最新的癌症统计资料显示，乳腺癌已成为美国女性发病率首位的癌症，其发病率在女性中高达30%，已成为全世界女性死亡的第二大癌症[1]。预计到2050年，全世界女性乳腺癌患者将达到320万[2]。乳腺癌的发生、发展与参与调控乳腺癌细胞生长、凋亡的基因异常表达紧密相关，靶向治疗乳腺癌已经成为目前的研究热点[3]。根据激素和生长因子受体的表达，乳腺癌可以分为4种主要类型，其中大约70%的乳腺癌病例被归类为HR+(雌激素受体阳性ER+和/或孕激素受体阳性PR+)[4]。目前，对调控ER+乳腺癌细胞增殖、凋亡作用的相关癌基因认识仍然不完全，探究乳腺癌增殖、凋亡的新靶点有利于改善乳腺癌治疗方式以及预测预后。
血清和糖皮质激素诱导激酶3(serum- and glucocorticoid-regulated kinase 3，SGK3)是属于AGC蛋白激酶的SGK之一，与磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)下游的AKT发挥平行作用，并称作是“第二个AKT蛋白”。已证明SGK3与某些癌症的发生、发展有关[5-6]。在大多数癌症中，PI3K/AKT/mTOR信号通路均异常激活，并被认为是癌症治疗的潜在靶标[7]。AKT是PI3K介导的著名效应靶标，可调控细胞生长、增殖、分化、凋亡、存活和葡萄糖代谢等功能[8]，而同样是PI3K下游关键分子的SGK3，其研究很少。为进一步理解SGK3在乳腺癌中的作用，本研究以SGK3为研究对象，采用MTT、平板克隆实验、流式细胞术、Western blot技术，初步确定SGK3对ER+乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响，并运用生物信息学分析其表达与乳腺癌患者生存以及预后的关系。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人乳腺癌细胞MCF-7、T47D购于ATCC公司。
1.1.2 主要试剂RPMI1640培养基、DMEM培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于美国Procell公司；OPTI-MEM无血清培养基、RNAiMAX购于Thermo Fisher公司；Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒、MTT试剂(编号：ST316)购于碧云天公司(货号：C1062L)；PBS、TBS均购于Biosharp公司；封闭专用脱脂奶粉购于北京普利莱基因技术有限公司；兔抗人SGK3(货号：8156S)、Bax(货号：2772S)、Bcl-2单克隆抗体(4223S)、PARP(9532S)、Cleaved-PARP(5625S)单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology(CST)公司；β-actin(SC-47778)单克隆抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(编号：ZB-2301)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(编号：ZB-2305)均购于中国中杉金桥公司；Doxycycline(DOX)药物(货号：631311)购于美国Clonetech公司；小干扰RNA购于南京晶百生物科技有限公司。SGK3干扰序列见表 1。
| 序号 | 序列(5′→3′) |
| siNC | UUCUCCGAACGUGUCACGUTT |
| siSGK3#1 | CGAUGAACACAGAGAGAAATT |
| siSGK3#2 | GGGAAGAAGUGAAUGGUUUTT |
| siSGK3#3 | UGUCAAAGUGUUACAGAAATT |
1.2 方法 1.2.1 Tet-On-SGK3质粒构建
利用反转录病毒表达系统，制备用于SGK3诱导表达的pRetroX-Tight-Pur-SGK3质粒，用PCR扩增SGK3基因5′-ATTGCGGCCGCCACCATGCAAAGAGATCACACCATGGAC-3′和5′-CCTTCAGAAGACTTATTTTTGTGAACGCGTGCCCG-TGCC-3′。PCR产物经消化后通过NotⅠ和MluⅠ位点进行亚克隆，所有插入片段经DNA测序验证。
1.2.2 MCF-7-Tet-On-SGK3和T47D-Tet-On-SGK3细胞构建使用Retro-X-Tet-On Advanced诱导表达系统来建立四环素诱导的双稳态RetroX-Tet。在293T细胞与反转录病毒表达载体pCMV-GP(gag-pol表达载体) 瞬时共转染(pRetroX-Tet-On Advanced载体)，用于表达四环素控制的反式激活子rtTA-Advanced或pRetroX-Tight-Pur-SGK3载体，用于在诱导反应启动子PTight下表达SGK3，并包膜Lipofectamine 2000表达载体(pVSV-G)。转染后8~10 h，将含有DNA和Lipofectamine 2000的培养基替换为10 mL新鲜的完全培养基，并在收集粗病毒上清液之前将细胞连续培养48~72 h。将上清液短暂离心并等分，-80 ℃保存备用。
将MCF-7、T47D细胞接种与6孔板，用RetroX-Tet-On Advanced病毒库存感染细胞。简而言之，除去培养基，向每个孔中加入1 mL病毒原液，并添加Polybrene至终浓度4 μg/mL。感染后24 h，将细胞在含有600 μg/mL G418的新鲜完全培养基中培养约2周。每2天更换1次选择性培养基。G418筛选2周后，合并G418抗性克隆，并进一步用RetroX-Tight-Pur-SGK3病毒感染。感染后24 h，将细胞在含有2 μg/mL嘌呤霉素的培养基中培养4~5 d。使用有限稀释法分离单个MCF-7-Tet-On-SGK3、T47D-Tet-On-SGK3细胞克隆。
1.2.3 TCGA数据库分析通过基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)[9]工具对TCGA数据库中SGK3基因进行分析，包括：组织差异表达、患者生存分析。筛选设定条件为：①表达模块，选择SGK3及Match TCGA normal data；②生存分析模块，生存图表(survival plots)选择SGK3，总生存期(overall survival，OS)及无病生存期(disease free survival，DFS)。
1.2.4 MTT检测过表达SGK3对细胞增殖的影响取对数生长期的细胞，96孔板每个孔加入180 μL(约含4 000个细胞)细胞悬液，实验组(DOX+)在重悬细胞的同时加入终浓度为250 ng/mL的DOX以诱导SGK3过表达，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1、2、3、4、5、6、7 d后，取出培养板，每孔加入20 μL MTT工作液，于37 ℃细胞培养箱孵育4 h。吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，摇床孵育10 min，置于酶标仪上(检测波长为570 nm)测定其光密度值D(570)。
1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖取对数生长期的细胞，在6孔板中每孔加入细胞悬液2 mL(约500个细胞)，其中实验组(DOX+)加入终浓度为250 ng/mL的DOX，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养14 d左右，取出6孔板，吸净上清，用PBS洗涤后加入4%多聚甲醛固定30 min后，加入结晶紫染料染色，并用Image J统计软件进行计数。
1.2.6 流式检测细胞凋亡取对数生长期的细胞，加入DOX诱导48 h后，收集细胞，将细胞重悬于PBS溶液中，离心后弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL的碘化丙啶染色液，室温孵育10 min，随后上机检测各组细胞凋亡比例。
1.2.7 小干扰RNA转染目的细胞以敲低SGK3按照说明书将siRNA配置终浓度为20 μmol/L的工作液，用50 μL Opti-MEM稀释1.25 μL siRNA得到A溶液，用50 μL Opti-MEM稀释1.0 μL Lipofectamine 2000得到B溶液，将A、B溶液分别吹打混匀后在室温孵育5 min后, 将其混匀至同一EP管孵育20 min。将细胞铺于6孔板，待目的细胞汇合度达30%~50%时，将细胞上清吸净后换为无血清培养基，将A、B混合液加入6孔板内，放于细胞培养箱继续培养6~8 h，换液，48 h后收集细胞进行检测。
1.2.8 MTT检测敲低SGK3对细胞增殖影响取对数生长期的细胞，96孔板每个孔加入180 μL(含有约4 000个细胞)细胞悬液，每孔加入1 μL RNAiMAX、0.25 μL siNC(对照组)或0.25 μL siSGK3#3(实验组)放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1、3、5 d后，取出培养板，每孔加入20 μL MTT工作液，于37 ℃孵育4 h。吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，摇床孵育10 min，置于酶标仪上(检测波长为570 nm)测定其光密度值D(570)。
1.2.9 Western blot法检测细胞中相关蛋白质变化收集不同处理的细胞，加RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂(PMSF)裂解细胞，提取总蛋白，在蛋白中添加5×Loading buffer混合煮沸10 min。采用SDS-PAGE法分离蛋白，恒压电转印至0.45 μm PVDF膜上，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃过夜杂交，二抗于室温孵育2 h，TBST洗涤后采用ECL化学发光显影目的条带获得结果。最后通过Image J软件定量蛋白条带灰度值。
1.3 统计学分析利用Graphpad 8.0统计软件，两组数据间的比较采用独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 SGK3在乳腺癌组织中过表达，影响乳腺癌患者生存率采用GEPIA在线工具分析TCGA数据库的1 084例乳腺癌组织及492例正常组织。图 1A所示SGK3的mRNA水平在BRCA组织中显著上调，进一步分析SGK3 mRNA水平与BRCA患者OS及DFS的关系，按50%中位数样本分为SGK3高表达和低表达组。如图 1B、C所示，SGK3能够影响BRCA患者的生存期，与低表达BRCA患者相比，SGK3高表达患者的总生存期(OS)及无病生存期(DFS)缩短。
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| A：SGK3表达分析，红色方框示乳腺浸润癌；B、C：SGK3对乳腺癌患者总生存期及无病生存期的影响 图 1 GEPIA中基于TCGA数据库分析SGK3基因在乳腺癌组织及正常组织的表达及生存情况 |
2.2 SGK3能够被DOX诱导
将MCF-7-Tet-On-SGK3和T47D-Tet-On-SGK3细胞添加不同浓度DOX诱导48 h后，Western blot检测结果显示：与对照组(DOX 0 ng/mL)比较，SGK3能够在较低浓度显著被诱导上调(P < 0.01，图 2)。因此，后续实验中DOX浓度为250 ng/mL。
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| A：Western blot检测不同浓度DOX诱导SGK3效率；B：半定量分析结果(n=3, x±s) a: P < 0.01，与0 ng/mL DOX比较 图 2 Western blot检测DOX诱导SGK3在MCF-7-Tet-On-SGK3、T47D-Tet-On-SGK3细胞中过表达 |
2.3 SGK3过表达能够促进MCF、T47D细胞增殖
过表达组(DOX+)添加DOX(250 ng/mL)以诱导SGK3过表达，诱导不同时间后，MTT法检测结果显示，相对于对照组(DOX-)，过表达组细胞增殖能力明显增加(P < 0.01，P < 0.05, 图 3A、B)。平板克隆实验检测结果表明，在MCF-7、T47D细胞中过表达组相对于对照组的克隆形成能力明显增加(P < 0.01，P < 0.05，图 3C~E)。说明SGK3外源性过表达后促进了细胞增殖。
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| DOX-：对照组；DOX+：过表达SGK3组; A、B：MCF-7-Tet-On-SGK3以及T47D-Tet-On-SGK3细胞生长曲线(n=3, x±s) a: P < 0.05，b：P < 0.01，与对照组比较；C：MCF-7-Tet-On-SGK3平板克隆实验；D：T47D-Tet-On-SGK3平板克隆实验；E：各组克隆细胞分析 a: P < 0.05，b：P < 0.01，与对照组比较 图 3 过表达SGK3对MCF-7、T47D细胞增殖能力的影响 |
2.4 SGK3过表达能够减少MCF-7、T47D细胞凋亡
MCF-7-Tet-On-SGK3、T47D-Tet-On-SGK3细胞分别添加DOX诱导SGK3过表达，采用流式细胞术检测过表达SGK3对细胞凋亡情况的影响，流式细胞仪检测结果显示：与对照组(DOX-)相比，过表达SGK3组(DOX+)能够明显减少MCF-7-Tet-On-SGK3、T47D-Tet-On-SGK3细胞凋亡比例(P < 0.01，图 4)。
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DOX-：对照组；DOX+：过表达SGK3组
A、B：流式细胞术检测MCF-7-Tet-On-SGK3、T47D-Tet-On-SGK3细胞过表达SGK3后凋亡情况；C：各组凋亡率定量分析(n=3, x±s) a: P < 0.01，与对照组比较 图 4 过表达SGK3对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响 |
2.5 SGK3过表达能够下调凋亡相关分子
使用DOX诱导SGK3过表达后，Western blot检测凋亡相关分子的变化。结果显示：与对照组(DOX-)比较，过表达SGK3后能够显著降低Bax、上调Bcl-2、下调Cleaved-PARP水平(P < 0.01，P < 0.05，图 5)。
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DOX-：对照组；DOX+：过表达SGK3组
A、B：Western blot检测在MCF-7以及T47D细胞过表达SGK3后凋亡相关蛋白分子的变化；C、D：半定量结果分析(n=3, x±s) a：P < 0.05，b：P < 0.01，与对照组比较 图 5 过表达SGK3对MCF-7、T47D细胞凋亡相关分子的影响 |
2.6 siRNA敲低SGK3蛋白水平
为了进一步验证SGK3的作用，设计了3对SGK3的小干扰片段，转染细胞72 h后收集蛋白，运用Western blot检测敲低SGK3效率，结果显示：与对照组(siNC)比较，3对siRNA片段均能够显著下调SGK3水平(P < 0.01，图 6)，在后续实验中，均用siSGK3#3转染细胞以敲低SGK3。
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| 1: siNC; 2: siSGK3#1; 3: siSGK3#2; 4: siSGK3#3；A：Western blot检测不同siRNA片段敲低SGK3效率；B：半定量分析结果(n=3, x±s) a：P < 0.01，与siNC比较 图 6 Western blot检测siRNA敲低MCF-7、T47D细胞中SGK3的表达 |
2.7 siRNA敲低SGK3抑制细胞增殖活力
为了进一步确认SGK3对细胞增殖的影响，采用siRNA干扰技术敲低SGK3表达，并用MTT实验检测敲低SGK3对MCF-7细胞增殖的影响。结果显示，与对照组(siNC)比较，siSGK3敲减SGK3后能够明显抑制细胞增殖活力(P < 0.01，图 7)。
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| siNC：对照组；siSGK3：实验组；a：P < 0.01，与对照组比较 图 7 敲低SGK3对MCF-7细胞生长的影响(n=3, x±s) |
2.8 siRNA敲低SGK3后能够促进MCF-7、T47D细胞凋亡
为了进一步确定SGK3影响乳腺癌细胞MCF-7、T47D凋亡，收集转染siNC、siSGK3 72 h的MCF-7和T47D细胞后，采用流式细胞术检测其凋亡水平。结果显示，与对照组(siNC)比较，siSGK3敲低SGK3后能够明显促进细胞凋亡(P < 0.05，图 8)。
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| siNC：对照组；siSGK3：实验组；A、B：流式细胞术检测结果；C：凋亡率定量分析(n=3, x±s) a：P < 0.05，与siNC比较 图 8 敲低SGK3对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响 |
2.9 siRNA敲低SGK3后能够上调凋亡相关分子
为了进一步探究敲低SGK3促进细胞凋亡的机制，运用Western blot检测凋亡相关蛋白表达，结果显示，与对照组(siNC)比较，siSGK3敲低SGK3后能够显著上调凋亡蛋白Bax(P < 0.01)、下调Bcl-2(P < 0.01，P < 0.05)、上调Cleaved-PARP(P < 0.01，P < 0.05，图 9)。
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| siNC：对照组；siSGK3：实验组；A、B：Western blot检测结果；C、D：蛋白半定量结果分析结果(n=3, x±s) a：P < 0.05，b：P < 0.01，与siNC比较 图 9 敲低SGK3对MCF-7、T47D细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
3 讨论
癌基因可以影响肿瘤患者的生存、预后，严重影响生活质量，大多数癌基因可以通过复杂的调控网络影响各种癌细胞的细胞表型，进而影响恶性肿瘤的发生发展。血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)是近年来新发现的PI3K下游分子，有研究发现，SGK参与多种肿瘤的增殖、侵袭和转移，在肿瘤细胞的生长分化、生存和物质转运、代谢等方面发挥着重要作用[10]，但在BRCA中SGK3的表达与功能尚不明确。SGK3是SGK家族的一员，其表达与人类卵巢癌、肝癌、大肠癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生有关[11]。本研究通过生物信息数据库数据分析，SGK3在乳腺癌组织相较于正常组织表达明显增加，提示SGK3高表达可能与乳腺癌的发生、发展有关。并且在TCGA数据库中，按SGK3表达的程度分类，其高表达的患者无病生存期较低，预后较差[12]。
众所周知，增殖异常是恶性肿瘤的基本生物学特征，为了进一步探究SGK3是否能够对乳腺癌发生、发展产生一定的影响，本研究通过构建Tet-On可诱导系统，用DOX特异性过表达SGK3后能够显著促进其增殖、降低其凋亡水平。说明SGK3过表达可能与促进乳腺癌的发展有关，这给乳腺癌发生、发展提供了新的认识。
除了增殖异常外，细胞凋亡变化也是肿瘤发生的重要原因，二者失衡可以导致机体功能障碍或疾病的发生，也是导致肿瘤发生发展的重要机制[13]。凋亡是一种继发性程序化的死亡过程，有多种基因参与调控，主要分为两种方式，一种为Bax/Bcl-2依赖方式，另外一种为Caspase蛋白家族依赖性方式。其中，Bax及Bcl-2是凋亡发生启动的关键性分子，Bax是受Bcl-2调控的促凋亡分子，具有诱导线粒体渗透性改变，激活凋亡蛋白，释放细胞色素等功能，在细胞凋亡中发挥着重要的作用[14]。Bcl-2可以抑制Bax表达从而抑制细胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2比例决定着细胞是否发生凋亡，为凋亡的关键因素。Cleaved-PARP为凋亡的关键蛋白，其表达水平反映凋亡水平的高低。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于大分子蛋白，参与多种信号通路，主要影响细胞的生长、自噬以及凋亡进程。和AKT一样，SGK主要涉及PI3K-mTOR信号，此通路被激活可以增强抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达，抑制促凋亡蛋白P53进而保护细胞免受凋亡，抑制该通路可以诱导凋亡[15]。因此，我们推测，与AKT结构相似、功能相似的SGK3蛋白可能也是通过类似的机制影响抗凋亡蛋白(如Bcl-2)的表达从而发挥抗凋亡作用。
综上所述，SGK3在乳腺癌细胞的发展中起着重要作用，本研究为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。后续我们将围绕下游分子机制开展更为详细的研究，为深入了解SGK3在调控乳腺癌发生、发展提供新的依据。
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