常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD，MIM^#613095)是一种常见的遗传性疾病，全球患病率为1/1 000~1/400，主要表现为肾部囊肿渐进性增多，肾脏结构和功能不可逆受损，部分患者还伴有肝脏、胰腺囊肿^[1-3]。由于缺乏有效的治疗手段，50%的患者会进展为终末期肾病^[4]，需要靠透析或肾移植维持生命，患者生活质量较差，经济负担加重，仅在我国就有150万ADPKD患者^[5]。

ADPKD的主要致病基因是PKD1(polycystic kidney disease 1)和PKD2^[6]，对常染色显性遗传多囊肾病家系成员进行致病基因检测，明确致病遗传因素，通过植入前基因检测或产前指导，阻断疾病的传递，可从根本上降低ADPKD的发病率。本研究利用靶基因高通量测序技术，对3个ADPKD家系的先证者进行基因检测，分析可疑致病位点，并对家系成员进行测序验证，为3个ADPKD家系明确分子诊断，对于指导患者进行早期干预，延缓疾病进展，阻断下一代传递具有重要的意义。

1 资料与方法 1.1 研究对象

3个家系来自2017-2020年河南省人民医院泌尿外科就诊的多囊肾患者。根据患者家族史及临床表现，首先对先证者行超声检查、肾功能检测，并询问病史及家族史，初步诊断为常染色体显性遗传多囊肾病，本研究经河南省人民医院伦理委员会批准(HNEECKY-2019-15-03)，患者及家属知情同意，采集3个家系多名成员的外周血2~3 mL，放置在4 ℃冰箱，供基因检测，同时采集晨尿，进行尿蛋白、肾小球滤过率检测。

家系1，先证者，女性，35岁，有肾脏病家族史，超声结果显示，右肾大小约127 mm×62 mm×53 mm，左肾体积大，大小约132 mm×86 mm×62 mm，轮廓清晰，包膜完整，双肾可见多个大小不等的囊性回声(图 1A)；肾功能正常，肾小球滤过率(eGFR)：101 mL·min^-1·1.73 m^-2，尿微量白蛋白肌酐比(ACR)：25 mg/g。根据主述，家中连续4代均有多囊肾患者，呈典型的常染色体显性遗传方式。

家系2，先证者，男性，42岁，有肾脏病家族史，超声结果显示，双侧肾体积增大，右肾大小约235 mm×199 mm×109 mm，左肾大小约216 mm×157 mm×101 mm，形态饱满，包膜光滑，双侧可见多个大小不等的囊性回声(图 2A)。肾功能中度受损，eGFR: 56 mL·min^-1·1.73 m^-2，ACR：30 mg/g。

家系3，先证者，女性，42岁，尿毒症后期，有肾脏多囊家族史，双肾体积增大，右肾长约157 mm，左肾长约166 mm，形态失常，正常结构消失，代之多个大小不等的囊性回声(图 3A)，肝内布满大小不等囊性回声，以小囊为主。肾功能严重受损，eGFR：4.4 mL·min^-1·1.73 m^-2，ACR：400 mg/g。

1.2 研究方法

1.2.1 先症者靶基因高通量测序

根据德国QIAGEN公司的QIAmp DNA mini kit(QIAGEN，德国)试剂盒操作说明书，从外周血中提取基因组DNA；按照Ion AmpliSeq^TM Library Kit 2.0试剂盒的操作方法，构建包括PKD1和PKD2基因全部外显子及剪切区域的文库，并对文库进行扩增及富集；使用Ion PGM Hi-Q View Sequencing 200 Kit v2(Catalog No.A30043；美国Life Technologies公司)在Ion Torrent PGM平台上进行测序反应。采用the Ion Torrent Suite TM v3.6分析系统对测序结果进行分析。检测出的变异，去除同义突变，去除基因携带频率＞5%的突变(参考数据库为dbSNP138，1000 Genomes，ExAC东亚人群基因突变频率)后，并用Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org)、Polyphon、Shift软件预测其功能。

1.2.2 Sanger测序验证

针对高通量测序结果检出的可疑致病突变设计引物，进行PCR扩增：每25 μL含0.25 μL Primer STAR^ⓡ HS DNA Polymerase, 1.25 μL上下游引物，2.5 μL PCR缓冲液，1 μL GCBuffer, 1 μL基因组DNA 50~100 ng，2.5 μL dNTP，去离子水补至25 μL。扩增条件：95 ℃预变形5 min；95 ℃变性5 min，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35轮循环，最后72 ℃延伸5 min。反应产物纯化后，在ABI3730测序仪上测序，并用Sequencher 4.9进行序列比对分析。

1.2.3 变异致病性分析

根据美国医学遗传与基因组学会(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的遗传变异分类标准与指南对变异进行分级。

2 结果 2.1 家系临床表型分析

根据先证者主述，家系1有9人患有多囊肾病，其中男性3人，女性6人；家系2有11人患有多囊肾病，男性4人，女性7人；家系3有9人患病，男性4人，女性5人，3个家系均符合常染色体显性遗传模式(图 1A、2A、3A)即多代遗传，与性别无关。超声结果显示，3个家系的先证者双侧肾均有不同程度的多囊(图 1B、2B、3B)。根据慢性肾脏病分期标准，家系1先证者肾功能正常；家系2先证者双侧肾体积增大，肾功能中度受损，属G3a期；家系3先证者肾功能严重受损，属G5期(表 1)。

2.2 靶基因测序结果分析

对来自3个家系的先证者进行靶基因测序分析，发现家系1先证者PKD1基因15号外显子存在c.5933delA(N1978fs*36)杂合缺失突变，家系2先证者PKD1基因15号外显子存在c.6871C>T(G2291X)杂合无义突变，家系3先证者的PKD1基因5号外显子存在c.894_897delCCCT(P299fs*34)杂合缺失变异(表 1)。检索NCBI、人类遗传疾病突变数据库(Human Gene Mutation Database，HGMD)和常染色体显性遗传多囊肾数据库(ADPKD Mutation Database)表明，c.6871C>T(Glu2291X)位点的无义变异为已知致病突变，c.894_897delCCCT和c.5933delA未见相关报道。Mutation Taster预测PKD1基因c.894_897delCCCT和c.5933delA两个位点杂合缺失变异致病可能性大。

2.3 家系成员致病位点分析

对家系1、2、3的先证者及其家系成员的PKD1基因相应突变进行Sanger测序分析。结果显示：家系1患者(Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅲ-7、Ⅳ-1、Ⅳ-2、Ⅳ-5，图 1C)均检测到c.5933delA缺失变异；家系2患者(Ⅱ-4、Ⅲ-6、Ⅲ-8、Ⅲ-9、Ⅳ-1、Ⅳ-3、Ⅳ-8，图 2C)样本中检测到c.6871C>T(G2291X)无义突变；家系3患者(Ⅱ-3、Ⅲ-1、Ⅲ-7、Ⅳ-1、Ⅳ-2、Ⅳ-5，图 3C)样本检测到c.894_897delCCCT缺失变异，3个家系的无症状者成员均不携带此变异，符合表型和基因型相分离的特点。

根据美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)关于遗传变异分类标准，我们认为其中2个移码突变可能为致病性变异，依据如下：经检索ExAC和1000G数据库，均未发现该变异，符合PM2；该2个缺失变异均导致其编码的蛋白质长度发生截断，符合PM4；家系多个患者中检测到此变异，变异与疾病在家系中共分离，符合PP1；Mutation Taster软件预测，该2个缺失移码变异具有致病性，属于PP3；家系患者符合ADPKD的临床表现，提供支持致病性证据PP4。综合以上分析，该2个突变为PM2+ PM4+PP1+ PP3+PP4，符合可能致病性突变的诊断标准(表 1)，很可能是家系1及家系3的致病突变。经查阅文献和数据库，该2个变异未见报道，为新突变。

3 讨论

遗传性多囊肾病(APKD)主要有两种遗传模式，即常染色体显性遗传(ADPKD)多囊肾病和常染色体隐性遗传(ARPKD)多囊肾病。ARPKD主要致病基因是PKDH1^[7]，发病率只有1/40 000~1/20 000，多数早年夭折，很少存活至成年；ADPKD发病率相对较高，有明显的家族发病特征，发病时间较晚，主要致病基因是PKD1和PKD2。其中约85% ADPKD患者是由PKD1基因突变导致的，仅有约15%的ADPKD是由PKD2基因突变引起的^[8-9]。患有这种疾病的人大约有一半会发展为终末期肾脏疾病，需要进行透析或肾移植。患者进展为终末期肾病通常发生在40~60岁之间^[10]。治疗方面，有临床研究发现，血管加压素V2受体抑制剂托伐普坦，能降低细胞内cAMP的水平，可延缓ADPKD进展，但不良反应发生率高，因此至今尚没有理想的控制ADPKD进展的药物^[11]。目前，临床上尚无有效的治疗方法，只能对症处理。由于该病发病晚，早发现、早预防或避免致病基因向下一代传递都依赖于致病基因的明确诊断。

本研究在2个ADPKD家系中分别发现了PKD1基因的2个新缺失移码突变，即c.894_897delCCCT(p.299Sfs*34)和c.5933delA(p.N1978Tfs*138)。据梅奥多囊肾数据库(ADPKD Mutation Database)统计，移码突变(449个)占收录的1 273个PKD1致病变异的35.3%，是PKD1突变的常见类型。PKD1编码多囊蛋白PC1，属于跨膜蛋白，由4 303个氨基酸组成，结构类似G粘连蛋白偶联受体(GPCRs)^[12-13]，PC1和PC2(PKD2编码蛋白)的羧基端在胞内形成异二聚体，调控胞内液体和Ca²⁺的流入。研究表明，PC1和PC2结构变化可能影响G蛋白和cAMP信号通路从而导致囊肿生成^[14]。该2个移码突变均位于PKD1基因编码的PC1蛋白胞外N端区域，其对蛋白功能的影响，尚需要进一步功能实验进行分析。

研究报道，PKD1截断、PKD1框内插入/删除、PKD1非截断发生率分别为38.3%、4.3%、27.1%^[15]，并且相关研究显示PKD1突变类型与肾脏表型之间具有较强的相关性，PKD1基因突变的男性患者会更早进展到ESRD，与PKD1截断突变的患者相比，PKD1框内插入/缺失、PKD1非截断的患者具有较小的ESRD风险。在3个家系中，家系1和家系3为移码后发生的截断，家系2为无义突变导致的PKD1截断，符合多数突变类型为PKD1截断的报道。目前，家系2和家系3的肾脏病分期为G3a和G5期，表现为较严重的肾脏功能损害。家系1虽然也是PKD1截断突变，其肾脏功能尚无明显影响，鉴于本研究只有3例家系，尚需要更多的基因型-表型的数据来支持以上结论。

此外，PKD1和PKD2存在单个或多个外显子缺失或重复类型，基于高通量测序的基因检测不能检出该种突变，需要应用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)针对PKD1和PKD2进行检测，进而发现该种变异。我们建议，对于临床表现符合多囊肾诊断，而高通量测序检出阴性的病例，应利用后者对阴性病例进行筛查，以排除微重复和微缺失所导致的ADPKD。

总之，本研究丰富了PKD1的突变谱，也为3个多囊肾家系后续进行遗传咨询、家系中未发病患者的早期预防和治疗，以及产前诊断提供了有力的实验室证据。