表1(Table 1)
高原地区具有低压低氧的特点，可引起进入高原人员机体缺氧。脑是机体对缺氧最敏感的器官，海马是脑内对缺氧较敏感的部位之一。长期或短时间严重缺氧可引起中枢神经系统功能紊乱，表现为认知功能下降等，尤以记忆力下降更为突出，严重影响学习能力和工作效率。人群研究和动物实验均证明无论急性缺氧还是长期慢性缺氧都能够引起脑记忆功能损伤[1-2]。
Morris水迷宫实验是应用最广泛的研究和评价动物空间学习记忆能力的经典行为学实验。空间记忆是用于表征外界环境地理位置或方向的一种记忆形式，大脑中海马及其周围脑区是支持空间记忆的重要脑区，并且在海马区发现了位置细胞，这是空间记忆形成的基础[3-5]。研究表明，小鼠暴露于模拟海拔6 000 m左右的低氧环境7 d即出现空间记忆能力的显著下降[6-7]。蛋白质是执行生物学功能的物质基础，其表达高低及翻译后修饰水平与蛋白质功能密切相关。真核生物体内大约1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的，蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程。因此，蛋白质磷酸化是最重要的一种蛋白质翻译后修饰[8]。研究表明，不同程度缺氧后脑组织中NF-κB、P38 MAPK、Tau等蛋白磷酸化水平升高，这些蛋白的异常磷酸化修饰被认为参与缺氧诱导的认知功能损伤[9-10]。
目前，还缺乏对低压低氧引起记忆损伤时脑海马体蛋白质磷酸化修饰改变的整体认识和系统研究。本研究通过建立低压低氧小鼠记忆损伤模型，比较常氧组和低压低氧组小鼠脑海马差异磷酸化修饰蛋白并对其所参与的生物学过程和信号通路等进行分析，探寻关键差异磷酸化修饰蛋白和通路，分析其在低压低氧导致记忆损伤中的潜在调控作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器和试剂高原低压低氧环境模拟舱(陆军军医大学高原军事医学系)，Morris水迷宫(中国医学科学院药物所)，Q-Exactive质谱仪(Thermo公司)。TMT标记试剂盒和High-SelectTM Fe-NTA磷酸肽富集试剂盒购自Thermo公司。
1.1.2 动物建模及取材40只雄性C57BL/6小鼠购自陆军军医大学实验动物中心，SPF级，体质量(20±2)g，按体质量顺序编号后采用随机数字表法分为常氧组(Ctrl组)和低压低氧组(HH组)，每组20只。将HH组小鼠暴露在模拟海拔6 000 m低压氧舱中饲养7 d，Ctrl组在平原环境(海拔300 m)饲养。低压低氧暴露结束后，每组取11只用于Morris水迷宫实验，9只用于海马组织取材。麻醉小鼠，每只小鼠用约30 mL生理盐水灌注，取脑海马，迅速冻于液氮，用于磷酸化蛋白质组学测定分析。
1.2 方法 1.2.1 Morris水迷宫实验缺氧第3天开始对小鼠进行水迷宫实验。在开始训练前取出平台，小鼠在水中适应20 s，再进行学习训练，连续训练4 d，每天4次，记录小鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期)。如果时间超过120 s小鼠仍未寻找到平台，则引导小鼠至平台停留20 s，第5天行120 s的空间探索实验，记录小鼠逃避潜伏期、游泳距离、游泳速度、穿越平台次数、目标象限停留时间。
1.2.2 小鼠脑海马组织磷酸化蛋白质组学检测与分析小鼠脑海马组织磷酸化蛋白质组学检测与分析由中科新生命公司(上海)完成。对脑海马组织进行蛋白提取、胰蛋白酶消化、磷酸化肽段富集和质谱检测后，分析筛选差异表达磷酸化肽段，然后对差异表达磷酸化肽段对应蛋白进行通路分析和蛋白质互作分析。
1.2.2.1 质谱分析小鼠脑海马组织加入裂解液提取蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量。每个样品取适量蛋白质采用过滤辅助的蛋白组样本制备方法进行胰蛋白酶酶解，然后采用C18柱对酶解肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40 μL溶解缓冲液复溶，用D(280)检测肽段的含量。各样品分别取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT标记试剂盒说明书进行标记，然后进行磷酸化肽段富集。样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。采用MaxQuant软件(版本号1.5.5.1)对质谱分析数据进行查库鉴定及定量分析。
1.2.2.2 生物信息学分析筛选至少满足在HH组或Ctrl组任一组的质谱检测值2次及以上不为空值的磷酸化肽段纳入差异分析。为了便于后续分析，将筛选后数据中的空值赋值为0。对于某一磷酸化肽段，若HH组表达量均值不为0，而Ctrl组为0时，将该磷酸化肽段在HH/Ctrl组间比值赋值为100；若HH组表达量均值为0，而Ctrl组不为0时，将该磷酸化肽段在HH/Ctrl组间比值赋值为0.01。采用两组独立样本t检验，以质谱检测值倍数变化＞1.2倍(上调＞1.2倍或者下调＜0.83倍)且P＜0.05的标准筛选差异表达磷酸化肽段。使用ggplot2和pheatmap R包绘制火山图和聚类热图对差异表达磷酸化肽段进行可视化。使用clusterProfiler 4 R包[11]对差异表达磷酸化肽段对应的蛋白进行GO和KEGG通路富集分析，使用该R包中的simplify函数对GO富集的结果进行去冗余，校正后P＜0.05的条目被定义为富集显著，使用ggplot2 R包对富集分析的结果进行可视化。基于STRING(http://string-db.org/)[12]数据库中的信息查找目标蛋白质间的相互作用关系，网络类型参数设置为物理网络，最低相互作用评分参数设定为0.4。使用CytoScape软件[13](版本号：3.7.1)对蛋白质互作(protein and protein interaction, PPI)网络进行可视化和分析，使用CytoScape中的cytoHubba插件基于MCC算法筛选核心蛋白。MCC算法得分排名前5的蛋白被认定为核心蛋白。
1.3 统计学分析实验数据均为计量资料。Morris水迷宫行为学数据由Panlab Smartbasic软件记录，采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以x±s表示。水迷宫实验训练期的逃避潜伏期、游泳距离、游泳速度指标采用重复测量的双因素方差分析(时间×处理因素)，水迷宫实验测试期的检测指标采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。使用R语言中的t.test函数对磷酸化肽段表达量进行两组独立样本t检验，倍数变化＞1.2倍且P＜0.05的肽段被认定为差异磷酸化肽段。使用clusterProfiler 4 R包进行GO和KEGG通路富集分析，校正后P＜0.05的条目被认定为富集显著的条目。
2 结果 2.1 模拟高原低压低氧暴露导致小鼠学习和空间记忆能力下降采用Morris水迷宫实验检测低压低氧对小鼠学习和空间记忆能力的影响。在前4 d的学习测试中，处理方法与实验天数之间无交互作用(P>0.05)。与Ctrl组比较，训练期间HH组小鼠逃避潜伏期显著延长(1、3、4 d，P＜0.05, 图 1A)，游泳距离显著增加(1~4 d，P＜0.01, 图 1B)，游泳速度无明显差别(图 1C)。第5天的空间记忆测试结果显示，与Ctrl组比较，HH组小鼠逃避潜伏期和游泳距离显著延长(P＜0.01, 图 1D、E)，而两组之间穿越平台次数、游泳速度和目标象限停留时间无显著差异(图 1F~H)。
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a：P＜0.05，b：P＜0.01，与Ctrl组比较 A~C：水迷宫实验训练期小鼠逃避潜伏期、游泳距离、游泳速度的比较；D~H：水迷宫实验测试期小鼠逃避潜伏期、游泳距离、穿越平台次数、游泳速度、目标象限停留时间的比较 图 1 水迷宫实验检测低压低氧对小鼠学习和空间记忆能力的影响 (n=11, x±s) |
2.2 差异表达磷酸化肽段筛选
分别对Ctrl组、HH组进行磷酸化蛋白组学分析，每组3个技术重复，共6组数据。质谱共检测出磷酸化蛋白质2 910个，磷酸化肽段7 785个，磷酸化位点9 923个。在鉴定到的磷酸化修饰位点中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的分布比例分别为85.6%、13.3%和1.1%。筛选至少在Ctrl组或HH组的质谱丰度值中有效值数目≥2个的数据纳入差异分析，共获得7 562个磷酸化肽段。以倍数变化＞1.2倍(上调＞1.2倍或者下调＜0.83倍)且P＜0.05的标准筛选得到差异表达磷酸化肽段共136个，其中上调92个，下调44个，绘制火山图(图 2A)和聚类热图(图 2B)。上调或下调变化倍数最大的前10个肽段序列和修饰位点信息见表 1。差异表达磷酸化肽段共对应121个蛋白，其中上调79个，下调42个。111个蛋白检测到1个差异磷酸化肽段，6个蛋白检测到2个差异磷酸化肽段，3个蛋白检测到3个差异磷酸化肽段，1个蛋白检测到4个差异磷酸化肽段。检测到多个差异磷酸化肽段(≥3)的蛋白信息见表 2。
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| A：差异表达磷酸化肽段绘制的火山图每个点代表一个磷酸化肽段，与Ctrl组比较，红色代表表达显著上调的磷酸化肽段，绿色代表表达显著下调的磷酸化肽段，灰色代表表达无显著差异的磷酸化肽段；B：差异表达磷酸化肽段绘制的聚类热图 色阶代表磷酸化肽段表达量, 与Ctrl组比较，红色代表相对高表达，绿色代表相对低表达 图 2 差异表达磷酸化肽段火山图和聚类热图 |
| 肽段序列 | 数据库编号 | 蛋白名称 | 编码基因 | 在肽段中的修饰位点 | 在蛋白中的修饰位点 | P值 | HH/Ctrl |
| SQsSQRGEDGAK | Q920P5 | Adenylate kinase isoenzyme 5 | Ak5 | S3 | S503 | 0.002 6 | 2.616 1 |
| HNsLHR | Q6PEV3 | WAS/WASL-interacting protein family member 2 | Wipf2 | S3 | S282 | 0.008 2 | 2.009 3 |
| EttGSESDGGDSSSTK | Q8R550 | SH3 domain-containing kinase-binding protein 1 | Sh3kbp1 | T2; T3 | T222; T223 | 0.028 3 | 1.759 4 |
| GYsFTTTAEREIVR | P63260 | Actin, cytoplasmic 2 | Actg1 | S3 | S199 | 0.010 2 | 1.659 5 |
| NLTSSsLNDISDKPEKDQLK | O88343 | Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 | Slc4a4 | S6 | S257 | 0.018 0 | 1.647 1 |
| EIHDVAGDGDsLGSPGPTRSPSLGNVPNTPASTISAR | Q80U49 | Centrosomal protein of 170 kDa protein B | Cep170b | S11 | S1338 | 0.049 7 | 1.637 8 |
| sRsGPsSPR | Q8C115 | Pleckstrin homology domain-containing family H member 2 | Plekhh2 | S1; S3; S6 | S642; S644; S647 | 0.011 5 | 1.634 5 |
| NLTSSsLNDISDKPEK | O88343 | Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 | Slc4a4 | S6 | S257 | 0.004 1 | 1.611 9 |
| EGsLGDELLPLGYAEPEPQEGASAGAPsPTLELASR | Q6WVG3 | BTB/POZ domain-containing protein KCTD12 | Kctd12 | S3; S28 | S153; S178 | 0.044 5 | 1.599 6 |
| ARQsSEDVR | Q03145 | Ephrin type-A receptor 2 | Epha2 | S4 | S571 | 0.024 6 | 1.588 4 |
| GSDNDSDsGSDGGGQR | Q8K2T8 | RNA polymerase Ⅱ-associated factor 1 homolog | Paf1 | S8 | S484 | 0.020 7 | 0.579 6 |
| RAsSESDsDDNQNK | Q62018 | RNA polymerase-associated protein CTR9 homolog | Ctr9 | S3; S8 | S1052; S1057 | 0.015 1 | 0.605 7 |
| GSDNDSDsGsDGGGQR | Q8K2T8 | RNA polymerase Ⅱ-associated factor 1 homolog | Paf1 | S8; S10 | S484; S486 | 0.006 5 | 0.649 5 |
| DSGLEDGREsPsFDTPSQR | Q5DTL9 | Sodium-driven chloride bicarb-onate exchanger | Slc4a10 | S10; S12 | S89; S91 | 0.013 8 | 0.692 2 |
| TsSTVNTK | Q8BTY2 | Sodium bicarbonate cotransporter 3 | Slc4a7 | S2 | S30 | 0.022 6 | 0.694 1 |
| SGSAHGsGK | P62996 | Transformer-2 protein homolog beta | Tra2b | S7 | S26 | 0.019 9 | 0.696 3 |
| ASQDTEDEESGASGSDSGsPAR | Q8K3W3 | Protein CASC3 | Casc3 | S19 | S27 | 0.034 7 | 0.701 7 |
| SSLsSAQADFNQLAELDR | P16546 | Spectrin alpha chain, non-erythrocytic 1 | Sptan1 | S4 | S2141 | 0.017 8 | 0.704 9 |
| SVsEDSPLGYSHTEGNSR | Q3UQI9 | Probable ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase MINDY-4 | Mindy4 | S3 | S340 | 0.042 9 | 0.730 6 |
| KLAAGAEsPQPASGNsPSEDDRSK | P16054 | Protein kinase C epsilon type | Prkce | S8; S16 | S329; S337 | 0.040 7 | 0.732 4 |
| “数据库编号”为Uniprot数据库中蛋白的ID；“蛋白名称”为Uniprot数据库中的蛋白名称；“P值”为两组间t检验的P值；HH/Ctrl为该磷酸化肽段的质谱检测值在HH组和Ctrl组之间的差异表达倍数 | |||||||
| 肽段序列 | 数据库编号 | 蛋白名称 | 编码基因 | 在肽段中的修饰位点 | 在蛋白中的修饰位点 | P值 | HH/Ctrl |
| GMYDGPVFDLTTtPKGGtPAGSTR | Q62188 | Dihydropyrimidinase-related protein 3 | Dpysl3 | T13; T18 | T509; T514 | 0.005 1 | 1.481 2 |
| GMYDGPVFDLTTtPKGGtPAGsTRGSPTRPNPPVR | Q62188 | Dihydropyrimidinase-related protein 3 | Dpysl3 | T13; T18; S22 | T509; T514; S518 | 0.001 8 | 1.310 6 |
| GGTPAGsTR | Q62188 | Dihydropyrimidinase-related protein 3 | Dpysl3 | S7 | S518 | 0.000 6 | 1.300 6 |
| GGTPAGsTRGsPTRPNPPVR | Q62188 | Dihydropyrimidinase-related protein 3 | Dpysl3 | S7; S11 | S518; S522 | 0.043 6 | 1.202 9 |
| TVTPAssAK | O08553 | Dihydropyrimidinase-related protein 2 | Dpysl2 | S6; S7 | S517; S518 | 0.019 3 | 1.383 1 |
| TVTPASSAKtsPAK | O08553 | Dihydropyrimidinase-related protein 2 | Dpysl2 | T10; S11 | T521; S522 | 0.037 0 | 1.348 0 |
| GLYDGPVCEVSVtPKTVTPAssAK | O08553 | Dihydropyrimidinase-related protein 2 | Dpysl2 | T13; S21; S22 | T509; S517; S518 | 0.032 6 | 1.299 3 |
| TASGSSVTSLEGTRsR | Q62433 | Protein NDRG1 | Ndrg1 | S15 | S342 | 0.003 4 | 1.280 8 |
| SRtAsGSSVTSLEGTR | Q62433 | Protein NDRG1 | Ndrg1 | T3; S5 | T328; S330 | 0.007 4 | 1.268 6 |
| TASGSsVTsLEGTR | Q62433 | Protein NDRG1 | Ndrg1 | S6; S9 | S333; S336 | 0.031 1 | 1.255 1 |
| NLTSSsLNDISDKPEKDQLK | O88343 | Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 | Slc4a4 | S6 | S257 | 0.018 0 | 1.647 1 |
| NLTSSsLNDISDKPEK | O88343 | Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 | Slc4a4 | S6 | S257 | 0.004 1 | 1.611 9 |
| KGSLDsDNDDsDCPYSEK | O88343 | Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 | Slc4a4 | S6; S11 | S1029; S1034 | 0.017 4 | 1.352 8 |
| 数据库编号为Uniprot数据库中蛋白的ID；蛋白名称为Uniprot数据库中的蛋白名称；P值为两组间t检验的P值；HH/Ctrl为该磷酸化肽段的质谱检测值在HH组和Ctrl组之间的差异表达倍数 | |||||||
2.3 差异磷酸化肽段对应蛋白的GO富集分析
对上述差异表达磷酸化肽段对应的蛋白进行GO富集分析，每个GO分类中富集最显著的前10个条目如图 3所示。在生物过程(biological process, BP)富集分析中，P值最小即富集最显著的生物学过程是蛋白质定位到突触和蛋白质定位到细胞连接，富集因子最高的生物学过程是组蛋白H2B泛素化，涉及差异磷酸化蛋白数量最多的生物学过程是细胞连接组装和突触构成。分子功能(molecular function, MF)富集分析结果显示，无机阴离子交换活性是富集最显著同时也是富集因子最高的MF条目，肌动蛋白结合和mRNA结合是涉及差异磷酸化蛋白数量最多的MF条目。细胞成分(cellular component, CC)富集分析结果显示，上述差异磷酸化蛋白主要定位于突触后密集区、非对称性突触、基底细胞膜、微管等部位。
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| 正方形、三角形和圆形分别代表MF、CC和BP 3个GO条目类别；图形的大小代表富集到该条目的蛋白数目的多少，图形越大代表蛋白数量越多；图形的颜色代表P值大小，颜色越接近红色代表P值越小，差异越显著 图 3 差异磷酸化肽段对应蛋白的GO富集分析 |
2.4 差异磷酸化肽段对应蛋白的KEGG通路富集分析
对上述差异表达磷酸化肽段对应的蛋白进行KEGG通路分析，富集最显著的前15条通路如图 4所示。差异磷酸化蛋白主要参与到胰岛素分泌、胰液分泌、谷氨酸能突触、内吞作用等信号通路，其中P值最小即富集最显著且富集因子最高的信号通路是胰岛素分泌，涉及差异磷酸化蛋白数量最多的信号通路是内吞作用。
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| 图形符号的大小代表富集到该通路的蛋白数目的多少，图形符号越大代表富集到该通路的蛋白数量越多；图形符号的颜色代表校正后的P值大小，图形符号的颜色越接近红色代表P值越小，差异越显著 图 4 差异磷酸化肽段对应蛋白的KEGG通路富集分析 |
2.5 差异磷酸化肽段对应蛋白PPI网络构建与分析
通过String 11.0对差异表达磷酸化肽段对应的121个蛋白质进行PPI网络构建，使用CytoScape 3.7.1软件对得到的互作网络进行可视化，使用CytoScape软件的cytoHubba插件中的MCC算法筛选核心蛋白，具体结果如图 5A所示。高度聚集的蛋白质可能具有相同或相似的功能，连接度高的蛋白质可能是影响整个系统代谢或信号转导途径的关键点。我们将MCC算法得分排名前五的蛋白定义为核心蛋白，筛选到Agap2、Syngap1、Dpysl2、Dpysl3和Dlg2共5个核心基因编码的蛋白(图 5B)。这些核心蛋白的名称、编码基因见表 3。
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| A：差异磷酸化肽段对应蛋白的PPI网络图每个圆形代表一个蛋白质，颜色代表与其相互作用的蛋白质数目，圆形颜色越接近红色代表与其相互作用的蛋白质数目越多；两个圆形之间的连线代表蛋白质之间存在直接相互作用，连线的粗细代表相互作用的可信程度，连线越粗代表相互作用越可信；B：Top 5核心蛋白网络 每个长方形代表一个蛋白质，两个长方形之间的连线代表蛋白质之间存在直接相互作用，图形颜色代表其MCC得分的大小，越接近红色，MCC得分越大 图 5 差异磷酸化肽段对应蛋白的互作网络 |
| 数据库编号 | 蛋白名称 | 编码基因 | MCC得分 |
| Q3UHD9 | Arf-GAP with GTPase，ANK repeat and PH domain-containing protein 2 | Agap2 | 24 |
| F6SEU4 | Ras/Rap GTPase-activating protein SynGAP | Syngap1 | 23 |
| O08553 | Dihydropyrimidinase-related protein 2 | Dpysl2 | 15 |
| Q62188 | Dihydropyrimidinase-related protein 3 | Dpysl3 | 13 |
| Q91XM9 | Disks large homolog 2 | Dlg2 | 13 |
| “数据库编号”为Uniprot数据库中蛋白的ID；“蛋白名称”为Uniprot数据库中的蛋白名称；MCC得分采用cytoHubba插件中的MCC算法计算 | |||
3 讨论
高原低压低氧是威胁进入高原人员健康的最主要环境因素。大脑对缺氧十分敏感，高原低压低氧可引起人的学习、记忆功能受损[1, 14]，在动物实验也得到类似结果[6-7]。高原低压低氧暴露致记忆损伤的发生机制较为复杂，与氧化应激、钙超载、兴奋性神经递质毒性和神经炎症等有关[15]。目前针对低压低氧导致的认知功能损伤仍缺乏有效的干预措施，原因在于我们对其发生机制的理解尚不全面。本研究通过建立模拟高原环境低压低氧暴露致小鼠记忆损伤模型，采用磷酸化蛋白质组学技术，筛选了小鼠脑海马组织差异磷酸化修饰蛋白，提高了对模拟高原暴露时脑海马体蛋白质磷酸化修饰改变的整体认识。Morris水迷宫实验结果显示，低压低氧暴露后小鼠空间记忆能力显著下降，提示记忆损伤模型造模成功。磷酸化蛋白组学结果显示，低压低氧处理后有79个蛋白存在磷酸化修饰明显上调的位点，42个蛋白存在磷酸化修饰明显下调的位点，提示低压低氧组和常氧组小鼠脑海马蛋白磷酸化谱之间存在明显差异。
GO富集分析结果显示，上述差异磷酸化修饰蛋白分布在突触后密集区、非对称性突触和基底细胞膜等细胞组分，主要发挥肌动蛋白结合、mRNA结合、SH3结构域结合、钙调素结合等分子功能，主要参与细胞连接组装、突触构成、突触中囊泡介导的运输、树突发育、认知等生物学过程。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。低氧暴露大鼠海马组织电镜观察的结果显示，低氧暴露可导致突触数量减少和突触结构发生改变，表现为突触的界面小，突触间隙模糊不清[16]。此外，低氧可通过诱导某些离子通道的表达增加来调节突触的可塑性，进而参与低压低氧导致的学习记忆损伤[17]。近来研究显示，组蛋白修饰可通过调节突触形成和突触可塑性参与记忆的形成与巩固[18]。本研究显示低压低氧引起的差异磷酸化修饰蛋白在多条组蛋白修饰相关的生物学过程显著富集，包括组蛋白H2B泛素化、组蛋白单泛素化和组蛋白甲基化正调控等。定位于突触的多个蛋白磷酸化水平在低压低氧后发生了明显变化，这些蛋白也多参与突触功能调控相关的生物学过程，提示突触结构改变和(或)功能障碍是急性高原缺氧引起记忆损伤的重要原因。
KEGG通路富集分析显示，上述差异磷酸化修饰蛋白在某些与认知相关的信号通路显著富集，包括谷氨酸能突触、长时程抑制、内吞作用以及钙信号途径等。低氧引起的能量代谢改变导致大脑中ATP产生减少和ROS产生增加，进而引起细胞膜去极化、细胞钙超载以及细胞外兴奋性谷氨酸积累等不利事件的发生[15]。缺氧处理海马CA1锥体神经元20 min可引起谷氨酸AMPAR的GluA1和GluA2亚基在细胞表面表达降低。这种降低与网格蛋白介导的内吞作用有关[19]。缺乏GluA2亚基的AMPAR具有Ca2+通透性，可导致兴奋性毒性[20]。此外，本研究发现差异磷酸化蛋白在胰岛素分泌信号通路显著富集。胰岛素信号可能通过影响神经递质合成和能量代谢参与调控认知功能。大脑胰岛素/胰岛素受体失调和胰岛素信号级联被报道与阿尔茨海默病的发病机制有关，影响脑认知功能[21]。在PC12细胞中，胰岛素被报道可以通过HIF1α和核受体Nur77促进酪氨酸羟化酶的表达，酪氨酸羟化酶是脑内神经递质多巴胺合成的限速酶[22]。葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)是显著富集的胰岛素分泌信号通路中的一个蛋白。该蛋白是一种在脑组织中高表达的葡萄糖转运体，GLUT1某些位点的磷酸化修饰对于调控其葡萄糖摄取速度和细胞表面定位具有重要作用[23]。本研究显示，低压低氧处理后有一个来源于GLUT1蛋白的磷酸化肽段出现明显上调。胰岛素在脑内的非代谢功能主要与脑血管生成有关，血管生成通路中参与激活HIF的PI3K和MAPK通路可被胰岛素信号通路激活，PI3K和MAPK通路可能在脑内胰岛素信号通路和血管生成通路之间起交互作用[24]。
PPI网络分析筛选出由Agap2基因编码的Arf类GTP酶激活蛋白2(Arf-GAP with GTPase, ANK repeat and PH domain-containing protein 2, AGAP2)、由Syngap1基因编码的突触Ras/Rap GTP酶激活蛋白1 (Ras/Rap GTPase-activating protein SynGAP, SYNGAP1)、由Dpysl2基因编码的二氢嘧啶酶相关蛋白2(dihydropyrimidinase-related protein 2, DRP2)、由Dpysl3基因编码的二氢嘧啶酶相关蛋白3(dihydropyrimidinase-related protein 3, DRP3)和由Dlg2基因编码的圆盘大同源物2(disks large homolog 2, DLG2)共5个核心蛋白。AGAP2蛋白是控制PI3K/Akt信号通路激活的重要分子开关。它将轴突导向因子、谷氨酸和神经营养因子等细胞外刺激与PI3K/Akt的内在活性连接起来[25]。低氧可通过上调AGAP2的表达来激活粘附斑激酶，进而增加HIF1α的表达[26]。SYNGAP1蛋白是兴奋性谷氨酸神经元突触后致密区的重要组成部分，通过负调控Ras、Rap和AMPAR转运至突触后膜，以调节突触可塑性和神经元稳态。人类SYNGAP1基因的突变被证明与神经发育障碍有关，例如自闭症和精神分裂症[27]。SYNGAP1能被低氧引起的钙超载和钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium-calmodulin dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)激活，其可通过激活Ras的GTPase活性抑制Ras-ERK通路，抑制CaMKⅡ/SAP102/SynGAP信号通路能够改善慢性间歇缺氧引起的大鼠学习记忆损伤[28]。CaMKⅡ和细胞周期依赖性蛋白激酶5对SYNGAP1的差异磷酸化能够改变突触中激活的Ras和Rap的比例，进而影响由这两种GTPases调控的细胞过程[29]。DRP2蛋白和DRP3蛋白均属于坍塌反应调节蛋白家族成员，在轴突导向、延伸和特化中发挥作用[30]。去磷酸化状态为DRP2蛋白的活性形式，其磷酸化后即失去调节神经突起生长的活性[31]。在AD患者及AD小鼠模型中均观察到DRP2的过度磷酸化，使用基因干预或是抑制剂干预等手段抑制DRP2的磷酸化能够减轻某些神经退行性疾病小鼠模型的病理损伤和改善认知功能[30-31]。DRP3蛋白的过度磷酸化在某些神经损伤小鼠疾病模型中被观察到，Dpysl3基因敲除能够减轻神经炎症[32-33]。DLG2蛋白也被叫做突触后致密部蛋白93(postsynaptic density protein，PSD93)，属于膜相关鸟苷酸激酶(membrane associated guanylate kinase，MAGUK) 家族[34]。MAGUKs的主要功能是结合并稳定突触上的蛋白质，能够调节突触上谷氨酸受体的表达[35]。PSD93可通过NMDAR/nNOS信号通路参与NMDAR引发的神经毒性[36]。鉴于上述蛋白在认知功能调控中的重要作用，它们可能在低压低氧导致的认知功能损伤中具有一定作用。目前，关于上述蛋白的磷酸化修饰在低压低氧导致的认知功能损伤中的作用相关研究报道较少，低压低氧引起海马组织中这些蛋白磷酸化修饰水平发生改变的生物学意义有待进一步研究。
综上所述，本研究发现低压低氧暴露后，小鼠空间记忆功能下降，小鼠脑海马体79个蛋白存在磷酸化修饰显著上调的位点，42个蛋白存在磷酸化修饰显著下调的位点。上述差异磷酸化蛋白主要定位于突触相关的细胞结构，多参与神经递质释放、内分泌功能调节、突触功能调节等相关的信号通路。蛋白质互作分析结果显示，AGAP2、SYNGAP1、DRP2、DRP3和PSD93可能是缺氧引起记忆损伤的关键蛋白。本研究结果对进一步了解高原低氧以及缺氧相关疾病引起记忆损伤的机制、寻找干预靶点，从而提高高原环境下的记忆功能、改善临床脑缺氧性疾病预后具有一定意义。
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