2. 611130 成都,成都市第五人民医院外科
2. Department of Surgery, Chengdu Fifth People's Hospital, Chengdu, Sichuan Province, 611130, China
卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,其病死率在女性癌症中位居第一,晚期卵巢患者的5年总体生存率低于30%[1-2]。早期卵巢癌筛查方法困难,患者的临床症状表现隐匿,多数患者确诊时已经是晚期[3],因此寻找有效诊断和治疗卵巢癌的方法具有重要意义。长链非编码RNA是一种不具备编码蛋白质的一类非编码RNA分子,在多种癌症中异常表达,包括卵巢癌[4]。DUXAP8已被报道与癌症发展密切相关,如DUXAP8在卵巢癌细胞中表达上调,干扰DUXAP8可以抑制卵巢癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,DUXAP8通过调控miR-590-5p/YAP1轴发挥在卵巢癌细胞中的作用[5]。miRNA在卵巢癌中异常表达,其中miR-21、miR-92、miR-126、miR-127等已被证明可以作为卵巢癌的诊断标记物[6-7]。有研究表明,miR-4677-3p在非小细胞肺癌组织和细胞中表达下调,过表达miR-4677-3p能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭,并抑制细胞的凋亡;但是在卵巢癌的研究机制尚不明确[8]。在线生物信息学软件预测显示DUXAP8和miR-4677-3p存在互补的核苷酸序列,关于DUXAP8调控miR-4677-3p对卵巢癌的研究尚不清楚。因此本研究旨在探讨DUXAP8通过调控miR-4677-3p对卵巢癌细胞的增殖、周期和凋亡的影响,以期为卵巢癌治疗提供新的作用靶点。
1 材料与方法 1.1 细胞与主要试剂正常卵巢上皮细胞HOSE和卵巢癌细胞SKOV3、OV90、CaOV3购买于美国ATCC典藏中心;胎牛血清、DMEM培养基购买于美国Gibco公司;Lipofectamine 2000转染试剂盒、TRIzol试剂盒、反转录试剂盒购买于美国Invitrogen公司;si-NC、si-DUXAP8、miR-NC、miR-4677-3p、anti-miR-NC和anti-miR-4677-3p购买于上海赛默飞科技公司;SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购买于日本TaKaRa公司;细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒购买于江苏凯基生物公司;Cyclin D1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体和GAPDH抗体购买于美国Santa Cruze公司;双荧光素酶检测试剂盒购买于北京索莱宝公司;引物购自上海吉玛公司。
1.2 样本收集收集2019年5月至2020年5月在四川省人民医院妇产科病理确诊的卵巢癌患者22例,年龄(51.27±9.62)岁。排除患有其他恶性肿瘤以及在手术前3个月接受化疗或者其他治疗的患者。将手术切除的癌旁组织和卵巢癌组织立即在超低温冰箱内冷冻保存。所有患者在术前签署了知情同意书,通过了本院伦理会批准(2019-013)。
1.3 细胞转染与分组正常卵巢上皮细胞HOSE和卵巢癌细胞SKOV3、OV90、CaOV3冷冻复苏在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基内,置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。收集生长状态较好的SKOV3细胞,按照Lipofectamine 2000转染试剂盒的说明书,将si-NC、si-DUXAP8、miR-NC、miR-4677-3p、anti-miR-NC和anti-miR-4677-3p转染至细胞内,记为si-NC组、si-DUXAP8组、miR-NC组、miR-4677-3p组、si-DUXAP8+anti-miR-NC组和si-DUXAP8+anti-miR-4677-3p组。转染48 h后用于后续实验。
1.4 RT-qPCR检测DUXAP8和miR-4677-3p的表达按照TRIzol试剂盒说明书提取卵巢癌组织、细胞和转染各组SKOV3细胞总RNA,加入反应混合物后采用反转录试剂盒合成cDNA模板,根据SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增。分别以GAPDH和U6作为内参,按照2-ΔΔCt法计算DUXAP8和miR-4677-3p的表达。DUXAP8上游引物为:5′-AG-ACGCCATGGAACAT-3′,下游引物为:5′-AAGCGGA-GACCTGAGGAG-3′;miR-4677-3p上游引物为:5′-CTGTGAGACCAAAGAACTACTCGC-3′,下游引物为:5′-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3′。
1.5 CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖 1.5.1 CCK-8实验收集各组转染的SKOV3细胞,按照4×104/mL密度接种至96孔板中,放置培养箱中培养24、48、72 h,每孔内加入10 μL的CCK-8试剂,继续培养4 h,于酶标仪450 nm处检测细胞光密度值D(450),并计算细胞活力。
1.5.2 克隆形成实验收集各组转染的SKOV3细胞,离心后倒去上清液。制备细胞悬液,按照1×103/孔接种至6孔板内,每2天换1次培养液,待肉眼可见细胞菌落后停止培养。采用甲醇固定15 min,结晶紫染色30 min,晾干后,计算细胞的克隆形成数。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡和周期 1.6.1 细胞周期实验收集各组转染的SKOV3细胞并调整密度为1×106/mL接种至6孔板内,PBS冲洗两次,采用75%乙醇溶液进行固定过夜培养。次日加入25 mg/L RNase和5 μL的PI。避光在室温下反应15 min,在流式细胞仪上检测细胞周期情况。
1.6.2 细胞凋亡实验收集各组转染的SKOV3细胞,在4 ℃下加入预冷的PBS洗涤,然后采用结合缓冲液重悬细胞,并调整密度为1×106/mL接种至6孔板内。取100 μL细胞悬液与5 μL的Annexin V/PITC、PI混匀培养。避光在室温下反应15 min,置于流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
1.7 Western blot检测Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表达收集各组转染的SKOV3细胞加入1 mL蛋白裂解液用于提取总蛋白,经过沸水变性后,按照BCA法检测定量蛋白。取20 μg蛋白样品在SDS-PAGE凝胶分离,将分离的蛋白样品转膜,封闭培养,在4 ℃加入Cyclin D1、Bcl-2、Bax稀释为1 ∶1 000,过夜培养,室温条件下加入二抗(1 ∶10 000),培养2 h,加入ECL进行曝光。以GAPDH为内参,在Image J软件分析蛋白表达。
1.8 双荧光素酶报告实验检测DUXAP8和miR-4677-3p的关系通过在线生物信息学软件Starbase预测显示miR-4677-3p和DUXAP8的3′UTR存在互补的碱基序列,然后将miR-4677-3p结合位点的DUXAP8 3′UTR的野生型和突变型克隆至pGL3载体中,生成质粒DUXAP8 WT和DUXAP8 MUT,按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书与miR-NC或miR-4677-3p共转染至SKOV3细胞内。48 h后按照双荧光素酶检测试剂盒说明书检测细胞的荧光素酶活性。
1.9 统计学分析实验结果以SPSS 22.0统计软件处理分析数据,实验结果以x±s表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 DUXAP8和miR-4677-3p在卵巢癌组织的表达与癌旁组织相比,卵巢癌组织中DUXAP8表达显著升高(P < 0.05),miR-4677-3p表达显著降低(P < 0.05,图 1)。
2.2 DUXAP8和miR-4677-3p在卵巢癌细胞的表达
与正常卵巢上皮细胞HOSE相比,卵巢癌细胞SKOV3、OV90、CaOV3中DUXAP8表达显著升高(P < 0.05),miR-4677-3p表达显著降低(P < 0.05)。其中SKOV3细胞的差异表达相对较大。见图 2。
2.3 干扰DUXAP8对卵巢癌细胞增殖、周期和凋亡的影响
与si-NC组相比,si-DUXAP8组的DUXAP8表达、克隆形成率、S期细胞比例显著降低(P < 0.05),G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率显著升高(P < 0.05),Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05),Bax蛋白表达显著升高(P < 0.05,图 3、4和表 1)。
组别 | DUXAP8 | G0/G1(%) | G2/M(%) | S(%) | 细胞凋亡(%) | Cyclin D1蛋白 | Bcl-2蛋白 | Bax蛋白 |
si-NC组 | 0.99±0.07 | 46.7±4.1 | 15.2±1.6 | 38.1± 3.8 | 8.5±1.1 | 1.01±0.07 | 0.99±0.08 | 1.02±0.08 |
si-DUXAP8组 | 0.43±0.04 | 60.3±5.9 | 14.6±1.5 | 25.1±2.2 | 23.1±2.5 | 0.44±0.04 | 0.47±0.04 | 1.83±0.17 |
t | 20.838 | 5.679 | 0.821 | 8.882 | 16.036 | 21.210 | 17.441 | 12.934 |
P | 0.000 | 0.000 | 0.424 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
2.4 过表达miR-4677-3p对卵巢癌细胞增殖、周期和凋亡的影响
与miR-NC组相比,miR-4677-3p组的miR-4677-3p表达、G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率显著升高(P < 0.05),克隆形成率、S期细胞比例显著降低(P < 0.05),Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05),Bax蛋白表达显著升高(P < 0.05,图 5、6和表 2)。
组别 | miR-4677-3p | G0/G1(%) | G2/M(%) | S(%) | 细胞凋亡(%) | Cyclin D1蛋白 | Bcl-2蛋白 | Bax蛋白 |
miR-NC组 | 0.95±0.07 | 48.6±3.7 | 18.1±1.6 | 33.3±2.7 | 9.8±1.2 | 0.97±0.08 | 1.01±0.09 | 0.99±0.07 |
miR-4677-3p组 | 2.15±0.22 | 62.5±5.4 | 17.3±1.9 | 20.2±1.5 | 24.9±2.6 | 0.41±0.04 | 0.44±0.05 | 1.74±0.16 |
t | 15.593 | 6.370 | 0.966 | 12.724 | 15.819 | 18.873 | 16.609 | 12.883 |
P | 0.000 | 0.000 | 0.035 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
2.5 DUXAP8调控miR-4677-3p的表达
DUXAP8和miR-4677-3p互补的核苷酸序列见图 7。通过双荧光素酶报告实验结果显示:与miR-NC组相比,miR-4677-3p组DUXAP8 WT荧光素酶活性显著降低(P < 0.05),DUXAP8 MUT荧光素酶活性无变化(表 3)。表 4结果显示,与pcDNA组相比,DUXAP8组的DUXAP8表达显著升高(P < 0.05),miR-4677-3p表达显著降低(P < 0.05)。
组别 | DUXAP8 WT | DUXAP8 MUT |
miR-NC组 | 1.02±0.08 | 0.95±0.07 |
miR-4677-3p组 | 0.42±0.05 | 0.99±0.08 |
t | 19.080 | 1.129 |
P | 0.000 | 0.276 |
组别 | DUXAP8 | miR-4677-3p |
pcDNA组 | 0.99±0.07 | 1.01±0.07 |
DUXAP8组 | 4.56±0.37 | 0.39±0.04 |
t | 28.441 | 23.070 |
P | 0.000 | 0.000 |
2.6 抑制miR-4677-3p部分回复干扰DUXAP8对卵巢癌细胞增殖、周期和凋亡的影响
与si-DUXAP8+anti-miR-NC组相比,si-DUXAP8+anti-miR-4677-3p组的miR-4677-3p表达、G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率显著降低(P < 0.05),克隆形成率、S期细胞比例显著升高(P < 0.05),Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著升高(P < 0.05),Bax蛋白表达显著降低(P < 0.05,图 8、9和表 5)。
组别 | miR-4677-3p | G0/G1(%) | G2/M(%) | S(%) | 细胞凋亡(%) | Cyclin D1蛋白 | Bcl-2蛋白 | Bax蛋白 |
si-DUXAP8+anti-miR-NC组 | 1.04±0.09 | 62.7±5.8 | 14.4±1.7 | 21.8±1.6 | 22.5±2.7 | 1.01±0.06 | 0.99±0.07 | 1.01±0.08 |
si-DUXAP8+anti-miR-4677-3p组 | 0.43±0.04 | 55.2±4.5 | 15.5±2.1 | 30.4±2.5 | 15.9±1.2 | 1.55±0.13 | 1.64±0.15 | 0.42±0.04 |
t | 18.581 | 3.065 | 1.221 | 8.692 | 6.701 | 11.315 | 11.780 | 19.789 |
P | 0.000 | 0.007 | 0.024 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
3 讨论
大多数研究已经证实lncRNA可以作为卵巢癌的潜在生物标志物(如LINC00861、LEMD1-AS1和KCNQ1OT1等),其参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移等[9-10]。DUXAP8是假基因来源的一类lncRNA,在多种癌症中表达上调(如结直肠癌、口腔癌和膀胱癌等),影响肿瘤的发生和发展[11-13]。LIAN等[14]研究发现,DUXAP8在胰腺癌组织中高表达,且与胰腺癌组织的大小、病理分期和较短的生存期相关;采用siRNA技术发现,沉默DUXAP8可以抑制胰腺癌细胞的增殖、诱导细胞的凋亡,并通过调节CDKN1A和KLF2促进胰腺癌的发展。ZHANG等[15]研究发现,DUXAP8在肝癌细胞组织中高表达,且通过调控miR-490-5p/BUB1促进肝癌细胞的增殖和周期,并抑制细胞的凋亡。DUXAP8在胶质瘤组织中表达上调,且与患者总体生存率相关,敲低DUXAP8可以抑制胶质瘤细胞的增殖[16]。以上研究说明DUXAP8可以作为多种癌症的生物标志物。本研究结果显示,与癌旁组织和正常卵巢上皮细胞比较,DUXAP8在卵巢癌组织和细胞中高表达,说明DUXAP8可以作为卵巢癌的潜在标志物。体外功能实验显示,干扰DUXAP8能够抑制卵巢癌细胞的克隆形成率、S期细胞比例,促进G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率,下调Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,这说明干扰DUXAP8可以抑制卵巢癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡,并阻滞细胞周期。
miRNA是一类长度约为18~22个核苷酸的单链非编码RNA,能够诱导mRNA降解发挥其在肿瘤细胞中的生物学效应。miRNA在卵巢癌中异常表达[17],如miR-552在卵巢癌组织中高表达,干扰miR-552可以抑制卵巢癌细胞的增殖和转移,miR-552能够靶向PTEN促进卵巢癌细胞的发展[18]。ZHANG等[19]研究发现,miR-337-3p在卵巢癌组织中低表达,过表达miR-337-3p能够抑制卵巢癌细胞的增殖、诱导细胞的凋亡、使细胞周期停滞;miR-337-3p通过抑制PIK3CA和PIK3CB表达促进卵巢癌细胞的发生。XIA等[20]研究发现,miR-211在卵巢癌细胞和组织中低表达,过表达miR-211能够抑制卵巢癌细胞的增殖、诱导细胞的凋亡、阻滞细胞周期。miRNA与卵巢癌发展有关,miR-4677-3p是一种抑癌基因,有研究表明miR-4677-3p在肺癌组织和细胞中低表达,参与了肺癌细胞的增殖和转移,从而发挥抑癌作用[21]。但是,miR-4677-3p对卵巢癌的相关机制尚不清楚。本研究发现,与癌旁组织和正常卵巢上皮细胞比较,miR-4677-3p在卵巢癌组织和细胞中低表达,通过体外功能实验显示,过表达miR-4677-3p可以抑制卵巢癌细胞的克隆形成率、S期细胞比例,升高G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率,下调Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,这说明过表达miR-4677-3p可以抑制卵巢癌细胞的增殖、诱导细胞的凋亡并阻滞细胞周期。在线生物系信息软件和双荧光素酶报告实验表明:DUXAP8调控miR-4677-3p的表达,抑制miR-4677-3p可以逆转干扰DUXAP8对卵巢癌细胞增殖、周期和凋亡的作用,这说明DUXAP8通过调控miR-4677-3p发挥在卵巢癌细胞中的作用。
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