2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)医学心理系军事认知心理学教研室
2. Department of Military Cognitive Psychology, Faculty of Medical Psychology, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
肝脏X受体(liver X receptor，LXR)包括LXRα和LXRβ两个受体亚型，是配体激活的转录因子[1-2]，其中LXRα主要表达于脂肪组织、肝脏和肠道，而LXRβ广泛表达于中枢神经系统[2]。海马齿状回内的放射状胶质细胞(radial glial cells, RGCs)一方面在生后及成年持续产生神经前体细胞和神经元，组成海马齿状回的神经前体细胞库，另一方面其由胞体伸出的长突起引导新生神经元的迁移而到达靶区，并促进颗粒神经元的进一步成熟[3-4]。课题组前期研究发现：LXRβ缺失后会导致小鼠海马齿状回区的RGCs数量减少，影响新生颗粒细胞和神经前体细胞向齿状回迁移，从而使海马颗粒细胞层的颗粒神经元减少，神经元分化和成熟发生异常，因而影响生后海马的神经发生[5-7]。RGCs可以被神经前体细胞的标志物Nestin、SOX2、Pax6所标识，同时亦能被星形胶质细胞标志物BLBP，GFAP等标记[8]。SOX2作为核转录因子，可标记神经前体细胞，在胚胎早期发育中发挥重要作用[9-10]。星形胶质细胞标志物GFAP可以特异性标记放射状胶质细胞长突起，SOX2/GFAP双标记可特异性识别生后海马齿状回颗粒区和颗粒下区内的RGCs，提示齿状回发育的关键期部分星形胶质细胞具有RGCs的特性[11-12]。然而星形胶质细胞中特异性敲除LXRβ对小鼠海马齿状回的RGCs的影响目前仍不清楚。
本研究基于Cre/loxP系统构建星形胶质细胞中LXRβ敲除小鼠(LXRβ cKOGFAP)与对照小鼠(LXRβfl/fl)。胚胎期海马齿状回的形成遵循三基质，出生后，第三基质则主要负责颗粒细胞层及颗粒下区(subgranular zone, SGZ)的形成。在胚胎发育晚期至生后早期(E18.5-P2)，海马齿状回内RGC形成跨门区的放射状胶质支架，引导细胞的迁移形成瞬时神经发生区即软膜下神经生成区(subpial neurogenic zone, SPZ)，为神经前体细胞的富集区，是颗粒细胞层形成的关键。生后2周为小鼠海马齿状回发育的关键期，所以在生后2 d (postnatal day 2，P2)、P7采用HE染色检测两组小鼠海马齿状回结构的变化。在P7和P14采用放射状胶质细胞、神经前体细胞增殖和神经元标志物进一步探究星形胶质细胞中特异性敲除LXRβ对小鼠生后海马齿状回RGCs发育的影响，借此明确对神经前体细胞增殖、迁移和神经元成熟的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料BrdU抗体购自美国BD公司，SOX2抗体购自英国Abcam公司，GFAP抗体购自美国Dako公司，Prox1抗体购自美国Millipore公司，NeuN抗体购自英国Abcam公司，荧光二抗均购自美国Invitrogen公司，Trition-X-100和胎牛血清蛋白均购自美国Invitrogen公司。
1.2 方法 1.2.1 动物与分组LXRβflox/flox (LXRβfl/fl) 小鼠和GFAP-Cre小鼠分别购自澳大利Ozgene有限公司和美国Jackson实验室。LXRβfl/fl和GFAP-Cre小鼠都是C57BL/6J小鼠背景。将GFAP-Cre小鼠和LXRβ fl/fl小鼠进行杂交，得到星形胶质细胞特异性LXRβ敲除小鼠(LXRβ cKOGFAP)。Cre/loxP系统用于构建星形胶质细胞中LXRβ特异性敲除小鼠。所有动物在12 h光/暗昼夜节律的环境中饲养，小鼠可随意获得食物和水。根据PCR结果判定小鼠的基因型。分为两组：对照组(LXRβfl/fl)、星形胶质细胞中LXRβ敲除组(LXRβ cKOGFAP)。动物处理和实验过程遵循陆军军医大学动物实验室管理要求。小鼠出生当天记为P0，只选取雄性小鼠进行实验。
1.2.2 药物处理为评估两组小鼠海马齿状回细胞增殖情况，于P7对小鼠腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，给药2 h后处死、取材。
1.2.3 标本采集对P2、P7小鼠制备石蜡切片样本，小心剥离脑组织，置于4%多聚甲醛(PFA) 中固定48 h，转入50%酒精中脱水30 min，将脑组织置于70%的酒精中室温保存备用。对P14小鼠制备冰冻切片样本，于P14对2组小鼠进行心脏灌注取脑组织，在4% PFA溶液中放置48 h后，转移至30%蔗糖中充分脱水，取30 μm厚度的脑组织切片，于-20 ℃保存。
1.2.4 HE染色首先对小鼠脑组织样本进行脱蜡和水化，接着样本在苏木素中浸泡5 min，用自来水冲掉残留液体后，盐酸酒精分化30 s，接下来将样本过伊红30 s，自来水冲掉残留液体，最后标本自然风干后，用DPX封片，制备好的染色标本室温保存用于后续拍照。
1.2.5 免疫荧光染色对于P7石蜡组织切片，首先要进行脱蜡和水化，接着进行抗原修复：将标本放置在枸橼酸盐缓冲液中，微波炉中加热，室温自然冷却，后续染色步骤同P14冰冻切片。选取2组大小合适脑片于PBS中漂洗30 min，之后加入0.3 % Triton X-100封闭非特异性结合。加入相应一抗：小鼠抗BrdU抗体(1 ∶500)、小鼠抗SOX2抗体(1 ∶500)、兔抗GFAP抗体(1 ∶400)、兔抗Prox1抗体(1 ∶400)、兔抗NeuN抗体(1 ∶500)抗体，37 ℃放置2 h，4 ℃孵育过夜。对于BrdU染色还需进行2NHCL解除DNA双链。二抗分别加入抗小鼠594、抗兔cy3、抗兔488荧光二抗(1 ∶500)，37 ℃孵育2 h后，DAPI复染，自然晾干后滴加荧光封片剂封片。每组每个时间点各取3只小鼠，每只小鼠选取相似位置得4张脑片用于染色。
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据均用x±s表示，两组比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 星形胶质细胞中LXRβ缺失对海马结构的影响HE染色结果显示，P2、P7时，两组小鼠海马齿状回区颗粒细胞层细胞排列紧密，呈圆形，细胞结构清晰，细胞连接紧密，大体结构上均没有明显的变化(图 1)。与LXRβfl/fl组小鼠相比，LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回面积无明显改变(图 1)。说明星形胶质细胞中LXRβ缺失不会改变海马齿状回结构的形成。
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| A：HE染色观察两组小鼠P2、P7时海马齿状回结构；B：P2时海马齿状回面积定量分析；C：P7时海马齿状回面积定量分析 1：LXRβfl/fl组；2：LXRβ cKOGFAP组 图 1 星形胶质细胞中LXRβ缺失对海马结构的影响 |
2.2 星形胶质细胞中LXRβ缺失导致小鼠海马齿状回门区的BrdU阳性细胞数增加
BrdU作为胸腺嘧啶衍生物，能够在细胞增殖时替代核苷酸插入DNA链中，常用来检测细胞增殖。免疫荧光结果显示，BrdU阳性细胞主要分布在海马齿状回颗粒层(GCL)、门区(Hilus)、边缘区(MZ)。与LXRβfl/fl组小鼠相比，LXRβ cKOGFAP组BrdU标记的阳性细胞在海马齿状回门区显著增多(P < 0.05)，而在边缘区、颗粒细胞下区以及海马齿状回内BrdU总数差异均无统计学意义(图 2)。提示星形胶质细胞中LXRβ缺失会导致海马齿状回门区神经细胞增殖。
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| A：免疫荧光检测BrdU标记的海马齿状回区阳性细胞；B：定量分析两组小鼠海马不同亚区BrdU阳性细胞数 a：P < 0.05，与LXRβfl/fl组比较 图 2 星形胶质细胞中LXRβ缺失对小鼠海马细胞增殖的影响 |
2.3 星形胶质细胞中LXRβ缺失引起P7小鼠海马齿状回放射状胶质细胞数量减少
生后及成年海马齿状回颗粒细胞层保留的神经前体细胞即由早期的RGCs分化迁移而来，RGCs是生后及成年海马齿状回神经干细胞的主要来源，组成海马齿状回的神经前体细胞库。SOX2可作为神经前体细胞的标记物，GFAP可以特异性标记放射状胶质细胞长突起。SOX2/GFAP双标记可以标记生后海马齿状回颗粒层的RGCs。免疫荧光检测P7时两组海马齿状回颗粒细胞层的RGCs和神经前体细胞的表达。与LXRβfl/fl组小鼠相比，LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回颗粒细胞层SOX2标记的神经前体细胞数量显著减少(P < 0.01，图 3A、B)。同样，LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回颗粒细胞层SOX2/GFAP标记的RGCs数量较LXRβfl/fl组显著减少(P < 0.05，图 3A、C)。结果表明，星形胶质细胞中LXRβ缺失会导致生后早期小鼠海马齿状回的RGCs和神经前体细胞数量减少。
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| A：免疫荧光检测两组小鼠海马齿状回放射状胶质细胞表达；B：定量分析两组小鼠海马齿状回SOX2标记的阳性细胞数；C：定量分析两组小鼠海马齿状回SOX2和GFAP共同标记的阳性细胞数 1：LXRβfl/fl组；2：LXRβ cKOGFAP组；a：P < 0.01，b：P < 0.05，与LXRβfl/fl组比较 图 3 星形胶质细胞中LXRβ缺失的小鼠海马齿状回放射状胶质细胞数量减少 |
2.4 星形胶质细胞中LXRβ缺失不影响小鼠海马齿状回颗粒细胞层未成熟神经细胞数量
为了探究对新生颗粒神经元的影响，Prox1标记颗粒神经元，分析星形胶质细胞中LXRβ缺失对海马齿状回Prox1标记的颗粒神经元的影响。在P7时RGCs进一步转化形成次级放射状胶质细胞，其突起穿过颗粒细胞层，并引导神经元的迁移。免疫荧光染色检测Prox1的表达，在P7、P14时，2组小鼠在海马齿状回颗粒层Prox1表达的差异无统计学意义(图 4)。
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| A：免疫荧光检测P7、P14时2组小鼠海马齿状回颗粒神经元标志物Prox1的表达；B：半定量分析P7时小鼠海马齿状回Prox1标记阳性细胞数；C：半定量分析P14时小鼠海马齿状回Prox1标记阳性细胞数 1：LXRβfl/fl组；2：LXRβ cKOGFAP组 图 4 星形胶质细胞中LXRβ缺失对小鼠海马齿状回颗粒细胞层Prox1的表达没有影响 |
2.5 星形胶质细胞中LXRβ缺失减少小鼠海马齿状回颗粒细胞层NeuN的表达
在生后海马齿状回颗粒细胞层产生的神经元，一般需要2~3周发育成功能成熟的颗粒细胞。进一步对P7和P14时小鼠海马齿状回成熟神经元的标志物NeuN进行免疫荧光染色。结果显示，在P7时，2组小鼠海马齿状回颗粒层NeuN的表达无统计学意义(图 5A、B)；在P14时，与LXRβfl/fl组小鼠相比，LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回颗粒细胞层NeuN表达显著减少(P < 0.05，图 5A、C)。结果提示，在P14时，星形胶质细胞中LXRβ缺失会导致NeuN表达显著降低。
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| A：免疫荧光检测P7、P14时2组小鼠海马齿状回成熟神经元NeuN的表达；B：半定量分析P7时小鼠海马齿状回NeuN标记阳性细胞；C：半定量分析P14时海马齿状回NeuN标记阳性细胞 1：LXRβfl/fl组；2：LXRβ cKOGFAP组；a：P < 0.05，与LXRβfl/fl组比较 图 5 星形胶质细胞中LXRβ缺失的小鼠海马齿状回颗粒细胞层NeuN的表达减少 |
3 讨论
大量研究证据表明：放射状胶质细胞通过影响神经元的产生和迁移而参与中枢神经系统皮层、海马、小脑和视网膜等板层结构的形态发生[13-15]。我们前期研究发现，LXRβ对放射状胶质细胞的发育与分化有重要调控作用。LXRβ缺失影响放射状胶质细胞细胞长突起的形成，进而影响大脑皮质与海马的板层结构发育。生后放射状胶质细胞会产生少突胶质细胞和星形胶质细胞，并随着发育时程的进行，多数放射状胶质细胞会逐渐转化成成熟的星形胶质细胞，仅在成年室下区与海马齿状回的颗粒下区保留有增殖能力的放射状胶质细胞[16-17]。与此一致的是，LXRβ缺失引起皮层少突前体细胞的分化减少，促进海马放射状胶质细胞向星形胶质细胞的快速转化，并观察到星形胶质细胞的大量增生[5]。因此，LXRβ对海马齿状回内放射状胶质细胞的维持和神经前体细胞的数量有调控作用。本研究中，在P7时，用免疫荧光对海马齿状回增殖细胞以及神经前体细胞检测发现，星形胶质细胞中LXRβ缺失显著增加小鼠海马齿状回门区内BrdU标记的阳性细胞数，而减少SOX2标记的神经前体细胞数与SOX2/GFAP标记的放射状胶质细胞数。海马齿状回生后由放射状胶质细胞产生的神经前体细胞沿着齿状回内的放射状突起由门区向颗粒细胞层进行迁移，并在P7时迁移至颗粒细胞层。本研究在放射状胶质细胞数量减少的同时，观察到放射状长突起的数量减少，这可能是引起BrdU标记的增殖细胞在齿状回内门区聚集的主要因素。我们同时注意到，在颗粒细胞层及齿状回内BrdU的总数2组间差异均无统计学意义，提示LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回内的增殖的神经前体细胞未受到显著影响，这与海马齿状回的面积在两组间无显著差异基本一致。由于增殖的神经前体细胞不能迁移至颗粒细胞层，因此会进一步减少颗粒细胞层SOX2标记的神经干细胞数量。在P7时，小鼠海马齿状回的颗粒细胞层结构初步形成，并通过神经前体细胞在颗粒层的迁移和神经元的迁移，形成颗粒下区和颗粒细胞层。此时，颗粒细胞层内的放射状胶质细胞长突起穿过形成的颗粒细胞层，引导神经前体细胞和神经元的迁移[18]。大量研究证据显示，放射状胶质细胞的长突起在引导颗粒层神经元迁移的同时，能够促进新生神经元的成熟。Prox1在海马齿状回颗粒细胞中特异性表达[19]。本研究中，在P7与P14时观察到LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回内Prox1标记的新生神经元与对照组均无显著差异，提示星形胶质细胞中LXRβ缺失不影响神经前体细胞向颗粒神经元的早期分化。进一步研究发现P14时，LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回内颗粒细胞NeuN的表达较对照组显著减少减低，提示海马齿状回颗粒神经元的成熟存在一定障碍。在P7时，我们注意到LXRβ cKOGFAP组小鼠海马齿状回射状胶质细胞的长纤维形成障碍，推测这可能是颗粒神经元成熟发生障碍的重要因素。
综上所述，本研究发现星形胶质细胞中特异性敲除LXRβ影响海马齿状回放射状胶质细胞的发育，特别是放射状胶质纤维的发育，借此影响神经前体细胞的迁移和神经元的成熟。与整体LXRβ敲除相比较，LXRβ cKOGFAP小鼠海马齿状回内神经前体细胞的增殖异常的表型不明显，而特异性地影响放射状胶质纤维的发育，提示不同类型细胞中LXRβ功能存在一定差异。星形胶质细胞中特异性敲除LXRβ引起神经元成熟障碍，进一步探究星形胶质细胞中LXRβ在调控海马齿状回发育的分子机制。
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