 4。
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| A：骨骼肌PPARα、PGC1α蛋白表达水平；B：骨骼肌PPARα、PGC1α蛋白表达水平统计结果；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 4 6-姜辣素对大鼠骨骼肌PPARα、PGC1α蛋白表达的影响 |
2.5 6-姜辣素对大鼠骨骼肌AMPK/ACC/CPT1A通路蛋白表达的影响
与CON组比较，FRU组p-AMPK蛋白表达降低(P < 0.05)，AMPK蛋白表达无统计学差异，p-AMPK/AMPK降低，p-ACC蛋白表达降低，ACC蛋白表达升高，p-ACC/ACC降低，CPT1A蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与FRU组比较，GIN组p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)，AMPK蛋白表达差异无统计学意义，p-AMPK/AMPK升高，p-ACC蛋白表达升高，ACC蛋白表达降低，p-ACC/ACC升高，CPT1A蛋白表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 5。
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| A：骨骼肌相关蛋白表达水平；B：骨骼肌相关蛋白表达水平统计结果；C：骨骼肌AMPK蛋白磷酸化水平；D：骨骼肌ACC蛋白磷酸化水平；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 5 6-姜辣素对大鼠骨骼肌AMPK/ACC/CPT1A通路蛋白表达的影响 |
2.6 6-姜辣素对大鼠骨骼肌细胞脂质沉积的影响
与CON组比较，FRU组大鼠骨骼肌细胞内TG含量和油红O染色阳性面积增加(P < 0.05)，细胞核周围胞质内可见大量脂滴；与模型组比较，GIN组大鼠骨骼肌细胞内TG含量和油红O染色阳性面积减少(P < 0.05)，细胞核周围脂滴数量减少，体积缩小。见图 6。
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| A：大鼠骨骼肌细胞油红O染色；B：大鼠骨骼肌细胞油红O染色阳性区域面积统计；C：大鼠骨骼肌细胞甘油三酯水平；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 6 6-姜辣素对大鼠骨骼肌细胞脂质沉积的影响 |
2.7 6-姜辣素对大鼠骨骼肌细胞AMPK/ACC/CPT1A通路蛋白表达的影响
与CON组比较，FRU组p-AMPK蛋白表达降低(P < 0.05)，AMPK蛋白表达差异无统计学意义，p-AMPK/AMPK降低，p-ACC蛋白表达降低，ACC蛋白表达升高，p-ACC/ACC降低，CPT1A蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与FRU组比较，GIN组p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)，AMPK蛋白表达差异无统计学意义，p-AMPK/AMPK升高，p-ACC蛋白表达升高，ACC蛋白表达降低，p-ACC/ACC升高，CPT1A蛋白表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 7。
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| A：大鼠骨骼肌细胞相关蛋白表达水平；B：骨骼肌细胞相关蛋白表达水平统计结果；C：骨骼肌细胞AMPK蛋白磷酸化水平；D：骨骼肌细胞ACC蛋白磷酸化水平；a：P < 0.05，与FRU组比较 图 7 6-姜辣素对大鼠骨骼肌细胞AMPK/ACC/CPT1A通路蛋白表达的影响 |
3 讨论
有研究表明，IR下的骨骼肌线粒体存在氧化磷酸化和脂质氧化功能障碍，导致骨骼肌异位脂质沉积，而异位脂质沉积反过来又加剧了IR[12]。本研究采用果糖诱导建立IR动物模型研究6-姜辣素对大鼠骨骼肌异位脂质沉积的改善作用。结果证实，6-姜辣素可显著降低果糖所诱导中年大鼠血浆GLU、TG及Insulin水平，降低HOMA-IR，明显改善果糖所致中年大鼠骨骼肌异位脂质沉积。
过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ(PPARα)属于核受体家族的转录因子，研究表明，PPARα激活后，能够促进增强子中含有PPARα反应元件(PPRE)的基因的转录，其中最显著的是参与脂质代谢和能量稳态的基因[13-15]。许多脂肪酸是PPARα的天然配体，有研究表明，PPARα的活化能够加强对脂肪酸的氧化作用[16]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC1α)是一种转录共激活因子，主要参与线粒体合成功能和氧化磷酸化的调节[17]。同PPARα一样，PGC1α也主要在富含线粒体的组织中表达，并可以被腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)直接激活[18]。在本研究中，与对照组比较，模型组大鼠骨骼肌PPARα和PGC1α蛋白表达降低，而6-姜辣素干预后，其表达水平明显上升，提示6-姜辣素可能通过增强骨骼肌线粒体对脂肪酸的氧化来改善骨骼肌异位脂质沉积。本课题组前期研究表明，6-姜辣素能够改善老年大鼠骨骼肌异位脂质沉积和线粒体功能[10]。
AMPK是一种主能量传感器，它整合了营养物质、激素和压力信号，在维持细胞能量稳态中发挥重要作用[18]。多项研究表明，暴露于过量的营养物质会降低多种组织和细胞中AMPK的活性[19-21]。激活AMPK可抑制合成代谢途径和增强分解代谢途径来治疗肥胖和代谢紊乱[22]。骨骼肌AMPK的活化能够促进非人类灵长类动物和小鼠骨骼肌摄取及利用葡萄糖[23]。有研究表明，6-姜辣素可以促进小鼠脂肪细胞、骨骼肌细胞中AMPK的活化[24-25]。AMPK可通过调节下游乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)在调控脂质代谢中发挥作用。
ACC是脂肪酸从头合成和氧化过程中的一种关键酶，可催化乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)羧化形成丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)，后者是脂肪酸从头合成的重要原料，也能直接抑制CPT1A的活性[26]。哺乳动物中，ACC有ACC1和ACC2两种类型同工酶。啮齿动物中，ACC1主要在脂质生成组织中表达，如脂肪组织等；ACC2主要表达于以氧化功能为主的组织中，如骨骼肌和心肌等。虽然ACC两种同工酶的组织分布和功能不尽相同，但在功能上一定程度可以相互代偿。激活的AMPK通过使ACC磷酸化而抑制其活性，同时降低ACC的表达[27]，从而减少其催化产物Malonyl-CoA的产生，进而抑制脂肪酸的从头合成，并减轻对CPT1A的直接抑制作用。CPT1A是线粒体脂肪酸β-氧化过程的限速酶，它被Malonyl-CoA变构抑制，是维持脂肪酸代谢平衡的关键调节机制[28]。从药理学角度来讲，使用可以活化CPT1A酶的药物能够增加脂肪酸的氧化代谢，进而促进脂质的消耗。
综上，本研究通过果糖诱导中年大鼠IR模型，发现模型组大鼠骨骼肌AMPK和ACC蛋白磷酸化受抑制，CPT1A、PPARα及PGC1α等蛋白表达水平降低，而6-姜辣素能够激活AMPK促使其磷酸化，促进下游ACC磷酸化而抑制其活性，促进CPT1A、PPARα及PGC1α等蛋白的表达，改善骨骼肌异位脂质沉积。体外实验亦证明，6-姜辣素能激活AMPK/ACC/CPT1信号通路，改善果糖诱导的L6大鼠骨骼肌细胞脂质沉积。结合体内和体外实验，发现6-姜辣素可能是通过激活骨骼肌AMPK促使其磷酸化，促进下游ACC的磷酸化而抑制其活性，增加CPT1A活性，同时从抑制脂肪酸合成和促进脂肪酸氧化两方面改善骨骼肌脂质沉积。本研究结果表明，6-姜辣素可改善果糖所致中年大鼠骨骼肌异位脂质沉积，这可能与骨骼肌AMPK/ACC/CPT1A通路的激活有关。
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