结肠癌(colorectal cancer，CRC) 是常见的恶性肿瘤之一，其病死率在全球恶性肿瘤中位列前5[1]，严重威胁人类生命健康。研究表明高脂、高热量饮食、大量饮酒和缺乏运动都会增加患结肠癌的风险，近年来，随着人均生活水平的提高、饮食习惯的改变，结肠癌患病率呈现逐渐上升的趋势[2-3]。尽管其治疗取得了进展，但5年存活率仍然不高[4]。因此，深入研究其发生发展机制，寻找新的检验及治疗靶点非常必要。微小RNA(microRNA, miRNA)是一种单链非编码小片段RNA调控分子，可对包括肿瘤细胞在内的多种细胞的生物功能进行调节，包括细胞的生长发育、分化及凋亡等[5-6]。近年来，研究发现miR-138参与了结肠癌细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的调节[7-8]，提示miR-138与结肠癌的发生、发展密切相关，但其中涉及的病理生理学机制复杂，目前尚未研究清楚。因此，本研究探讨miR-138对结肠癌细胞凋亡的作用及可能的机制，以期为CRC的临床诊断和治疗的研究提供新的思路及靶点。
1 材料与方法 1.1 主要试剂人源性结肠癌细胞系HCT116、SW480、Caco-2、HT29、SW1116购自美国ATCC公司。RPMI1640及DMEM细胞完全培养基购自美国HyClone公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。PrimeScript RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。pAcGFPC1-SIRT1质粒，SIRT1 siRNA、miR-138 mimic(类似物)、miR-138 inhibitor(抑制物)、miR-138 negative control(阴性对照，NC)引物由广州锐博生物公司合成。pmirGLO vector、双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol购自美国invitrogen公司。BCA蛋白质定量试剂盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天公司。人β-actin抗体、沉默信息调节因子2相关酶1 (silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)、Caspase-3及Bcl-2抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与处理复苏冻存的HCoEpiC、HCT116、SW480、Caco-2、HT29、SW1116细胞，接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。48 h后制成单细胞悬液，调整细胞数为2×105/mL，接种至6孔板，培养24 h。采用Lipofectamine 2000转染miR-138 mimic、miR-138 inhibitor、miR-138 NC、pAcGFPC1-SIRT1质粒、SIRT1 siRNA至各实验组细胞。收集细胞上清液并提取总RNA，用于后续实验。
1.2.2 靶基因预测及双荧光素酶实验分析采用TargetScan、miRanda预测miR-138的靶基因，其中SIRT1在miR-138的3’UTR上有结合位点。用Lipofectamine 2000将荧光素酶报告载体(野生型SIRT1 3’UTR WT或突变型SIRT1 3’UTR MT)转染至上述处理后的细胞中，对照采用Renilla荧光素酶质粒。转染24 h后，用双荧光素酶报告分析系统进行检测。
1.2.3 siRNA干扰SIRT1表达根据人SIRT1 NM_001142498基因序列设计并合成siRNA。阴性对照：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正义链)，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(反义链)；SIRT1：5′-GAACCUUCCUCCUCUUCCUCCUCCT-3′(正义链)，5′-AGGAGGAGGAAGAGGAGGAAGGUUCUG-3′(反义链)。转染24 h后进行后续实验。
1.2.4 RT-PCR检测mRNA表达采用TaqMan miRNA assays检测miR-138的表达，反应条件为95 ℃预变性20 s，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸10 s，共40个循环；70 ℃总延伸3 min。miR-138引物序列：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGG-GGU-3′(正义链)，5′-ACCCCUAUCACGAUUAGCA-UUAA-3′(反义链)。采用PrimeScript RT-PCR试剂盒检测SIRT1、Caspase-3和Bcl-2 mRNA的表达，反应条件为95 ℃预变性1 min，1个循环；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环，72 ℃总延伸5 min。SIRT1引物序列：5′-TGGACAATTCC-AGCCATCTC-3′(正义链), 5′-GCGTGTCTATGTTC-TGGGTATAG-3′ (反义链)。Caspase-3引物序列：5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′(正义链), 5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′ (反义链)。Bcl-2引物序列：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′(正义链), 5′-ACTTCACTTGTGGCCCAGAT-3′ (反义链)。
1.2.5 Western blot检测相关蛋白表达将提取的蛋白样品通过SDS PAGE凝胶进行电泳，然后转移至PVDF膜，25 ℃，5%脱脂奶封闭2 h，TBST洗膜后加入对应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗，25 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次，加入配制好的发光液，避光孵育5 min，化学发光凝胶成像仪中采集图片信息，并进行灰度分析。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡将实验各组分别弃去上清，37 ℃预热的PBS洗涤3次，制成单个细胞悬液。轻轻吹打制成单个细胞悬液，100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC，室温孵育10 min；再加入5 μL PI溶液，室温孵育5 min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以x±s表示。统计数据采用单因素方差分析，多重比较方差齐时采用LSD法，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 结肠癌细胞HCT116、SW480、Caco-2、HT29、SW1116中miR-138表达水平应用RT-qPCR检测miR-138在人结肠癌细胞系HCT116、SW480、Caco-2、HT29、SW1116中的表达，同时检测miR-138在人正常结肠上皮细胞HCoEpiC中的表达作为对照。结果表明：与HCoEpiC细胞相比，miR-138在HT-29细胞中表达水平最高，在Caco-2细胞中表达水平最低(图 1)。
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| a：P < 0.05，与HCoEpiC比较 图 1 人结肠癌细胞系HCT116、SW480、Caco-2、HT29、SW1116中miR-138表达水平 |
2.2 双荧光素酶实验验证人结肠癌细胞中miR-138靶标分子及SIRT1表达水平分析
通过生物信息学分析预测并结合文献报道，初步筛选出miR-138在HT29细胞中潜在的靶标分子SIRT1，其3’-UTR序列与miR-138部分互补，且它们间的“种子序列(seed sequences)”在7-mer以上(图 2A)。把构建好的含SIRT1 3’-UTR结合位点的荧光素酶报告基团(p-SIRT1-UTR，UTR)、含SIRT1 3’-UTR突变体的荧光素酶报告基团(p-mut-SIRT1-UTR，mut-UTR)、空白对照质粒(pmirGLO-control)、对照载体及miR-138 mimics、miR-138 inhibitor、阴性对照共转染入HT29细胞。发现SIRT1 3’-UTR荧光素酶报告基团与miR-138 mimics共转染后，其荧光素酶活性明显下降，而与miR-138 inhibitor共转染其荧光素酶活性明显上升(P < 0.05，图 2B)。同时，共转染SIRT1 3’-UTR突变的荧光素酶报告基团与miR-138 mimics、或共转染miR-138 inhibitor后，其荧光素酶活性无明显下降(图 2B)。此外，载体对照及miR-138阴性对照对荧光素酶活性无明显影响。以上结果表明miR-138通过作用于SIRT1 3’-UTR抑制其表达，即在结肠癌细胞中，SIRT1是miR-138的直接靶标分子。
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| A：miRanda、TargetScan数据库预测miR-138与其靶基因SIRT1 mRNA 3′-UTR区域结合位点；B：双荧光素酶报告分析系统检测各组细胞荧光素酶活性 1：pmirGLO-control；2：UTR；3：UTR+miR-138 control；4：UTR+miR-138 inhibitor；5：mut-UTR+miR-138 inhibitor；6：UTR+miR-138 mimics；7：mut-UTR+miR-138 mimics；a：P < 0.01与pmirGLO control比较 图 2 人结肠癌细胞中miR-138靶标分子预测及验证 |
2.3 结肠癌细胞中miR-138对SIRT1表达的影响
将miR-138 mimics和miR-138 negative control(NC)分别转染至Caco-2细胞，转染48 h后检测结果显示: SIRT1 mRNA及蛋白水平均显著降低；同时，将miR-138 inhibitor和miR-138 negative control(NC)分别转染至HT29细胞，转染48 h后检测结果显示: SIRT1 mRNA及蛋白水平均显著升高(P < 0.05，图 3、4)，提示miR-138可在mRNA及蛋白水平抑制结肠癌细胞SIRT1的表达。
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a：P < 0.05，与miR-138 NC比较 A：Caco-2细胞中SIRT1 mRNA水平；B：HT29细胞中SIRT1 mRNA水平 图 3 RT-qPCR检测结肠癌细胞Caco-2、HT29中miR-138对SIRT1 mRNA表达的影响 |
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a：P < 0.05，与miR-138 NC比较 A：Caco-2细胞中SIRT1蛋白水平；B：HT29细胞中SIRT1蛋白水平 图 4 Western blot检测结肠癌细胞Caco-2、HT29中miR-138对SIRT1蛋白表达的影响 |
2.4 miR-138/SIRT1对结肠癌细胞凋亡的影响
将miR-138 mimics和miR-138 negative control(NC)分别转染至Caco-2细胞，同时，将miR-138 inhibitor和miR-138 negative control(NC)分别转染至HT29细胞，转染24 h后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示：经miR-138 mimics处理后，结肠癌细胞凋亡增多，而经miR-138 inhibitor处理后，细胞凋亡减少(P < 0.05，图 5)。RT-qPCR和Western blot检测结果显示：经siSIRT1或miR-138 mimics处理后，Caspase-3显著增加，Bcl-2显著降低，而转染pAcGFPC1-SIRT1质粒过表达SIRT1(SIRT1)或miR-138 inhibitor处理后，Caspase-3显著降低，Bcl-2显著升高(P < 0.05，图 6)。以上结果提示miR-138可通过其靶标分子SIRT1影响结肠癌细胞的凋亡。
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a：P < 0.05，与miR-138 NC比较 A：流式细胞仪检测Caco-2、HT29细胞凋亡水平；B：Caco-2细胞凋亡率；C：HT29细胞凋亡率 图 5 过表达、抑制miR-138后结肠癌细胞凋亡水平 |
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a：P < 0.05，与miR-138 NC比较 A、B：RT-qPCR检测结肠癌细胞Caco-2、HT29中Cleaved caspase-3、Bcl-2 mRNA表达；C、D：Western blot检测结肠癌细胞Caco-2、HT29中Cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表达 图 6 过表达、抑制miR-138、SIRT1对结肠癌细胞凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2表达的影响 |
3 讨论
目前，对结肠癌最有效的治疗方法是根治性切除，其5年生存率可达到90%。但是由于许多结肠癌患者发现肿瘤时已发生转移，使结肠癌患者的长期生存率大大降低。研究发现当患者出现远处器官的播散时，患者5年生存率显著下降[4]。目前针对结肠癌的靶向治疗受到广泛关注，研究结肠癌发生及发展机制，寻找治疗结肠癌的有效靶标用于临床药物治疗具有重要的意义。
在细胞的各种生理功能中，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)扮演着关键角色[9]。CHEN等[7]的研究发现miR-199b-5p及其介导的DDR1和JAG1信号通路参与了结肠癌的转移。miR-138也被证实参与了CRC的发生、发展。XU等[8]的研究提示miR-138可通过其靶标分子PODXL抑制结直肠癌细胞的增殖和转移。有研究发现在奥沙利铂处理下，miR-138过表达的HT29/R和SW480/R细胞产生更多的ROS，进入凋亡过程[10]。还有研究显示环状RNA hsa_circ_0020397可通过促进miR-138靶基因的表达来调节CRC细胞活力，凋亡和侵袭[11]。但是它们在结肠癌中的作用究竟如何，研究甚少。双荧光素酶实验结果证实：在结肠癌细胞中，SIRT1是miR-138的直接靶标分子。且miR-138能在mRNA及蛋白水平抑制SIRT1的表达。提示miR-138可通过作用于SIRT1影响结肠癌细胞的相关生物学行为。不少研究提示miR-138与其靶标分子SIRT1共同参与了一些肿瘤的生理过程[12-14]，SIRT1是沉默信息调节因子2(silent information regulator 2, Sir2)基因的哺乳动物同源基因，其生理作用复杂，参与调节糖脂代谢、炎症、氧化应激、细胞衰老与凋亡等[15-16]。SUBRAMANIYAN等[17]研究发现SIRT1对线粒体凋亡及细胞周期有显著的影响。PAN等[18]的研究也显示：SIRT1/P53可诱导G0/G1细胞周期停滞，以及下游p21的上调和细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白E2表达的下调。提示SIRT1参与了结肠癌细胞凋亡的调节。本研究通过流式细胞仪检测对应实验组中结肠癌细胞的凋亡情况，结果显示：SIRT1的表达被miR-138抑制或被siRNA干扰后，结肠癌细胞凋亡显著增多，而当miR-138水平降低，无法抑制SIRT1表达时，或转染pAcGFPC1-SIRT1质粒使SIRT1的表达增加后，结肠癌细胞凋亡显著减少。
促凋亡分子Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其主要底物为多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP。Caspase-3可使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能，进而裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡[19]。Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，而Caspase-3引起的细胞凋亡过程可以被Bcl-2阻断[20]。研究显示：干扰SIRT1的表达可导致Bax表达增加，进而激活Caspase-3并抑制Bcl-2的表达，从而调节细胞凋亡[21]。SIRT1还可以影响p53的去乙酰化水平，而p53与Bcl-2分子存在相互作用，共同参与了细胞周期监控、细胞凋亡等生物学功能的调节[22-23]。因此，本研究对促凋亡分子Caspase-3及抑制凋亡的Bcl-2分子进行检测。结果显示：经siSIRT1或miR-138 mimics处理后，Caspase-3显著增加，Bcl-2显著降低，而miR-138 inhibitor处理或pAcGFPC1-SIRT1质粒转染增加SIRT1的表达后，Caspase-3显著降低，Bcl-2显著升高。这一结果提示：当miR-138表达下调时，SIRT1表达增加，促凋亡分子Caspase-3显著降低，抑制凋亡的Bcl-2分子则显著升高，进而使得结肠癌细胞的凋亡减少，细胞存活增加，由此可能进一步促进结肠癌的发展。
综上所述，在结肠癌细胞中，miR-138可通过其靶标分子SIRT1对凋亡进行调节，进一步深入研究将为阐明结肠癌发生、发展机制，寻找结肠癌诊疗和预后的早期检验标志物及治疗靶点提供新的思路。
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