宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌。大部分的宫颈癌组织中可检测到高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)[1]。宫颈高级别鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)是与宫颈浸润癌密切相关的癌前病变，该病变进展为宫颈癌呈现渐进性、阶段式的过程，若在早期筛查出疾病可阻断其进展。目前，临床多采用液基薄层细胞学检查(thinprep cytologic test，TCT)和HR-HPV联合筛查宫颈癌及癌前病变。然而，仍有部分宫颈癌患者未发现有HR-HPV感染[2]或者HPV呈阴性[3]。TCT最常见的异常结果有不能明确意义的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS)。ASCUS为细胞学筛查分流的标准，但是其诊断重复性差，易发生诊断不足或过度。对于ASCUS，若HR-HPV阳性(不分型)或HPV分型检测HPV16、18阳性，均应转诊阴道镜检查；若HR-HPV阴性，则1年后复诊[4]。然而，对于低危型HPV(low-risk HPV，LR-HPV)，甚至HPV阴性的部分人群仍然存在HSIL甚至宫颈癌的可能。为了避免HR-HPV阴性的宫颈HSIL患者漏诊，本研究总结了本院妇科门诊459例病理证实为HSIL的筛查资料，总结HPV分布特点、筛查结果及阴性HR-HPV患者细胞学和阴道镜的特点，现报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2019年1月至2020年8月在陆军军医大学第一附属医院妇科门诊诊断为“HSIL”患者的临床资料。纳入标准：①年龄≥18周岁；②临床资料有TCT、HPV检测和阴道镜下活检的结果，少数没有TCT记录的均因阴道排液或者接触性出血直接转诊阴道镜。排除标准：①妊娠期及月经期；②既往有宫颈病变、宫颈治疗和子宫切除病史。患者取宫颈活检时需签署知情同意书，该研究经本院伦理委员会批准(KY2019156)。
1.2 HPV检测试剂、仪器和程序HPV检测需基因组提取试剂盒、扩增试剂盒、杂交试剂盒(凯普生物科技股份有限公司)。依据标准程序，宫颈刷置于宫颈外口处轻刷并旋转数圈，取出宫颈刷放入专有保存液中，4~20℃保存，依次进行提取、扩增、杂交、显色和结果判定等试验。检测22种HPV基因，包括13种高危型(16、58、52、18、33、31、35、45、51、39、56、59、68)，9种低危型(6、82、53、73、66、11、61、42、43)。本研究中HR-HR指全部是高危亚型的HPV多重感染，HR-LR指多重感染中含有高危和低危，LR-LR指仅含有低危亚型的HPV多重感染。
1.3 TCT检测采用新柏氏公司提供的专用宫颈刷和细胞保存液，收集宫颈脱落细胞检测。依据TBS(The Bethesda System)分类标准，由1名病理医师对结果进行判读，异常结果包括：ASCUS、不能排除高度病变的不典型鳞状细胞(Atypical squamous cells：cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH)、不典型腺细胞(atypical glandular cells，AGC)、低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intra epithelial lesion，LSIL)、HSIL、宫颈鳞状细胞癌和腺癌细胞。
1.4 阴道镜检查及活检阴道镜检查不满意者采取多点取材活检、宫颈搔刮或锥切。阴道镜下宫颈鳞-柱交界部位暴露满意，无可疑病灶则不取活检。
1.5 宫颈癌筛查异常管理流程判定[5] 1.5.1 以HR-HPV作为初筛分流① 若HPV16/18阳性，直接转诊阴道镜；②其他HR-HPV阳性则以细胞学检查分流(ASCUS或≥ASCUS)。
1.5.2 以TCT作为初筛分流细胞学≥ASCUS或者TCT为ASCUS，同时HR-HPV(+)的均转诊阴道镜。
1.5.3 以TCT+HR-HPV联合筛查分流处理，联合筛查阳性转诊阴道镜包括：①HR-HPV(+)，细胞学ASCUS或≥ASCUS；②HPV16和18型阳性，同时细胞学(-)；③HR-HPV(-)，细胞学≥ASCUS。联合筛查阴性则随访，包括：①HR-HPV(-)，细胞学(-)；②HR-HPV(-)，同时细胞学病理为ASCUS；③除外HPV16、18型，其它HR-HPV(+)，同时细胞学(-)。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 24.0统计软件行分析，计数资料使用频数或百分率表示，采用χ2检验进行分析处理。样本量＜40或理论频数 < 1的采用Fisher确切概率法检验。所有的统计检验都是双侧的，检验标准α=0.05。
2 结果 2.1 HPV单一或多重感染以及HPV阴性分布共459例HSIL患者纳入研究，432例HPV感染阳性，单一感染为330例(71.90%)，多重感染102例(22.22%)；HR-HPV阴性37例(8.06%)，HPV阴性27例(5.88%)。全部病例含有高危型(即HR-HPV，HR-HR，HR-LR)共计422例(91.94%)，仅含有低危型(即LR-HPV，LR-LR)共计10例(2.18%)。
2.2 单一HPV感染中各亚型分布检出18种亚型，包括11种高危型和7种低危型。HR-HPV中感染率最多的是16型(45.76%)，而18型(5.45%)感染率明显低于58型(18.18%)和52型(15.15%)；LR-HPV感染率均较低。见表 1。
| HPV亚型 | 检出率 |
| HR-HPV | |
| 16 | 151(45.76) |
| 58 | 60(18.18) |
| 52 | 50(15.15) |
| 18 | 18(5.45) |
| 33 | 18(5.45) |
| 31 | 10(3.03) |
| 51 | 6(1.82) |
| 39 | 3(0.91) |
| 59 | 2(0.61) |
| 68 | 2(0.61) |
| 35 | 1(0.30) |
| LR-HPV | |
| 82 | 2(0.61) |
| 53 | 2(0.61) |
| 73 | 1(0.30) |
| 66 | 1(0.30) |
| 11 | 1(0.30) |
| 61 | 1(0.30) |
| 43 | 1(0.30) |
2.3 3种方法初筛分流的阳性率比较 2.3.1 以HR-HPV作为初筛分流
HPV16/18型阳性225例；HR-HPV阳性(除外HPV16/18型)，同时细胞学ASCUS或≥ASCUS有130例。阳性结果共计355例，阳性率77.34%(355/459)。HR-HPV阳性组TCT出现ASCH或LSIL或HSIL结果明显多于HR-HPV阴性组，差异有统计学意义(P < 0.05)。其余的TCT结果分布没有差异。见表 2、3。
| 组别 | n | 正常 | 无检验记录 | ASCUS | ASCH/LSIL/HSIL | AGC | ≥ASCUS |
| HR-HPV(+) | 422 | 62(14.7) | 90(21.3) | 62(14.7) | 201(47.6) | 7(1.66) | 270(63.98) |
| HR-HPV(-) | 37 | 2(5.4) | 7(18.9) | 3(8.1) | 25(67.6) | 0 | 28(75.68) |
| χ2 | 1.732 | 0.118 | 0.732 | 5.410 | - | 2.043 | |
| P | 0.188 | 0.731 | 0.392 | 0.02 | 1.0 | 0.153 |
| 组别 | n | 正常 | 无检验记录 | ASCUS | ASCH /LSIL/HSIL | AGC | ≥ASCUS |
| 16和/或18(+) | 225 | 44(19.6) | 41(18.2) | 29(12.9) | 105(46.7) | 6(2.67) | 140(62.2) |
| 16和/或18(-) | 197 | 18(9.14) | 49(24.9) | 33(16.75) | 96(48.7) | 1(0.51) | 130(65.99) |
| χ2 | 9.097 | 2.769 | 1.250 | 0.179 | 1.824 | 0.647 | |
| P | 0.003 | 0.096 | 0.264 | 0.672 | 0.177 | 0.421 |
2.3.2 以TCT结果ASCUS作为初筛分流
细胞学结果≥ASCUS的均转诊阴道镜，有233例；TCT为ASCUS，同时HR-HPV(+)的有62例。阳性结果为295例，阳性率64.27%(295/459)。以TCT结果分流时HPV感染的分布没有明显差异，见表 4、5。
| 组别 | n | HPV(+) | HPV(-) | HR-HPV(+) | HR-HPV(-) | 16和/或18(+) | 16和/或18(-) | LR-HPV |
| ≥ASCUS | 298 | 279(93.6) | 19(6.38) | 270(90.6) | 28(9.4) | 140(46.98) | 130(43.62) | 9(3.02) |
| 低于ASCUS | 161 | 153(95) | 8(4.97) | 152(94.41) | 9(5.59) | 85(52.8) | 67(41.6) | 1(0.62) |
| χ2 | 0.374 | 2.043 | 1.414 | 0.172 | 1.809 | |||
| P | 0.541 | 0.153 | 0.234 | 0.678 | 0.179 | |||
| 组别 | n | HPV(+) | HPV(-) | HR-HPV(+) | HR-HPV(-) | 16和/或18(+) | 16和/或18(-) | LR-HPV |
| ≥ASCUS | 233 | 216(92.7) | 17(7.3) | 208(89.27) | 25(10.73) | 111(47.64) | 97(41.63) | 8(3.43) |
| ASCUS | 65 | 63(96.92) | 2(3.08) | 62(95.38) | 3(4.62) | 29(44.62) | 33(50.77) | 1(1.54) |
| χ2 | 0.891 | 1.571 | 0.187 | 1.726 | 0.144 | |||
| P | 0.345 | 0.210 | 0.666 | 0.189 | 0.704 | |||
2.3.3 以细胞学阳性+HR-HPV联合筛查作为初筛分流
阳性有380例，阳性率为82.79%(380/459)。阴道镜异常包括亚临床人乳头瘤病毒感染(subclinical human papillomavirus infection，SPI)、HISL和LISL 422例，阳性检出率91.94%。联合检测阳性组的阴道镜发现HSIL多于阴性组，差异有统计学意义(P < 0.05)，其余类别均无统计学差异(P>0.05，表 6)。
| 组别 | n | 无异常 | 异常检出总数 | SPI | LSIL | HSIL |
| 联合检测阳性 | 380 | 32(8.42) | 348(91.6) | 8(2.1) | 130(34.2) | 210(55.3) |
| 联合检测阴性 | 79 | 5(6.33) | 74(93.7) | 4(5.06) | 36(45.57) | 34(43) |
| χ2 | 0.386 | 0.386 | 1.236 | 3.655 | 3.926 | |
| P | 0.534 | 0.534 | 0.266 | 0.056 | 0.048 |
2.3.4 HR-HPV、TCT以及TCT联合HR-HPV三种方法初筛分流
阳性率比较差异有统计学意义(χ2=44.114，P < 0.01)。
2.4 HR-HPV阴性及HPV阴性的HSIL患者中TCT和阴道镜结果HR-HPV阴性组中：①TCT≥ASCUS有25例(67.57%，25/37)，ASCUS有3例(8.11%，3/37)；②TCT异常共有28例，阴道检查发现异常31例，两种方法比较差异无统计学意义(χ2=0.753，P=0.386)；③TCT低于ASCUS有12例均因明显临床症状转诊阴道镜；④阴道镜初诊正常的6例患者均TCT结果≥ ASCUS；⑤LR-HPV组和HPV(-)组TCT结果和阴道镜检查结果分布比较均无统计学差异(P>0.05，表 7)。
| 组别 | n | TCT正常 | TCT无检验结果 | ASCUS | ≥ASCUS | 阴道镜异常 |
| LR-HPV | 10 | 0 | 1(10) | 1(10) | 8(80) | 8(80) |
| HPV(-) | 27 | 2(7.4) | 6(22.2) | 2(7.4) | 17(63) | 23(85.2) |
| P | 1.000 | 0.647 | 1.000 | 0.445 | 0.653 |
3 讨论 3.1 HPV感染特点
宫颈癌的发生、发展与HPV感染有明确关系，尤其与反复、持续状态的HR-HPV感染密切相关[6]。我国女性体检人群中HPV总感染率为16.18%[7]，四川是12.6%[8]。本研究人群为HSIL患者，HPV总感染率为94.12%，显著高于本地健康人群的筛查[9]，也高于其他普通妇科门诊就诊人群(29.34%)[10]。HPV感染流行病学特征与种族、地域差异及研究样本不同有关。本研究中HSIL患病人群高危型HPV前3位是16、58、52型，而本院体检人群高危型HPV前3位是52、58、16型[9]，这体现了感染亚型是一致的，但致病效力略有不同。已有报道HPV16和18型与70%的宫颈癌病例有关，其他HR-HPV类型仅导致20%的宫颈癌[11]。但是也有研究证明HPV52型对宫颈病变的影响高于HPV18型，仅次于HPV16型，HPV58型可能在感染宿主细胞后，通过稳定表达的E6或E7癌蛋白，导致宫颈病变的发生[12-13]。本研究中HSIL患病人群和筛查人群相似，单一HPV感染率最高。对于不同人群的HPV各亚型的调查，发现不同地区HPV感染特点和主要致病亚型，有助于制定更好的宫颈癌疫苗注射计划。
3.2 宫颈癌筛查异常特征我们通常遵循2018年宫颈癌筛查指南，将高危型HPV联合TCT细胞学检查作为30~65岁女性宫颈癌筛查方法[14]。本研究发现，在HSIL患者中TCT联合HR-HPV阳性检出率最高达82.79%，而以TCT初筛最低，仅64.27%。同样研究中HR-HPV阳性组中TCT出现ASCH或LSIL或HSIL结果明显多于HR-HPV阴性组。这说明宫颈细胞学具有敏感性不足而特异性高的特点。本研究中联合检测阳性的阴道镜发现高级别病变的更多，说明联合检测阳性的病例阴道镜更容易发现病变，而联合检测阴性的(可能取样原因)同样不易得到满意的阴道镜结果(外观可能趋于正常或者3型转化区)，这样一部分患者就容易漏诊。
3.3 避免高危HPV阴性的HSIL患者漏诊对于ASCUS者，高危型HPV结果作为分流阴道镜管理的依据[15]，这样就会有一部分低危型HPV和HPV检测阴性的HSIL漏诊，本研究中有9例(低于ASCUS)及3例(ASCUS)会漏诊。这就需要有高质量的TCT检测结果指导后续的诊断。本研究中的37例HR-HPV阴性患者最终病理为高级别上皮内病变，8.06%的占比也是相当惊人，意义不容忽视。其中有27例为HPV阴性。HR-HPV检测阴性的原因可能为：①取样、检测试剂和方法的原因；②病毒整合入宿主细胞，细胞内无游离状态的HPV病毒存在，或者HPV病毒已被清除，但细胞异型性早已形成；③其他病原体引起的宫颈病变；④组织学类型较为特殊罕见[3]。
如何避免HPV阴性或者低危HPV感染的HSIL患者漏诊，避免该类患者错失及时干预的机会是临床工作中的一大挑战。本研究中TCT异常(ASCH或LSIL或HSIL)在HR-HPV阳性中更多，说明HR-HPV阳性的HSIL病例细胞学异常更容易体现。本组研究的HSIL病例中HR-HPV阴性的患者细胞学异常为主要转诊阴道镜的原因，其余导致转诊阴道镜的因素还有阴道排液等临床表现。但是本研究中阴道镜初诊无异常的6例有细胞学异常，为避免可能出现的细胞学筛查的不足，建议阴道镜常规行颈管搔刮术，以提高阳性诊断率。
本研究为HSIL患者的回顾性研究，HPV阴性最终能获得病理结果与TCT异常和阴道镜异常均有关(阴道镜初诊正常的6例患者均TCT结果≥ASCUS)。阴道镜判断技术要求高，人为因素较多，且组织病理学检查为有创检查，并不适用于广大普通人群。但是，对于门诊就诊人群，有相关体征和症状的患者可以考虑经过阴道上药治疗炎症后重复TCT检查，提高TCT阳性检出率，必要时阴道镜下活检。同时也要考虑对于TCT阳性结果的管理实行分级，重视ASCUS和LSIL的追踪和进一步检查。此外，E6/E7 mRNA检测也很重要，该生物标志物是致癌基因E6/E7表达的产物。当HPV病毒整合入宿主细胞，细胞内无游离状态的HPV病毒存在，此时HPV检测常为阴性，但其仍在发挥作用。
本研究中没有E6/E7 mRNA检测数据，没有患者症状描述，部分TCT和阴道镜记录不完善，没有后续的治疗结局，而且全部研究对象局限于HSIL患者，没有与正常人群的对照研究，因此，研究结果有偏倚。但是，已有的结果提示HR-HPV阴性的门诊患者应引起妇科医生的重视，排除人为检查因素，同时检测E6/E7 mRNA或直接转诊阴道镜。总之，在宫颈癌筛查时把握阴道镜转诊指针，对于HPV阴性但细胞学异常、有临床体征的，做到个体化风险评估，同时提高阴道镜检查质量，避免漏诊高级别病变。
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