重金属镉被广泛应用于电镀、化工、电池生产等多个领域。自日本富山县人群因食用镉污染的稻米和鱼虾等出现痛痛病(Itai-Itai Disease)以来,镉中毒机制及其防治引起了世界各国的高度关注。我国镉污染现状同样十分严峻,2018年《环境科学》报道中国粮食主产区耕地土壤重金属点位超标率为21.49%,且镉污染耕地点位超标率(17.39%)位列第一[1]。镉是多系统、多器官毒物[2],神经系统是镉毒理作用的主要靶器官之一。多项人群流行病学调查显示镉暴露会损伤认知功能[3-4]。研究表明,镉暴露会抑制小鼠海马区神经发生和神经元凋亡,从而损伤小鼠的认知和嗅觉记忆[5]。因此探究镉诱导神经系统损伤的分子机制,可以为镉的神经毒性防护提供新线索。
溶酶体功能障碍是镉对中枢神经系统损伤的重要机制。溶酶体是神经元内物质代谢的主要场所,某些衰老细胞器和生物大分子等陷入溶酶体内并被消化掉是维持神经元稳态的关键因素之一[6]。溶酶体受损会导致细胞凋亡因子的释放、细胞自噬障碍,造成神经元的损伤或者促使神经元死亡[7]。因此,维持溶酶体的正常功能对神经元生命活动是至关重要的。我们前期研究结果显示,神经细胞(Neuro-2a细胞) 在镉暴露后会出现溶酶体标志蛋白LAMP1的减少,溶酶体的pH值改变,溶酶体的水解酶活性降低,能量代谢障碍进而促进神经细胞死亡,提示溶酶体功能损伤是镉神经毒性的重要机制[8-9]。然而,镉是通过哪些信号通路损伤溶酶体功能,有待于进一步阐明。
KIF5A即驱动蛋白家庭成员5A(kinesin family member 5A),是一种基于微管的运动蛋白,参与细胞内细胞器、蛋白质等大分子物质的运输。KIF5A蛋白在维持神经元的活力和可塑性及相关神经系统疾病的发生发展中都发挥着重要的作用。最近研究也表明KIF5A对于维持神经元溶酶体的正常功能也有重要意义[10-11]。本研究通过体外实验,以原代培养的SPF级C57BL/6J小鼠皮层神经元为模型,初步探究KIF5A介导的溶酶体功能在镉神经毒性中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞培养及氯化镉暴露方式根据我们前期建立的方法[11],在体式显微镜下从C57BL/6J新生小鼠(P0~P1)中分离培养原代皮层神经元。分离的神经元在聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich公司)包被过的培养皿中培养。接种培养基为:DMEM/F-12培养基(Gibco公司)含10% FBS、10%马血清(Gibco公司)和1%青霉素及链霉素,在5% CO2加湿环境中37 ℃培养24 h后,培养基更换为Neurobasal-A培养基(Gibco公司),并补充2% B-27(Gibco公司)和0.5% GlutaMAX(Gibco公司)。神经元培养7 d后,用氯化镉处理原代皮层神经元24 h。氯化镉购自Sigma公司,纯度>99.99%。以PBS配制氯化镉储液,浓度为100 mmol/L,以培养基稀释至1~7 μmol/L使用。
C57BL/6J新生小鼠(P0~P1)由陆军军医大学实验动物中心提供,生产许可证号SCXK (渝) 20170002,使用许可证号SYXK(渝) 20170002。动物实验获得陆军军医大学实验动物伦理审查委员会批准(AMUWEC2019493)。
1.2 CCK-8细胞增殖实验使用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8,Dojindo公司)测定细胞增殖能力。将小鼠皮层神经元细胞以2×104 /孔接种于96孔细胞培养板,培养7 d后,用含不同剂量氯化镉的培养基处理24 h,通过酶标仪在波长450 nm处测量光密度值[D(450)]。
1.3 神经元突起生长分析实验将小鼠皮层神经元细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板,培养7 d后,分别用含1、2、3 μmol/L氯化镉培养基处理细胞。将培养板放入IncuCyte ZOOM(Essen BioScience公司,美国)装置中培养。IncuCyte每8小时记录1次细胞图像,持续24 h。利用IncuCyte ZOOM NeuroTrack分析系统分析神经元突起生长,参考课题组前期建立的方法[12]分析镉暴露对其突出长度及分枝点数量的影响。
1.4 组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)和组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)活性检测将小鼠皮层神经元细胞以2×106 /孔接种于6孔板,培养7 d后,分别用含1、2、3 μmol/L氯化镉培养基处理细胞24 h。分别采用CTSB和CTSD活性荧光检测试剂盒(BioVision公司,K143-100,K140-100)检测镉处理对神经元组织蛋白酶活性的影响,使用InfiniteTM M200多功能酶标仪分别读取400 nm激发和505 nm发射的荧光值(CTSB)及328 nm激发和460 nm发射的荧光值(CTSD)。分别以蛋白浓度标化CTSB或CTSD活性[7]。
1.5 神经元溶酶体pH检测根据课题组之前的方法[9]测量神经元溶酶体pH值。将小鼠皮层神经元细胞以2×104/孔接种于黑色96孔细胞培养板,培养7 d后,分别用含1、2、3 μmol/L氯化镉培养基处理细胞24 h。弃去培养基,每孔加入1 μmol/L LysoSensor Green DND-189探针(Invitrogen公司),避光孵育5 min,再用PBS洗涤3次,使用InfiniteTM M200多功能酶标仪读取485 nm激发和530 nm发射的荧光值。
1.6 神经元溶酶体LysoTrackerTM Red DND-99染色根据课题组之前的方法[9]检测神经元溶酶体的免疫荧光。将小鼠皮层神经元细胞以1×106/孔接种于玻璃底共聚焦皿中,培养7 d后,分别用含1、2、3 μmol/L氯化镉培养基处理细胞24 h。弃去培养基,每孔加入含1 μmol/L LysoTrackerTM Red DND-99探针(Invitrogen公司)的培养基,培养箱中孵育60 min,使用共聚焦显微镜(Leica TCS SP8,德国)进行拍照及计算。
1.7 实时定量荧光PCR分析以总RNA提取试剂RNAiso Plus(宝生物公司,日本)按说明书步骤提取样本总RNA。按反转录试剂盒PrimeScriptRT reagent Kit(宝生物公司,日本)说明书步骤将总RNA转录为cDNA。使用荧光定量检测试剂SYBR Master Mix(宝生物公司,日本)及荧光定量PCR仪(CFX96,美国伯乐公司)进行基因实时定量荧光PCR分析,检测KIF5A mRNA在不同样本中的表达。特异性引物序列见表 1。以GAPDH为内参,以2-ΔΔCt方法计算mRNA表达量[13]。
基因 | 上游引物 | 下游引物 | 产物长度/bp |
KIF5A | 5′-CTCACAGCATGAGGCCAAGA-3′ | 5′-CTCTTCCAGGTGCCGTTTCT-3′ | 79 |
GAPDH | 5′-AAGGGCATCTTGGGCTACAC-3′ | 5′-TCGAAGGTGGAAGAGTGGGA-3′ | 77 |
1.8 Western blot检测KIF5A蛋白表达
分别收集对照组和各镉暴露组细胞样本提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离,切胶、转膜、封闭。分别加入兔抗小鼠KIF5A抗体(1 ∶1 000,Thermo Fisher Scientific公司,美国)、小鼠抗小鼠β-actin抗体(1 ∶5 000,Sigma公司,美国),4 ℃孵育过夜;分别加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000,碧云天公司,中国),山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000,碧云天公司,中国)室温摇床孵育2 h;洗膜,ECL显色。利用ChemiDoc XRS+系统和Image Lab软件(美国Bio-Rad公司)对条带进行成像和灰度值分析。
1.9 腺病毒KIF5A过表达实验采用含过表达载体KIF5A的腺病毒(和元生物设计合成)转染神经元,观察过表达KIF5A对镉毒性的拮抗作用。将小鼠皮层神经元细胞以2×104/孔接种于96孔细胞培养板中,培养6 d后,分别用含过表达载体KIF5A(KIF5A过表达组)及对照载体(对照组)的腺病毒感染神经元,24 h后分别用含3 μmol/L氯化镉(KIF5A过表达组+镉处理组和对照+镉处理组)培养基处理细胞24 h,进行后续检测。
1.10 统计学处理所有实验至少重复3次。采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析,数据以x±s表示。组间比较采用t检验和单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 氯化镉可显著抑制小鼠原代皮层神经元的细胞活力为分析氯化镉暴露对神经元细胞活力造成的影响,以等差梯度测定1~7 μmol/L氯化镉暴露小鼠原代皮层神经元24 h后,以细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8检测神经元细胞活力变化,计算氯化镉暴露神经元的半数抑制浓度(IC50),结果显示氯化镉IC50值为2.9 μmol/L(图 1A)。据此浓度,应用氯化镉等差梯度浓度1、2、3 μmol/L观测氯化镉体外暴露对神经元细胞活力的影响。结果显示,2 μmol/L和3 μmol/L的氯化镉能显著抑制神经元的细胞活力,并呈剂量依赖性特征(图 1B)。
2.2 氯化镉暴露可显著抑制小鼠原代皮层神经元的突起生长
将小鼠皮层神经元置于IncuCyte ZOOM装置中培养并分别暴露于1、2、3 μmol/L氯化镉,观察及分析氯化镉暴露对神经元突起生长的影响。结果显示,与对照组相比,2 μmol/L和3 μmol/L氯化镉暴露24 h会显著减少神经元突起总长度,并且3 μmol/L的氯化镉组在8 h神经元突起的总长度已经受到明显抑制。随着处理时间延长,抑制程度加深,并呈现剂量依赖特性(图 2A、B)。此外,神经元突起的分枝点数目也受到明显影响(图 2C),但是统计学差异发生的时间较总长度受抑制发生的时间更长,提示神经元突起的长度可能对镉暴露更为敏感。
2.3 氯化镉暴露显著抑制神经元溶酶体的功能
通过测定氯化镉暴露24 h对神经元CTSB和CTSD活性的影响,以判断镉暴露对神经元溶酶体水解功能的影响。结果显示,与0 μmol/L氯化镉(对照组)相比,2、3 μmol/L氯化镉处理显著抑制神经元溶酶体CTSB的活性,但是对CTSD活性没有影响(图 3A、B)。LysoSensor Green DND-189探针具有向酸性,能针对性地结合活细胞中的酸性区室,随着细胞器的酸化程度增高其荧光强度越强,常用来反映细胞溶酶体的pH值改变情况。与0 μmol/L氯化镉(对照组)相比,2、3 μmol/L氯化镉处理组相对荧光强度显著降低,说明镉暴露后神经元溶酶体pH值增高,并呈剂量依赖,提示其酸性环境的丧失(图 3C)。LysoTrackerTM Red DND-99探针免疫荧光检测结果显示,镉暴露显著抑制了该探针的荧光强度,与Lyso Sensor Green DND-189检测结果一致(图 3D、E),进一步确定镉暴露可以破坏神经元溶酶体的酸性环境。
2.4 氯化镉暴露可显著抑制神经元KIF5A mRNA及蛋白的表达
与0 μmol/L氯化镉(对照组)相比,镉暴露神经元24 h,显著抑制KIF5A分子的mRNA转录水平并呈剂量依赖特征(图 4A)。此外,经内参校正Western blot分析结果显示,镉暴露也显著抑制KIF5A的蛋白翻译水平(图 4B、C),提示KIF5A的表达减少可能是镉诱导神经元溶酶体功能受损的重要因素。
2.5 过表达KIF5A可以显著拮抗氯化镉暴露损伤的神经元溶酶体功能
结果显示,含KIF5A过表达载体的腺病毒感染神经元可以显著提高KIF5A的表达效率(图 5A),而过表达KIF5A显著扭转镉暴露对神经元CTSB活性的抑制(图 5B)、增高镉暴露后LysoSensor Green DND-189和LysoTrackerTM Red DND-99的相对荧光强度(图 5C~E)。提示过表达KIF5A能明显拮抗镉暴露诱导的神经元溶酶体CTSB活性的降低和溶酶体酸性环境的破坏。
2.6 过表达KIF5A可以显著改善氯化镉暴露诱导的神经元活力损伤和突起生长抑制
如图 6A所示,过表达KIF5A显著拮抗镉暴露对神经元细胞活力的抑制。同时IncuCyte ZOOM检测及分析结果显示,与氯化镉处理组相比,过表达KIF5A+镉处理组神经元突起生长的总长度更长,分枝点数目更多(图 6B)。提示过表达KIF5A可显著改善溶酶体功能,进而拮抗镉暴露对神经元细胞活力和突起生长的抑制。
3 讨论
镉可以透过血脑屏障,在脑组织中进行蓄积,并引起一系列的神经症状,包括头痛头晕、帕金森样症状、学习障碍等。虽然镉的神经毒性已经被广泛报道,但是其神经毒理机制仍然不清楚。本研究从C57BL/6J新生小鼠(P0~P1)中分离培养原代皮层神经元建立急性镉神经毒性的体外模型,发现该暴露模式下,急性镉暴露显著诱导小鼠神经元溶酶体功能损伤,显著抑制神经元的细胞活力及其分化。同时发现KIF5A介导的溶酶体功能与镉神经毒性密切相关。本结果进一步拓展了镉的神经毒理机制。
原代神经元一直被广泛应用于镉神经毒理学的研究。以往研究多关注镉对大鼠原代皮层神经元的影响。WANG等[13]研究发现20 μmol/L镉暴露SD大鼠胚胎鼠原代神经元24 h后,细胞存活率约为60%。TANG等[14]结果则显示10 μmol/L镉暴露SD大鼠新生鼠原代神经元24 h后,细胞活力下降约为40%。本研究利用C57BL/6J新生小鼠(P0~P1)中分离培养原代皮层神经元建立急性镉神经毒性的体外模型,结果显示氯化镉在小鼠原代皮层神经元IC50值为2.9 μmol/L,与大鼠相比,小鼠的神经系统对于镉的敏感性更好,可能是评估镉神经毒性更好的体外模型。
溶酶体被称为细胞中的终末降解站,可动态响应多种细胞程序,特别是自噬[7]。由溶酶体中可溶性水解酶、膜蛋白或辅助蛋白的异常所引起的溶酶体功能障碍与多种神经病理学有关,例如典型的溶酶体贮积病[15]。溶酶体功能损伤与很多环境污染物的神经毒理机制同样密切相关。ZHI等[16]研究发现锰暴露的SK-N-SH细胞出现溶酶体样结构或酸性囊泡的积累,LAMP1表达的增加及CTSD活性的下降。GU等[17]研究发现铅暴露会改变溶酶体的pH值,溶酶体标志蛋白LAMP1下降,进而促进神经细胞死亡。我们前期结果已经在Neuro-2a细胞上证实镉可以诱导神经细胞株溶酶体功能损伤[8-9]。本研究在原代神经元模型中的验证结果与此一致,显示镉暴露后抑制神经元溶酶体CTSB的活性和改变其酸性环境,进一步明确溶酶体功能损伤在镉神经毒性中的重要作用。
驱动蛋白超家族(kinesin superfamily proteins,KIF)是细胞内重要的马达分子,在细胞内沿着微管转运包括mRNA、蛋白复合体、细胞器在内的多种货物,对维持细胞的正常功能发挥不可替代的作用[18]。在哺乳动物中,KIF5A属于kinesin-1家族且在神经元中明显高表达。KIF5A突变与多种神经疾病密切相关,包括肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、遗传性运动和感觉神经病以及遗传性痉挛性截瘫等[19]。研究显示,在新生小鼠缺少KIF5A基因会直接死亡,而在KIF5A条件敲除的小鼠则会出现异常的神经纤维缠结,可表现为颤抖、癫痫、学习记忆功能减退等,表明KIF5A对于维持神经元稳态和功能有非常重要的作用[20]。KIF5A参与运送包括线粒体、溶酶体在内的多种细胞器或分子以维持神经细胞功能。文献[21]报道阿尔兹海默症尸检者的颞叶区会出现KIF5A蛋白的减少,β-淀粉样蛋白暴露的原代神经元会出现线粒体轴突转运障碍和线粒体功能损伤。本课题组前期研究发现三甲基氯化锡暴露会抑制KIF5A蛋白的表达,从而诱导溶酶体顺向转运障碍,溶酶体功能受损,自噬流受阻,导致神经细胞的死亡[11]。本研究进一步明确镉暴露会抑制KIF5A蛋白的表达,过表达KIF5A可以显著改善镉暴露对神经元组织蛋白酶活性CTSB的抑制、稳定镉暴露造成的溶酶体pH值改变、拮抗镉暴露对神经元细胞活力及突起生长的抑制作用,提示KIF5A可能是环境重金属神经毒性的共同作用靶点。
本研究也存在以下不足:在模型中通过LysoTrackerTM Red DND-99染色仅能描述镉暴露显著改变溶酶体的酸性环境,而不能较好地显示镉暴露对溶酶体分布情况及其轴突转运功能的影响。下一步我们将结合活细胞工作站,开展镉暴露对溶酶体的轴突顺向或逆向转运功能影响的相关研究。此外,KIF5A如何调控溶酶体功能的机制,是否可以直接改变溶酶体V-ATP酶的活性亟需深入的探讨。
综上,本研究发现镉暴露诱导神经元分化障碍和细胞死亡,KIF5A介导的溶酶体功能可能是镉急性神经毒性的重要靶点。揭示镉神经毒理作用的细胞靶点及分子机制,为开展镉神经毒性治疗和药物的研究提供实验依据。
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