2. 833000 新疆维吾尔自治区 乌苏,中国人民解放军第948医院普通外科;
3. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院基础医学教学实验中心
2. Department of General Surgery, No.948 Hospital of PLA, Wusu, Xinjiang Uygur Autonomous Region, 833000;
3. Experimental Center of Basic Medicine, College of Basic Medical Sciences, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
联合型运动学习(associative motor learning)是一种人们将不同时间发生的事件联系起来,从而产生适宜的运动行为反应的脑高级功能[1]。它对于人的生产和生活具有重要意义。特别的是,联合型运动学习能力在老化、精神分裂症、自闭症等疾病发生时会出现早期损害[2-4]。因此,阐明联合型运动学习的发生机制,可望为相关疾病的早期诊断和治疗效果评价提供有意义的启示。痕迹性眨眼条件反射(trace eyeblink conditioning,tEBC)是研究联合型运动学习的常用行为模型[5]。通过tEBC训练,动物可学会一个针对条件刺激(conditioned stimulus, CS)的条件眨眼反应(conditioned response, CR),以有效躲避非条件刺激(unconditioned stimulus, US)(如角膜吹气)带来的伤害。文献已报道[6],抑制内侧前额叶皮层(medial prefnntal cortex, mPFC)会显著损害tEBC的建立,提示mPFC在tEBC建立的过程中发挥重要作用。在体电生理记录实验也发现,mPFC神经元在tEBC训练过程中会被CS诱发出显著的放电活动[7]。尽管如此,mPFC参与tEBC建立的细胞活动机制仍不完全清楚。在既往的电生理研究中,由于微电极阵列的记录位置会随tEBC训练而不断推进,以获取尽可能多的神经元活动信息,导致缺乏对同一神经元群体在联合型运动学习过程中活动的连续监测资料[7]。此外,对于mPFC不同类型神经元在此过程中的活动变化也缺乏比较分析。为解决这些问题,本研究将微电极阵列固定于mPFC特定区域,以连续监测同一神经元群体放电活动,并比较该区不同类型神经元在tEBC建立过程中的活动特点及其与联合型运动学习行为的相关性。以期揭示mPFC中特定类型神经元在联合型运动学习中的作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物实验选用3~4月龄雄性C57/BL6小鼠4只,体质量25~30 g,由陆军军医大学实验动物中心提供。从电极阵列手术前2天开始,对小鼠进行单笼饲养,直至全部实验结束。在实验环境中,动物可以进行自由饮水和进食。
1.2 电极阵列植入手术手术基本流程参照课题组近期工作[8]。使用异氟烷(Isoflurane,浓度:0.5%~0.7%,瑞沃德,中国)麻醉小鼠,并将其头部固定于脑立体定位仪(瑞沃德,中国)。使用立体定位臂测量小鼠前、后囟高度(二者高度差值需 < 100 μm),调整并确保颅骨水平。在双侧小脑上方,使用颅钻开2个直径为0.5 mm的圆形小孔,植入2颗已消毒的不锈钢螺钉,分别焊接地线与参考线。在小鼠左侧上眼睑中部和后部,穿刺2根不锈钢电极丝(型号:791000,裸径:76 μm,绝缘后直径:140 μm,A-M Systems,美国)作为眼轮匝肌肌电信号的记录电极。使用颅钻在左侧前额叶皮层区上方磨出一矩形骨窗(长×宽=1.0 mm×0.4 mm)。骨窗的中心位置坐标为:前囟前1.5 mm,左侧旁开:0.5 mm。挑开硬脑膜,用立体定位臂,植入1组16通道记录阵列电极(4个tetrode电极/组,tetrode电极间距160 μm)至mPFC区,初始深度为0.8~1.0 mm。用牙科水泥固定微电极阵列推进器底座,将低黏度硅胶覆盖骨窗。术后小鼠需经历至少7天恢复期。在此期间,通过微电极阵列推进器将记录电极尖端以40~70 μm/d的速度缓慢向目标区域推进,直到可以稳定记录到mPFC区神经元的放电活动。
1.3 联合型学习行为训练本实验采用tEBC作为联合型运动学习的行为学模型。行为训练周期包括2 d适应和5 d的tEBC训练。在适应期,小鼠被放置于声光电屏蔽的行为学训练箱中。小鼠头顶部连接1个16通道前置放大器、LED光源以及气管导管。受试小鼠可以自由活动并探索行为训练环境,适应时长30~40 min/d。适应期间,不给予小鼠任何刺激。tEBC训练在适应期结束后的第二天开始。将小鼠置于适应期间相同的训练环境中,CS是1个持续150 ms的蓝色LED光脉冲,US是一束持续100 ms的医用氧气气流。从CS结束到US开始的刺激间期时长为250 ms。小鼠每天需要接受100次CS和US的配对刺激,每组配对刺激间隔18~28 s。
1.4 电生理信号记录在tEBC训练过程中,连续记录小鼠左侧mPFC的神经元放电活动。记录方法和流程参照本课题组近期工作[9]:以20 000 Hz的采样频率采集神经元放电信号。电信号通过前置放大器(C3334, Intan Technologies,美国)放大1 000倍再传输至数据记录仪(RHD2000, Intan Technologies,美国)。眼轮匝肌肌电活动的差分信号采集带宽为150~1 000 Hz,信号同样放大1 000倍。所有记录到的信号均使用Neuroscope软件实现可视化观察。
1.5 数据分析针对行为学数据,将每天100次配对训练中CS开始前的300 ms信号作为基线活动,并将该信号活动的平均值+4倍标准差定义为CR的检测阈值。眨眼条件反应必须满足以下条件:①眼轮匝肌活动的肌电信号大于阈值;②眼轮匝肌活动出现在CS开始后50 ms至US开始前的时间段内;③满足条件①和②的时间总和至少要超过20 ms。
离线状态下对神经元放电原始信号进行带通(800~6 000 Hz)滤波处理。首先,使用KlustaKwik软件对每个tetrode记录电极上采集的放电信号数据进行自动甄选,并将它们归为相应的峰电位集群。之后,自动甄选出的峰电位集群还需要进一步通过Klusters软件进行手动判别和再甄选,以筛除在自动甄选过程中误判的噪声信号和包含过多干扰信号的峰电位集群,最终获取单个神经元的峰电位信号。根据动物行为学成绩,将训练分成2个阶段:早期阶段(第1~2天) 和后期阶段(第4~5天)。神经元放电的峰电位信号按照训练分期进行统计和比较。
1.6 记录位点的组织学验证电生理记录实验完成后,通过记录电极用直流电(强度:30 μA,总时程:10 s)损毁记录电极尖端所在脑区。损毁48 h后,向小鼠腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠(浓度:3%,注射量:0.4 mL)。先后经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛溶液各100 mL。取出脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h,而后转移至30%蔗糖溶液中继续脱水24 h。脱水后的脑组织,再用CM1900冰冻切片机(Leica,德国)制成厚度为50 μm的连续冠状切片。经DAPI染色后,在BX53荧光显微镜(Olympus,日本)下观察和拍摄记录电极尖端的损毁位点。只有损毁位点明确在mPFC的电极记录信号数据才可以被纳入数据分析。
1.7 统计学分析数据以x±s表示,使用SPSS 22.0软件进行统计分析。小鼠CR发生率变化采用重复测量数据的单因素方差分析进行检验。对神经元放电强度随训练的强度变化比较采用独立t检验。神经元活动模式比例变化的比较,采用Pearson χ2检验。mPFC神经元放电CR和no-CR状态下的比较采用配对t检验。统计学分析的检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 小鼠联合型运动学习的行为学表现在本实验中,我们以tEBC作为联合型运动学习行为学范式,训练小鼠建立蓝光CS和角膜吹气US之间的联系(图 1A)。如图 1B所示,在连续5 d的CS与US配对刺激训练过程中,小鼠逐渐建立起CS和US之间的联系,表现为针对CS的CR发生率的增加。统计分析显示,小鼠的CR发生率从训练第1天的(38.1±8.2)%上升到第5天的(66.7± 10.0)%,CR发生率显著增加[F(4, 12) =11.249,P < 0.001,图 1B~C]。根据CR发生率的水平,在本实验中,我们将第1~2天定义为CR习得早期,第4~5天定义为CR习得后期。习得后期的CR发生率显著高于习得早期CR发生率(P < 0.05,图 1B~C)。
2.2 联合型运动学习过程中mPFC锥体细胞的活动变化
根据电生理记录实验结束后的电损毁组织学定位,记录位点准确位于mPFC(以前扣带回亚区为主)的数据方可被纳入统计分析(图 2A)。在5 d实验中,我们记录到272个mPFC神经元,并观察分析了其在tEBC训练过程中的活动(图 2B)。根据既往的文献报道,我们将平均放电频率 < 8 Hz、峰电位谷-峰宽度>0.4 ms的神经元定义为假定的锥体细胞(n=174,图 2C);而平均放电频率≥8 Hz、峰电位谷-峰宽度≤0.4 ms的神经元定义为假定的中间神经元(n=40,图 2C)。其余无法明确归入到上述分类中的神经元则不用于分析。
研究首先分析了假定的小鼠mPFC锥体细胞在tEBC建立过程中的放电活动变化。统计分析显示,在小鼠CR习得的早期和后期,锥体细胞的平均放电频率无显著变化(P>0.05,表 1)。但进一步分析则显示,锥体细胞可被CS诱发出明显的放电活动变化,表现为放电活动增强(图 2B、3A)和减弱(图 3A)等类型。特别是相对于CR习得早期,CR习得后期CS诱发的mPFC锥体细胞放电活动显著降低(P < 0.05,图 3B)。与此相一致,在CR习得后期,CS诱发减弱型放电的锥体细胞比例更高[CR习得早期:7.8%(5/64);CR习得后期:20.5%(18/88),图 3A]。可见,CS所诱发的mPFC锥体细胞群体放电活动随联合型运动学习的进行而逐渐减弱。
时间点 | 锥体细胞 | 中间神经元 | |||||
细胞数(个) | 放电频率(Hz) | 峰电位波宽(ms) | 细胞数(个) | 放电频率(Hz) | 峰电位波宽(ms) | ||
训练早期(第1~2天) | 64 | 2.65±0.26 | 0.70±0.01 | 16 | 23.85±4.22 | 0.24±0.02 | |
训练晚期(第4~5天) | 88 | 2.93±0.25 | 0.71±0.01 | 21 | 29.23±2.56 | 0.33±0.01 | |
统计值 | t(150)=-0.760 0 | t(150)=-1.511 0 | t(35)=-1.177 9 | t(35)=-3.554 4 | |||
P | 0.448 5 | 0.123 | 0.246 8 | 0.001 1 |
2.3 联合型运动学习过程中mPFC中间神经元细胞的活动变化
接下来,我们进一步分析了假定的mPFC中间神经元在tEBC建立过程中的放电活动变化。与锥体细胞的情况相类似,在CR习得早期和后期,假定中间神经元的平均放电频率并无显著变化(P>0.05,表 1)。但中间神经元可被CS诱发出显著的放电活动变化,且主要表现为放电活动增强(图 3C)。相对于CR习得早期,CR习得后期CS诱发的mPFC区中间神经元放电活动显著增加(P < 0.05,图 3D)。与此一致,CR习得后期表现为CS诱发增强型放电的中间神经元比例显著更高[习得早期:25%(4/16);CR习得后期:66.7%(14/21),P < 0.05,图 3C]。因此,CS诱发的mPFC中间神经元群体放电活动会随联合型运动学习的进行而逐渐增强。
2.4 mPFC神经元放电活动与联合型运动学习行为的相关性由于mPFC锥体细胞和中间神经元的放电活动随联合型运动学习的训练会发生相反方向的变化,我们推测:它们可能会以不同的方式参与联合型运动学习。为验证这个推测,我们分别比较了假定的mPFC锥体细胞和中间神经元在出现CR和不出现CR两种状态下的放电活动差异(图 4A)。由于CR主要发生在训练后期(即训练第4~5天),我们将分析限定于这一阶段。统计结果显示:在出现CR和不出现CR两种状态下,CS诱发的mPFC锥体细胞放电活动并无显著区别(P>0.05,图 4B)。与此不同的是,相比无CR出现的训练测试,在出现CR的训练测试中CS所诱发的mPFC中间神经元放电活动水平显著更高(P < 0.05,图 4C)。综上结果支持了我们之前的推测, 即CS诱发的mPFC中间神经元放电活动与tEBC训练过程中的CR出现高度相关,而锥体细胞的活动则与CR出现相关性不大。
3 讨论
既往研究报道[6-7], mPFC在以tEBC为代表的联合型运动学习过程中发挥重要作用,但相关的细胞活动基础仍不完全清楚。在此,我们利用在体多通道记录技术研究发现, 在CR习得早期和后期,mPFC锥体细胞可被CS诱发出显著的放电活动变化。相对于CR习得早期,CR习得后期CS诱发的mPFC锥体细胞放电活动显著降低。与此相反的是,CR习得后期CS诱发的mPFC中间神经元电活动则显著增强,其活动与CR的出现显著相关。这些结果表明,mPFC中间神经元活动会随着联合型运动学习而发生可塑性变化,这些变化可能是联合型运动学习发生的细胞活动基础之一。
已经知道,小脑皮层是以tEBC为代表的联合型运动学习发生的关键部位[10],平行纤维-浦肯野细胞突触传递的长时程抑制是其关键机制。但该突触传递可塑性的诱导有赖于CS和US信号同时传递至小脑皮层[11]。但由于CS和US在出现的时间上存在间隔,故小脑皮层难以独立地实现平行纤维-浦肯野细胞突触传递长时程抑制的诱导产生。研究表明[7], mPFC锥体细胞可以被CS诱发出显著的放电反应,且该放电反应可以持续至US阶段,从而跨越CS与US的时间间隔。特别是,近年研究发现,这种持续放电活动可以经脑桥核传递至小脑,被认为是mPFC参与tEBC建立的重要机制式[6, 12]。与上述研究相一致,本研究中也观察到CS可诱发mPFC锥体细胞产生持续性放电反应(图 3A)。但不同的是,我们发现:锥体细胞的持续性放电反应会随训练进行而强度逐渐减弱。同时,表现出这种放电模式锥体细胞的比例也会下降,这与CR习得的趋势相反(图 3A)。造成这一现象的原因可能有:第一,它可能反映了mPFC在tEBC建立过程中参与作用的变化。在本实验中,多通道记录的位点主要在小鼠mPFC的前扣带回亚区(图 2)。文献曾报道,前扣带回区在注意力等功能实现的过程中发挥重要作用[13]。该区域锥体细胞可能在联合型运动学习的初期,由于对CS和US联系关注的需要而增强放电;而在学习后期,则由于关注降低而逐渐减少放电。第二,它可能是由于本研究所采用的记录方法所致。在既往研究中,为尽可能多记录神经元放电活动,研究者往往需要在记录过程中不断变换记录位点。因此,既往研究结果可能反映了不同位点mPFC锥体细胞在联合型运动学习过程中的先后变化[7]。在本实验中,由于记录电极阵列的优势,使我们可在不调整记录位点的条件下记录到足够多的mPFC锥体细胞,故我们的记录位点保持不变。这可以实现对同一群体锥体细胞在联合型运动学习过程中活动的动态监测。因此,我们的结果可能主要反映了前扣带回的同一锥体细胞群体在tEBC建立过程中的动态变化过程,这与既往研究显著不同。
除了锥体细胞活动,本研究还对mPFC中间神经元活动进行了记录和分析。我们发现mPFC中间神经元同样可被CS诱发出显著的放电活动变化(图 3B)。但与锥体细胞不同,相对于CR习得早期,CR习得后期CS所诱发的mPFC中间神经元放电活动显著增强,表现为CS诱发增强型放电活动的中间神经元比例显著增高(图 3)。这些结果因此提示, 在tEBC建立过程中,mPFC中间神经元会发生与锥体细胞相反的活动可塑变化。目前认为,中间神经元对邻近锥体细胞的活动具有抑制效应,可以通过降低背景噪声而达到提高信噪比、提升信息传递效率的目的[14]。因此,我们推测, mPFC中间神经元很可能也参与了tEBC的建立过程。支持这一推测的证据在于,CS诱发的内侧前额叶皮层中间神经元放电活动与CR出现密切相关(图 4C)。
综上所述,本研究探究了tEBC建立过程中mPFC锥体细胞与中间神经元的活动变化及其与条件反射行为之间的相关性。结果显示小鼠mPFC不同神经元在联合型运动学习过程中有不同的变化特征。其中,中间神经元可能与tEBC建立密切相关。这些结果对原有的关于mPFC参与tEBC建立过程中的细胞活动特征的认识进行了补充,并为后期进一步深入探索mPFC中间神经元在tEBC中的作用奠定了基础,也可望为将来防治因前脑结构损伤或病变造成的联合型运动学习障碍提供了新角度的启示。
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