肺癌是全球发病率第二高的恶性肿瘤，是癌症死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的85%，其中肺腺癌是NSCLC最常见的组织学亚型，且大多数患者发现时已处于晚期，五年生存率较低[2-3]。因此，深入阐明肺腺癌的发生发展机制，寻找更多关键的治疗靶点，对临床诊疗及改善患者预后具有十分重要的意义。RNA编辑是一种重要的基因转录后修饰方式，癌症的发生发展与异常的基因表达调控密切相关[4]。RNA特异性腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA-1，ADAR1)是一种作用于双链核糖核苷酸(double-stranded RNA，dsRNA)使腺苷脱氨基产生肌苷(adenosine- to-inosine，A-to-I)，最后导致蛋白质中氨基酸改变的RNA编辑酶[5]。研究表明，ADAR1能通过诱导抗酶抑制因子1(antizyme inhibitor 1，AZIN1)过表达促进NSCLC的恶性进展[6]，其表达水平变化还与黑色素瘤[7]、食管鳞状细胞癌[8]、乳腺癌[9]、宫颈癌[10]和多发性骨髓瘤[11]等癌症的发生发展密切相关，且ADAR1在肿瘤中过表达可使肿瘤细胞逃避免疫识别[12]。然而，肺腺癌组织中ADAR1的表达及其与患者临床病理特征的国内相关性研究鲜有报道。因此，本研究采用免疫组织化学染色法，检测肺腺癌患者组织中ADAR1的表达水平，分析其与临床病理特征及预后的关系，旨在为肺腺癌的诊断和治疗提供一定的思路。
1 材料与方法 1.1 研究对象及临床资料收集2015年12月至2017年9月于本院行肺切除术的131例肺腺癌患者组织标本，包括癌组织和癌旁组织(距离病灶约2 cm、部分采用免疫组化ABC法染色，光镜下呈现阳性反应)。切除标本HE染色后由资深病理科医师进行诊断。部分组织制作成2个组织芯片蜡块。
1.2 免疫组织化学方法检测肺腺癌组织中ADAR1蛋白表达水平 1.2.1 免疫组化染色用PBS将肺腺癌组织和癌旁组织洗净，室温下于4%多聚甲醛中过夜固定，脱水后用石蜡包埋以得到4 μm石蜡切片。使用S-P免疫组化试剂盒(S-P9001，中杉金桥)，根据使用说明进行免疫组化染色。首先将切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3% H2O2封闭10 min，10 mmol/L枸橼酸钠中微波加热15 min进行抗原修复。然后，4 ℃条件下将切片与兔抗ADAR1多克隆抗体(1 ∶400，货号：81284，Cell Signaling Technology)过夜结合。随后室温下用结合辣根过氧化物酶的二抗与切片反应30 min，并用DAB显色试剂盒(ZLI-9017，中杉金桥)显色。最后用苏木精染料(ZLI-9610，中杉金桥)进行复染以及用中性树脂(G8590，Solarbio)封片。
1.2.2 染色结果判定由两位经验丰富的病理学专家行双盲免疫组化结果评分(immunoreaction score, IRS)。包括细胞染色强度评分(0分：无细胞染色，1分：浅棕色颗粒，2分：棕黄色颗粒，3分：棕褐色颗粒)以及阳性细胞所占比例评分(0分：≤5%，1分：>5%~ 25%，2分：>25%~ 50%，3分：>50%~75%，4分：>75%)。最终结果为两项评分的乘积，0~7分为低表达，8~12分为高表达。
1.3 统计学处理使用SPSS 15.0对数据进行统计分析，用Image J (National Institutes of Health)分析免疫组织化学染色结果。结果以x±s表示，两组间均数比较采用t检验，单因素分析采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，拟合Cox回归分析模型。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 ADAR1在肺腺癌及癌旁组织中的表达利用免疫组织化学染色检测131例配对的肺腺癌组织和癌旁组织中ADAR1蛋白表达情况。结果表明，ADAR1蛋白阳性染色主要定位于细胞核，阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒(图 1A)。肺腺癌组织中ADAR1高表达共102例(77.9%)，而癌旁组织中仅21例(16.0%)，两者差异有统计学意义(P < 0.001，图 1B)。
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| A：免疫组化观察ADAR1表达；B：免疫组化染色IRS评分a：P < 0.001 图 1 ADAR1在肺腺癌组织和癌旁组织中表达 |
2.2 ADAR1蛋白表达与患者临床病理参数的关系
进一步分析ADAR1表达与患者临床病理资料发现，肺腺癌组织中ADAR1蛋白表达与临床分期(P < 0.05)、淋巴结转移(P < 0.05)呈正相关, 即其表达水平愈高，肺腺癌临床分期愈晚，更易发生淋巴结转移；与患者年龄、性别等其他临床病理特征无显著相关性(P>0.05，表 1)。
| 临床病理特征 | n | 高表达 | 低表达 | P |
| 年龄(岁) | 0.834 | |||
| < 63 | 61 | 47 (77.0) | 14 (23.0) | |
| ≥63 | 70 | 55 (78.6) | 15 (21.4) | |
| 性别 | 0.195 | |||
| 男 | 59 | 49 (83.0) | 10 (17.0) | |
| 女 | 72 | 53 (73.6) | 19 (26.4) | |
| 淋巴结转移 | 0.01 | |||
| 无转移 | 92 | 66 (71.7) | 26 (28.3) | |
| 有转移 | 39 | 36 (92.3) | 3 (7.7) | |
| T分期 | 0.259 | |||
| T1 | 64 | 46 (71.9) | 18 (28.1) | |
| T2 | 43 | 35 (81.4) | 8 (18.6) | |
| T3 | 16 | 13 (81.2) | 3 (18.8) | |
| T4 | 8 | 8 (100.0) | 0 (0.0) | |
| N分期 | 0.506 | |||
| N0 | 92 | 72 (78.3) | 20 (21.7) | |
| kN1 | 29 | 21 (72.4) | 8 (27.6) | |
| N2 | 10 | 9 (90.0) | 1 (10.0) | |
| M分期 | 0.065 | |||
| M0 | 120 | 91(75.8) | 29(24.2) | |
| M1 | 11 | 11 (100.0) | 0 (0.0) | |
| 临床分期 | 0.014 | |||
| Ⅰ期 | 63 | 42 (66.7) | 21 (33.3) | |
| Ⅱ期 | 41 | 34 (82.9) | 7 (17.1) | |
| Ⅲ期 | 16 | 15 (93.8) | 1 (6.2) | |
| Ⅳ期 | 11 | 11 (100.0) | 0 (0.0) |
2.3 ADAR1蛋白的表达与肺腺癌患者总生存期的关系
为了明确ADAR1表达与患者预后的关系，采用Kaplan-Meier法分析131例肺腺癌患者ADAR1表达与总生存期(overall survival，OS)的关系。结果显示ADAR1高表达患者OS显著低于ADAR1低表达患者(HR=2.671，95%CI：1.282~5.563；P < 0.01；图 2)。在有淋巴结转移和临床分期Ⅲ、Ⅳ期的肿瘤患者中ADAR1高表达组和低表达组的生存曲线分布差异无统计学意义(P>0.05)，而在无淋巴结转移和临床分期Ⅰ、Ⅱ期的患者中ADAR1高表达组与低表达组的生存曲线分布差异有统计学意义(P=0.035、P=0.015)，表现为ADAR1高表达组的生存状况差于ADAR1低表达组患者。表明在无淋巴结转移和临床分期Ⅰ、Ⅱ期的肿瘤患者中ADAR1高表达更具有作为预后不良指标的意义(图 2)。
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| A: ADAR1表达对全部患者OS的影响；B: 对无淋巴结转移患者OS的影响；C: 对临床分期Ⅰ期和Ⅱ期患者OS的影响 图 2 ADAR1表达与患者生存曲线 |
2.4 ADAR1蛋白表达作为临床诊断和预后指标的多因素分析
结合免疫组化结果，单因素Cox模型分析显示，肺癌患者的临床分期、ADAR1的表达和有无淋巴结转移均与肺腺癌患者的OS率显著相关；Cox多因素回归分析结果亦显示，淋巴结转移和临床分期是肺腺癌患者预后的危险因素，此结果说明淋巴结转移与临床分期可作为肺腺癌患者预后评估的独立危险因素(表 2)。
| 临床参数 | 单因素分析 | 多因素分析 | |||
| HR(95%CI) | P | HR(95%CI) | P | ||
| 淋巴结转移 | 4.958(2.507~9.804) | < 0.001 | 4.746(1.596~14.116) | 0.005 | |
| 临床分期 | 3.939(2.275~6.818) | < 0.001 | 3.218(1.502~6.896) | 0.003 | |
| ADAR1表达 | 8.901(1.216~65.157) | 0.031 | 2.081(0.248~17.469) | 0.500 | |
3 讨论
肺癌是癌症患者死亡的首要因素，具有高发病率和病死率，每年全球因肺癌死亡的患者约占所有癌症死亡患者总数的18%，居癌症年均死亡率之首[1]。这是由于肺癌早期患者往往没有症状，且确诊时常处于进展阶段。目前国内外与肺癌有关的基础研究一直是肿瘤研究的热点，但其发生发展机制尚不清楚。尽管早期筛查方法和检查手段不断革新，但肺癌仍表现出临床病程短和病死率高的特点。因此，快速寻求肺癌的敏感诊断指标和预后标志物具有重要的临床意义。
ADAR1是一种重要的RNA编辑酶，可催化RNA上腺嘌呤向次黄嘌呤转化(A-I)，并将次黄嘌呤与胞嘧啶进行配对，最后改变蛋白质中的氨基酸[13]。ADAR1主要功能是编辑内源的dsRNA和识别病毒的dsRNA[14]。同时ADAR1也在其他生物过程中以非RNA编辑的形式发挥作用，比如通过ADAR1的dsRNA结合区域，参与蛋白质-蛋白质相互作用[15]，从而调节各种免疫反应。研究表明，ADAR1介导的RNA编辑模式和活性在肿瘤组织与正常组织中有所不同[16-17]。
本研究通过组织芯片技术和免疫组化技术检测131例肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中ADAR1的表达，结合临床数据分析发现，癌组织中ADAR1表达的上调与临床分期、淋巴结转移、生存预后相关(表 1、图 2)，并且在肺腺癌临床分期Ⅰ、Ⅱ期和无淋巴结转移的肿瘤患者中ADAR1高表达更具有作为独立不良预后指标的意义(图 2)。这种预后差异的出现可能与ADAR1的表达和临床分期的相关性有关。Cox回归分析显示，肺腺癌患者的淋巴结转移情况和临床分期可共同作为临床预后指标。近年来有研究发现ADAR1可通过提高黏附激酶(focal adhesion kinase，FAK)mRNA的稳定性从而促进肺腺癌的侵袭和迁移，并且ADAR1在肺腺癌中的蛋白表达水平与患者预后密切相关[18]，与本研究结果具有一致性。这些结果提示ADAR1可能在肺腺癌的发生发展过程中起重要作用，为深入研究肺腺癌的不良预后标志物以及靶向治疗提供了新的思路和靶点。但本研究尚存在一定的局限性，未来可通过生物信息学分析，利用TCGA肺腺癌数据库等验证肺腺癌组织中ADAR1 mRNA及蛋白表达水平；同时，使用肺腺癌细胞系进行体外实验结合动物实验以深入研究ADAR1在肺腺癌发生发展过程中的具体作用及其相关机制，为肺腺癌的临床治疗和不良结局预防开辟新途径。
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