2. 730050 兰州,甘肃省妇幼保健院健康管理中心;
3. 730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第940医院基础医学实验室
2. Health Management Center, Gansu Provincial Hospital of Maternal and Child Health, Lanzhou, Gansu Province, 730050;
3. Laboratory of Basic Medical Scineces, No. 940 Hospital of Joint Logistic Support Force of Chinese PLA, Lanzhou, Gansu Province, 730050
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种因骨密度降低、骨量减少而导致骨折危险性增加的全身性骨骼疾病,然而目前尚无疗效显著、不良反应少、价格低廉的药物[1-2]。雌激素类药物治疗骨质疏松效果显著,但其会引起子宫内膜癌、乳腺癌、心血管疾病发生等一系列不良反应[3]。黄酮类化合物又被称为植物雌激素,具有很好的促进骨形成、抑制骨吸收的活性,是未来骨质疏松症替代疗法的首选药物之一。金雀异黄酮(Genistein,GEN)又称大豆异黄酮,具有预防绝经后骨质疏松的雌激素样活性作用[4-6]。本课题组前期体内实验表明GEN能够显著提高大鼠峰值骨量和抑制去卵巢大鼠骨丢失[7-8]。但是,对于其是如何提高大鼠骨密度,抑制去卵巢大鼠骨丢失的分子机理还不清楚。基于药物在体内代谢过程是一个含有成骨细胞、骨髓间充质细胞、破骨细胞和骨细胞的一个复合群体。我们假设,GEN抑制去卵巢大鼠骨丢失是通过提高其成骨细胞的增殖和成熟矿化能力来实现的。因此,本实验通过GEN体内实验的大鼠分离提取成骨细胞进行体外培养来研究其抗骨质疏松的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级2月龄健康雌性SD大鼠30只,购自甘肃中医药大学SPF级动物实验中心,许可证号SCXK(甘) 2015-2002,所有的动物实验遵照国家实验动物饲养和使用指南。
1.2 试剂与仪器GEN购自中国药品生物制品检定所(纯度>98%);α-MEM培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清FBS购自美国HyClone公司;Ⅰ型胶原(CollagenⅠ, ColⅠ)酶、胰蛋白酶购自美国Sigma公司;CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自日本Dojindo Laboratories公司。碱性磷酸酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;RNAiso Reagent、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、Easy Dilution稀释液均购自TaKaRa公司,引物由TaKaRa公司设计合成;茜素红购自Sigma公司;双能X射线骨密度仪购自美国GE公司;CO2细胞培养箱购自美国Thermo Revco公司;台式高速冷冻离心机购自德国Heraeus公司;紫外分光光度计购自美国Bio-Rad公司;实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司;酶标仪购自Bio-Rad公司。
1.3 方法 1.3.1 动物分组、造模及药物处理按照体质量均值将30只SD大鼠分为假手术(Sham)组、双侧卵巢切除(OVX)组和去卵巢+GEN(OVX+GEN)组,每组10只。各组大鼠腹腔注射3 mL/kg的10%水合氯醛进行麻醉。Sham组大鼠行卵巢周围少许脂肪组织切除,模型组大鼠切除双侧卵巢。抗炎症处理1周后,给予OVX+GEN组大鼠每日灌服25 mg/kg GEN,Sham组和OVX组灌服相应体积的蒸馏水。药物处理8周后进行后续实验操作。
1.3.2 大鼠全身骨密度测定大鼠腹腔注射3 mL/kg的10%水合氯醛进行麻醉,置于双能X射线骨密度仪检测全身骨密度,骨密度结果利用每平方厘米的骨质量来表示(单位为g/cm2)。
1.3.3 成骨细胞的分离与培养选取3只最接近各组骨密度平均值的大鼠麻醉后脱臼处死,置于75%酒精中浸泡消毒25 min后在超净工作台中,剔除肌肉和结缔组织后迅速剥离出股骨,并用磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.8) 清洗3次;将股骨剪碎大小约1 mm×1 mm×1 mm并转移至培养瓶中,后续实验步骤参照谢艳芳等[9]大鼠颅骨成骨细胞的分离培养方法。
1.3.4 HE染色和ColⅠ的免疫组化染色将P1代细胞进行爬片培养后分别进行成骨细胞HE染色和ColⅠ的免疫组化染色。①HE染色:向爬片滴加1 mL苏木精染液进行初染,10 min后流水冲洗,滴加盐酸酒精封化液封化1 s,将爬片立刻放入流水冲洗15 min。再加入1 mL伊红染液进行复染,5 min后依次经过低浓度到高浓度的酒精溶液进行脱水,每次2 min,最后于二甲苯溶液中浸泡2 min后封片。②ColⅠ免疫组织化学染色:滴加山羊血清工作液,37 ℃孵育15~20 min后倾去勿洗,加入ColⅠ抗体(1 ∶500) 并放置4 ℃过夜,PBS漂洗3次,每次3 min,之后滴加相应的二抗工作液,37 ℃孵育60 min,PBS漂洗3次,每次3 min,最后利用DAB显色剂进行显色,流水冲洗后封片,分别正置荧光显微镜观察细胞的形态。
1.3.5 CCK-8检测细胞增殖将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞以3×105/mL接种于96孔板中,向每孔中加入200 μL。分别培养3、6 d后,加入含有CCK-8试剂(6 μL/孔)的培养基,37 ℃孵育4 h之后用酶标仪测定波长450 nm处光密度值[D(450)]。
1.3.6 碱性磷酸酶活性检测将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞以5×105/mL分别接种于6孔板中[10],分别培养3、6 d后,弃去培养基,用PBS漂洗2次,按照ALP活性测定剂盒说明书检测胞内ALP活性,每孔蛋白浓度用BCA法进行测定,ALP活性根据每毫克蛋白催化生成酚的量来换算为nmol·15 min-1·mg-1。
1.3.7 RT-qPCR检测将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞以5×105/mL接种于6孔板中[5],培养24 h后,用TRIzol提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测浓度,并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。按照PCR扩增体系及反应条件说明书进行PCR扩增;分别利用BMP-2、Runx-2引物进行PCR反应制备标准曲线,经内参校正,分别求得目的基因的相对表达量。RT-qPCR数据分析采用2-ΔΔCt法,所用引物根据TaKaRa所发布的序列设计并合成(表 1)。
基因 | Genbank序列 | 引物序列 | 产物长度/bp |
BMP-2 | NM_017178 | 上游:5′-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3′ | 249 |
下游:5′-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3′ | |||
Runx-2 | NM-053470.1 | 上游:5′-GCACCCAGCCCATAATAGA-3′ | 165 |
下游:5′-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3′ | |||
GAPDH | NM-017008.3 | 上游:5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′ | 140 |
下游:5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′ |
1.3.8 钙化结节染色
将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞以3×105/mL接种于6 cm培养皿中,待细胞融合后更换成骨诱导培养液培养12 d后,弃去培养基,PBS清洗3次后,加入pH=8.9、0.1%的茜素红染色液,37 ℃水浴1 h,流水冲洗,换固定液照相记录结果,照相后采用Ipp (Image-Pro Plus 6.0)灰度分析软件,对各组钙化结节的面积进行统计。
1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件处理数据,结果以x±s表示,采用单因素方差分析进行方差齐性检验,方差齐者采用LSD检验,方差不齐者采用Tamhane’s检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 大鼠骨密度检测结果将Sham组、OVX组和OVX+GEN组的大鼠分别连续喂养8周之后,利用双能X射线骨密度仪检测大鼠全身骨密度。如图 1所示,与Sham组相比,OVX组骨密度显著降低(P < 0.01)。说明大鼠切除卵巢会导致骨密度降低,进而导致骨质疏松;而当服用25 mg/kg GEN后,OVX+GEN组骨密度显著高于OVX组(P < 0.01)。表明GEN对去卵巢大鼠所致的骨质疏松的骨密度有显著的治疗效果。
2.2 成骨细胞HE染色和ColⅠ的免疫组化染色结果
将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞进行爬片处理后,分别进行HE染色和免疫组织化学染色。HE染色结果表明,分离培养的成骨细胞培养48 h在显微镜下形态清晰呈长梭形、三角及成纤维细胞样(图 2A)。ColⅠ免疫组织化学染色结果显示,ColⅠ在成骨细胞表面高表达在显微镜下呈深棕黄色(图 2B);而ColⅠ和一些非胶原蛋白是成骨细胞分化的标记物,能反映成骨细胞分化表型特征。因此,本实验分离得到较纯的成骨细胞。
2.3 CCK-8细胞增殖检测结果
将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离的成骨细胞分别培养3 d后,通过CCK-8检测各组成骨细胞的增殖情况。结果显示,OVX组成骨细胞增殖能力(0.307±0.015)显著低于Sham组(0.347±0.025,P < 0.01),说明大鼠切除卵巢会导致其成骨细胞的增殖;而当大鼠服用GEN后,OVX+GEN组成骨细胞增殖能力(0.393±0.011)显著高于OVX(P < 0.01),增幅为28%。说明GEN可促进成骨细胞的增殖。
2.4 ALP活性检测结果将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离培养的成骨细胞分别培养3、6 d后,通过ALP检测试剂盒分别检测各组成骨细胞ALP活性。结果显示,OVX组分离得到的成骨细胞ALP活性显著低于Sham组(P < 0.01,表 2),当服用GEN后,OVX+GEN组ALP活性显著高于OVX组(P < 0.01,表 2),3、6 d的增幅分别为18.7%和41.1%。说明GEN可增加成骨细胞ALP的活性。
组别 | 3 d | 6 d |
Sham组 | 18.236±0.384 | 22.002 47±1.864 |
OVX组 | 16.143±0.197a | 18.238 08±1.140a |
OVX+GEN组 | 19.169±0.437b | 25.736 02±0.728b |
a:P < 0.01,与Sham组比较;b:P < 0.01,与OVX组比较 |
2.5 RT-qPCR检测结果
将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离的成骨细胞培养24 h后,通过RT-qPCR法检测成骨性相关因子Runx-2和BMP-2的基因表达情况。结果表明,OVX组成骨细胞的成骨性因子Runx-2和BMP-2基因表达显著低于Sham组(P < 0.01,图 3)。说明大鼠切除卵巢会抑制其成骨性相关因子Runx-2和BMP-2的基因表达;当服用GEN后,OVX+GEN组成骨细胞Runx-2和BMP-2基因表达量显著高于OVX组(P < 0.01,图 3)。说明GEN可显著促进去卵巢大鼠的成骨细胞成骨性因子Runx-2和BMP-2基因的表达。
2.6 钙化结节染色结果
将Sham组、OVX组和OVX+GEN组分离的成骨细胞进行成骨性诱导培养12 d后,通过茜素红染色法对成骨细胞进行钙化结节染色。如图 4A所示,肉眼所见OVX组钙化结节染色面积和数量较Sham组少,而OVX+GEN组钙化结节面积和数量较OVX组明显增多。说明大鼠切除卵巢会抑制其成骨细胞成熟矿化的能力;图 4B为钙化结节面积的量化结果,OVX组钙化结节面积显著低于Sham组(P < 0.01),OVX+GEN组钙化结节面积显著高于OVX组(P < 0.01)。说明GEN可显著提高去卵巢大鼠成骨细胞成熟矿化的能力。
3 讨论
OP是一种潜在的、渐进性的全身性骨骼疾病。据报道,在所有绝经后妇女所患疾病中,与骨质疏松症相关的疾病就占了一半[11]。补充雌激素治疗骨质疏松是常见的治疗手段,但长期服用会引发严重的毒副作用。植物雌激素作为一类杂环多酚类化合物,其主要来自于天然中草药植物的提取,却无明显的毒副作用。目前发现的具有活性单体的中药主要有黄酮类、香豆素类、二苯乙烯类和木脂素类四大类,因其结构和功能与人体雌激素17-β-雌二醇(E2)类似,可直接或间接作用于雌激素信号通路,以较低的亲和度与雌激素受体结合而发挥雌激素的作用,从而大大减少了雌激素在使用过程中带来的副作用,成为当前激素研究开发领域关注的热点[12-13]。
GEN又称染料木素,是大豆异黄酮的一种,具有抑制肿瘤生长、抗氧化、抑制血管生成及抗骨质疏松症等功效。研究报道,染料木素一种雌激素受体(ER)选择性结合的植物雌激素,与ERβ具有更大的亲和力。对骨细胞具有双重作用,能够抑制破骨细胞的骨吸收活性,刺激骨髓基质祖细胞(BMSCs)和成骨细胞的成骨分化和成熟[14-16]。韩桂秋等[17]研究报道,GEN能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖,并促进其向成骨细胞分化。成魁等[18]报道,GEN能够提高青年大鼠的峰值骨量,并能够抑制去卵巢大鼠的骨丢失。因此本研究设想,GEN提高青年大鼠的峰值骨量,抑制去卵巢大鼠的骨丢失,是由于GEN能够促进大鼠体内成骨细胞的增殖和分化,促进成骨细胞的矿化成熟而发挥作用的。
本实验通过检测大鼠全身骨密度后发现,去除卵巢后大鼠的骨密度与Sham组相比,骨密度显著降低;而灌胃GEN后,大鼠骨密度显著升高。说明GEN对治疗骨质疏松有显著效果,前期大量实验也证实了这一点[19]。ALP是成骨性分化的标志性指标,因此本实验以ALP作为一个衡量指标。结果表明,与Sham组相比,骨质疏松模型组的成骨细胞ALP活性明显降低,而当大鼠灌胃GEN后,其ALP活性显著增强。同时,Runx-2作为一个重要的成骨的转录因子,在骨代谢活性中起着很重要的作用,BMP-2也作为骨代谢活性的重要活性因子[20-21],因此,通过对其基因的表达来研究GEN对去卵巢大鼠成骨细胞成骨性分化的影响,结果与ALP活性变化一致。因此,我们推测GEN能够提高去卵巢大鼠骨密度是通过促进其成骨细胞成熟矿化的能力。
然而,GEN对去卵巢大鼠骨吸收是否具有抑制作用、对体外破骨细胞的培养是否也有作用,尚未可知。虽然周建等[21]研究报道,GEN能够抑制体外培养大鼠股骨组织的骨骺端和骨干吸收活性和促进其代谢活性。但分离培养GEN干预后的去势大鼠中的破骨细胞,检测其体外骨相关因子的变化,是否也可从骨吸收方面去阐释GEN治疗骨质疏松模型大鼠的作用机制,仍需去进一步探索。
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