2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院生物化学与分子生物学教研室
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
在全球癌症统计报告中，结肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、病死率均排前3位[1]。手术、化疗和放疗是CRC临床治疗的主要手段，而复发转移是CRC患者预后差的主要原因[2]。因此，探寻CRC进展的基础机制，有望为CRC的临床防治提供理论依据。
与其他实体肿瘤一样，CRC的发生发展依赖其特有的肿瘤微环境。代谢重编程是肿瘤微环境的重要特征[3]。研究表明，脂代谢重编程调控了CRC的发生发展。脂类包括甘油三酯、磷脂和胆固醇。我们前期研究发现，调控甘油三酯和磷脂代谢的酶在CRC微环境中异常表达，如含自水解酶域蛋白5(alpha/beta hydrolase domain-containing protein 5，ABHD5)[4]、单酰甘油脂酶(monoacylglycerol lipase，MGLL)[5]及1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶4(1-acyl-sn-glycerol-3-phospate-acyltransferaseδ，AGPAT4)[6]的异常表达直接或者间接调控了CRC的发生发展。然而，胆固醇代谢相关的酶在CRC进展中的作用尚不明确。
胆固醇是一种重要的生物分子，涉及人类健康和疾病的各个方面[7]。胆固醇稳态失衡将导致众多疾病，如神经退行性疾病和癌症[8]。法呢基二磷酸酯法呢基转移酶1 (farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1，FDFT1)是胆固醇内源性合成途径中的重要酶分子，其通过两步反应催化两分子焦磷酸法尼酯二聚生成角鲨烯[9-10]。报道显示，FDFT1在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和食道癌等多种癌症中表达异常，其被认为可能是癌症进程的生物标志和潜在的治疗靶点[11]。然而，FDFT1在CRC进展中的作用尚不清楚。本研究将探析FDFT1在CRC中的表达情况及其对CRC细胞生物学行为的调控作用，为CRC的临床防治提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞小鼠CRC细胞系MC-38由本实验室保存。
1.1.2 动物C57BL/6雄性小鼠购自陆军军医大学实验动物中心，重度免疫缺陷NCG小鼠(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)购自National Model Animal Resource Information Platform。所有实验动物由陆军军医大学代养。
1.1.3 试剂DMEM高糖培养基、胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；PBS、0.25%胰酶购自美国Hyclon公司；100×青-链霉素双抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、DEPC水、结晶紫染色液购自上海碧云天公司；m-FDFT1sh-RNA慢病毒及对照空载病毒购自上海汉恒生物公司；电泳凝胶试剂盒购自上海雅酶生物有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；FDFT1一抗购自美国Novus Biologicals公司；GAPDH一抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗购自中国Proteintech公司；ECL显色试剂盒购自重庆葆光生物公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购自成都科龙公司；反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；CCK-8试剂盒、凋亡检测试剂盒购自美国Biolegend公司；Transwell实验板购自美国Corning公司；4%多聚甲醛购自中国Biosharp；无胰岛素注射器、FDFT1(小鼠)和GAPDH(小鼠)引物购自上海生工生物工程股份有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养MC-38细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，置于5% CO2、37 ℃孵箱中培养。每日观察，培养基变黄换液，细胞生长至90%时传代。
1.2.2 构建FDFT1沉默的MC-38细胞系待MC-38细胞处于对数生长期，铺6孔板。细胞密度生长至50%左右，弃去旧培养基，加入1 mL新鲜培养基，加入带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的小鼠shRNA-FDFT1慢病毒及对照病毒，放回孵箱继续培养。感染4 h后每孔补加1 mL新鲜培养基至正常体积，继续培养。感染24 h后更换新鲜培养基继续培养。感染72 h后在荧光显微镜下观察感染效率。之后用含puromycin培养基筛选感染细胞，得到稳定低表达FDFT1的MC-38细胞系(sh-FDFT1组)和空载对照细胞系(sh-NC组)。后续实验均按此分组。
1.2.3 数据库分析FDFT1与CRC关系通过数据库GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) (cancer-pku.cn)及The Human Protein Atlas综合分析得到FDFT1在CRC的表达情况。
1.2.4 RNA提取与RT-qPCR收集稳定转染的sh-FDFT1和sh-NC细胞，使用TRIzol法提取细胞总RNA。按照TaKaRa反转录试剂盒说明，以1 μg RNA为上样量，PCR程序为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。随后进行RT-qPCR，将成功反转录的cDNA作为模板，引物为GAPDH、FDFT1，序列如下：FDFT1上游5′-AGAGTGGCGGTTCACTGAGA-3′，下游5′-GAGAA-AGGCCAATTCCCACCA-3′；GAPDH上游5′- TGTGTC-CGTCGTGGATCTGA-3′，下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′。根据TaKaRa荧光定量PCR试剂盒方案进行加样，执行PCR程序：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，重复40个循环；4 ℃保存。实验结果按照相对定量法2-ΔΔCt进行统计。
1.2.5 Western blot检测收集sh-FDFT1和sh-NC细胞，冰上提取细胞总蛋白，BCA法定量后将蛋白标定为同一浓度后制成Western blot样品。取出提前配制好的SDS-PAGE凝胶，按30 μg标准点样，电泳条件为80 V 30 min，用120 V电压使样品跑至凝胶底部。结束电泳后取出凝胶，将凝胶和PVDF膜正确摆放至湿转装置中，200 mA 90 min。取出PVDF膜放至5% 脱脂奶粉中封闭1 h。封闭后将膜转移至一抗稀释液中，4 ℃慢摇过夜。次日，将膜在PBST中漂洗，每次10 min，重复3次。完成后加入对应的二抗，室温孵育1 h，洗膜后在化学发光仪上观察结果。一抗、二抗稀释比例均按照抗体说明书操作。
1.2.6 CCK-8实验取对数生长期的sh-FDFT1和sh-NC细胞，在96孔板中接种两种细胞，每孔100 μL细胞悬液(3 000个细胞)，混匀后放于5% CO2、37 ℃孵箱培养。2 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀，继续培养1 h后，在450 nm波长下测定吸光度作为基值。按同样方法测定培养24、48、72、96 h后吸光度，统计出增殖结果曲线。
1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡收集生长状态良好的细胞sh-FDFT1、sh-NC(细胞数>106)及上清。4 ℃，500×g离心5 min, 弃上清。加入90 μL 1×Binding Buffer、5 μL APC-Annein V、5 μL PI，重悬细胞。4 ℃避光孵育15 min，然后用200目滤网过滤，30 min内上机检测。
1.2.8 Transwell实验消化sh-FDFT1、sh-NC细胞成细胞悬液，1 000 r/min, 离心5 min，弃上清。加入无血清培养基重悬，计数，制成浓度为500个/μL的细胞悬液，每个Transwell小室上室加入200 μL无血清细胞悬液，下室加入500 μL完全培养基。培养24 h后，取出用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，风干后显微镜200倍下观察并记录结果。
1.2.9 小鼠CRC动物模型建立小鼠CRC细胞系MC-38来源于雌性C57BL/6小鼠经化学药物诱导产生的一种结肠腺癌，二者具有相同的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)背景，后被用作可移植的CRC小鼠模型[12-14]。取生长状态良好的sh-FDFT1、sh-NC细胞消化，离心。加入PBS重悬，计数，制成4×107/mL的细胞悬液。小鼠CRC腹腔种植转移模型：取6~8周龄雄性C57BL/6小鼠或NCG小鼠，每只小鼠腹腔注射4×106个细胞。接种14 d后处死荷瘤小鼠，观察模型构建情况。小鼠皮下移植瘤模型：在每只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠左腿腹股沟处皮下注射4×106个细胞，余同小鼠CRC腹腔种植转移模型。
1.3 统计学分析实验数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行分析，组间采用双侧非配对t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FDFT1在CRC组织中的表达为探究FDFT1基因与CRC恶性进展的关系，通过GEPIA数据库(cancer-pku.cn)对275例CRC样本和349例正常组织样本分析，发现FDFT1在CRC组织中表达异常上调(P < 0.05，图 1A)。通过The Human Protein Atlas数据库发现男性或女性患者CRC肿瘤组织免疫组化染色中FDFT1蛋白均呈现高表达(图 1B、C)。
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| A：GEPIA数据库对CRC FDFT1相对表达量分析a：P < 0.05；B、C分别为：数据库中免疫组化观察男性与女性CRC组织FDFT1的表达 图 1 FDFT1在CRC组织中的表达情况 |
2.2 FDFT1敲低细胞系的建立与验证
通过慢病毒shRNA感染系统，在小鼠CRC细胞系MC-38中敲减FDFT1, 得到低表达FDFT1的MC-38细胞系(sh-FDFT1组)；转染空载病毒得到对照细胞(sh-NC组)。为了验证敲减效率，取两种细胞进行RT-qPCR及Western blot实验，检测mRNA及蛋白水平变化，结果显示sh-FDFT1组FDFT1 mRNA及蛋白表达均显著降低(P < 0.05，图 2)，表明敲低FDFT1的MC-38细胞系构建成功。
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a: P < 0.05，与sh-NC组比较 A：RT-qPCR检测MC-38细胞FDFT1敲低后FDFT1 mRNA表达；B：Western blot检测MC-38细胞FDFT1敲低后FDFT1蛋白表达；C：FDFT1蛋白表达半定量分析 图 2 FDFT1敲低细胞系的建立与验证(n=3, x±s) |
2.3 敲低FDFT1对MC-38细胞增殖的影响
CCK-8实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-FDFT1组在0、24、48、72、96 h细胞增殖活性的差异均无统计学意义(P>0.05，图 3)。
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| 图 3 敲低FDFT1对MC-38细胞增殖的影响(n=4，x±s) |
2.4 敲低FDFT1对MC-38细胞凋亡的影响
流式细胞术结果显示，与sh-NC组相比，sh-FDFT1组细胞凋亡活性(总凋亡率)没有明显差异(P>0.05, 图 4)。
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| A：敲低FDFT1后MC-38细胞凋亡流式结果；B：细胞总凋亡结果统计(n=3，x±s) 图 4 敲低FDFT1对MC-38细胞凋亡的影响 |
2.5 敲低FDFT1对MC-38细胞迁移的影响
Transwell实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-FDFT1组穿过上室的细胞数无明显差异(P>0.05, 图 5)。
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| A：敲低FDFT1后MC-38细胞Transwell实验、结晶紫染色观察结果(×200)；B：穿过细胞数统计(n=3，x±s) 图 5 敲低FDFT1对MC-38细胞迁移的影响 |
2.6 FDFT1敲低可抑制肿瘤生长
将sh-FDFT1组及sh-NC组细胞同时在6~8周龄雄性C57BL/6小鼠构建CRC腹腔种植转移模型(图 6A、B)及皮下移植瘤模型(图 6C、D)，接种14 d后处死荷瘤小鼠。两种模型结果均显示敲低FDFT1后MC-38细胞的致癌能力减弱，肿瘤质量也明显减少(P < 0.05, 图 6)。
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a: P < 0.05，与sh-NC组比较 A：C57BL/6小鼠腹腔种植sh-NC组或sh-FDFT1组细胞构建CRC腹腔种植转移模型B：CRC腹腔种植转移模型小鼠肿瘤质量统计；C：C57BL/6小鼠左腿腹股沟处皮下接种sh-NC组或sh-FDFT1组细胞构建CRC皮下移植瘤模型1~5：分别表示14 d后5只小鼠移植瘤生长情况；D：CRC皮下移植瘤模型小鼠肿瘤质量统计 图 6 敲低FDFT1抑制MC-38移植瘤的生长(n=5，x±s) |
2.7 敲低FDFT1后不影响MC-38移植瘤在NCG小鼠中的进展
在重度免疫缺陷NCG小鼠上接种sh-FDFT1组及sh-NC组细胞构建小鼠CRC腹腔种植转移模型。接种14 d后处死荷瘤小鼠，结果显示，与sh-NC组相比，sh-FDFT1组肿瘤生长大小及质量没有显著差异(P>0.05, 图 7)。
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| A：NCG小鼠腹腔种植sh-NC组或sh-FDFT1组细胞构建CRC腹腔种植转移模型；B：小鼠肿瘤质量统计 图 7 NCG小鼠荷瘤的生长情况(n=6，x±s) |
3 讨论
代谢重编程是癌细胞面对恶劣的生存环境选择的有利于自身增殖或迁移的一种新的代谢程序，可表现在代谢途径改变及代谢酶的异常表达。由许多代谢改变和引起的异常表观调控在很多癌症中是相似的，因此它们被认为是癌症治疗的新靶点[15]。CRC是危害人类健康的重大疾病，使用传统手术等治疗方式时疾病大多已处于晚期，患者愈后不佳[16]。因此，将注意力放在CRC异常代谢分子可提前预知并干预其发生，有可能为CRC的临床预防与治疗提供一个新的策略。
FDFT1是胆固醇代谢途径的一个重要酶分子，作用于甲羟戊酸途径的一个分支[17]。越来越多证据表明，FDFT1在癌症中起着关键作用，尤其是代谢重编程、细胞增殖和侵袭[18]。之前的研究表明，FDFT1在高侵袭性前列腺癌中表达水平明显升高，抑制FDFT1的表达能抑制前列腺癌细胞的增殖[19]。在耐药研究中也发现FDFT1与卵巢癌存在潜在关联[20]。但FDFT1在CRC中的作用尚不完全清楚。因此我们选择FDFT1为靶基因，探究其与CRC的联系。本研究首先通过在线数据库发现FDFT1在CRC组织中表达上调，提示FDFT1与CRC进展相关。
为了探究FDFT1与CRC进展的进一步机制，构建FDFT1低表达MC-38细胞系。在小鼠荷瘤实验中，C57BL/6小鼠腹腔及皮下同时接种对照细胞和FDFT1敲低细胞，两处荷瘤模型均显示实验组小鼠肿瘤生长受到明显抑制，表明敲低MC-38细胞FDFT1可抑制CRC进展。然而在体外细胞实验中，MC-38细胞敲低FDFT1后，细胞增殖、凋亡及迁移均没有明显变化。因此，我们猜想敲低FDFT1影响CRC生长可能是受到肿瘤微环境中除肿瘤细胞本身之外的其他组分的影响。NCG小鼠是固有免疫系统及适应性免疫系统均受损的重度免疫缺陷小鼠，本研究通过构建NCG小鼠CRC腹腔转移模型，发现FDFT1对MC-38细胞成瘤能力没有显著影响，表明敲低MC-38细胞FDFT1抑制CRC进展可能通过调控肿瘤微环境来实现。最近有研究报道小鼠禁食后可通过FDFT1介导的AKT/mTOR/HIF1α途径抑制CRC细胞有氧糖酵解和增殖[21]。我们和其他团队的结果提示不同的细胞类型可能呈现不同的分子调控机制。这可能与FDFT1的多态性有关，FDFT1基因的遗传多样性在癌症和丙型肝炎等疾病中已有部分研究[22]。例如，研究丙型肝炎患者FDFT1基因的SNPrs2645424多态性，发现该多态性与患者肝脏进行性纤维化有关，而与脂肪肝无关[23]。在前列腺癌中，FDFT1基因的rs2645429多态性与癌症进展和侵袭性表型相关[19]。另一方面，CRC具有分子异质性，可分为与患者预后和治疗相关的临床亚型。在DNA水平上，MC-38细胞属于微卫星不稳定型突变(microsatellite-instable，MSI), 对超突变/微卫星不稳定CRC的建模有效，而CT-26细胞属于染色体不稳定型突变(chromosomal instability，CIN)[12-14]。CRC根据共识分子亚型又分为4型，其中多数MSI集中在免疫表型，表现为高度的免疫原性[24]。因此，本研究亚型特异可能有助于临床实验设计和术后辅助治疗决策。
肿瘤微环境是由肿瘤细胞和其周围的免疫细胞、炎症细胞、成纤维细胞、附近的间质组织、微血管以及各种细胞因子和趋化因子等构成的复杂综合系统[25-27]。肿瘤微环境中肿瘤细胞本身可以形成一个免疫抑制的微环境，这种恶劣的环境迫使浸润的免疫细胞发生与免疫耐受表型相关的适应性代谢，最终免疫细胞的代谢变化可能会破坏抗肿瘤免疫反应的有效性[28]。本研究提出了胆固醇合成途径分子FDFT1可能通过影响肿瘤免疫微环境来调控肿瘤生长。胆固醇合成和代谢中间体在控制细胞增殖、迁移、耐药及干性中发挥作用。当胆固醇稳态被破坏，异常代谢过程可重新塑造免疫反应性，并且胆固醇衍生物可以调节肿瘤免疫或免疫逃逸，在免疫监视中起关键作用[29-31]。有研究报道，乳腺癌中27-羟基胆固醇依赖肝脏X受体通过巨噬细胞等削弱T细胞的扩增和细胞毒性功能，并且靶向抑制其合成酶细胞色素P450家族成员27A1(cytochrome P450 family 27 subfamily A member 1，CYP27A1)可减少肿瘤转移性生长[32-33]。最近，中和髓源性抑制细胞产生的代谢物甲基乙二醛活性可以提高癌症免疫治疗的疗效[34]。越来越多的证据表明，针对肿瘤微环境的疗法可以补充传统治疗方式，改善恶性肿瘤的治疗结果[35]。在后续的研究中，我们将深入研究CRC细胞FDFT1调控CRC微环境免疫的具体机制。本研究有望为探索基于CRC代谢微环境的肿瘤防治策略提供新的理论依据。
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