动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症疾病，为多种心脑血管病的共同基础，其特征是炎性细胞和胆固醇在动脉壁中积聚并涉及全血管病变[1]。近年来，AS造成的心脑血管病死率在逐年上升，严重威胁着人类的健康[2]。而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)过度增殖和异常迁移是AS发生发展中的关键环节[3-4]，维持VSMCs增殖与凋亡之间的动态平衡，减少VSMCs的异常迁移对于维持血管正常生理功能至关重要，也是AS潜在的治疗靶点[5]。褪黑素(melatonin，Mel)是松果体分泌的一种吲哚类激素，具有抗炎与抗氧化、调节心血管系统功能的作用。既往的研究[6-7]发现，Mel可以作用于血管VSMCs，具有调节血管VSMCs的作用，但其具体的调节机制目前尚不明确，考虑可能与其抑制VSMCs的过度增殖有关。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low- density lipoprotein, ox-LDL)是导致动脉粥样硬化和血管钙化的关键因素，可促进血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化。本研究拟通过探讨不同浓度Mel对ox-LDL诱导的VSMCs增殖、细胞周期的影响，并检测与细胞周期及增殖相关蛋白的变化以阐明Mel调控血管VSMCs的分子机制，以期为治疗AS提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂细胞株：人VSMCs购于中国科学院上海细胞库。ox-LDL、Mel、胎牛血清与胰蛋白酶购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司，CCK-8试剂盒与PI试剂盒购自美国Promega公司，化学发光液(ECL)、RIPA裂解液与BCA蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物研究所。鼠抗PCNA、兔抗α-SMA、兔抗Cyclin A、兔抗P21、兔抗p-P21以及鼠抗β-actin抗体购自英国Abcam公司，兔抗ERK1/2与兔抗p-ERK1/2抗体购自美国CST公司，TRITC标记山羊抗兔IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG以及HRP标记山羊抗兔IgG抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2 细胞培养将VSMCs置于含10%胎牛血清、1% 青-链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱内进行培养，每隔2天更换1次培养液。待细胞长满培养瓶瓶底后，采用PBS缓冲液洗涤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化并传代培养，本实验选用第3~6代细胞进行。
1.3 细胞分组与处理使用终浓度分别为0、10、20、50、100 μg/mL的ox-LDL诱导VSMCs 48 h，检测各组细胞增殖情况。使用50 μg/mL的ox-LDL诱导VSMCs 0、6、12、24、48 h，检测各组细胞增殖情况。在50 μg/mL的ox-LDL诱导VSMCs 24 h基础上，使用终浓度分别为1、1×103、1×105、1×106 nmol/L的Mel处理VSMCs 48 h，检测各组细胞增殖情况。使用ox-LDL联合Mel处理VSMCs，具体分组包括：空白对照组(VSMCs正常培养不进行任何处理)，Mel组(1×105 nmol/L Mel处理VSMCs 48 h)，ox-LDL组(50 μg/mL ox-LDL诱导VSMCs 24 h)，ox-LDL+ Mel组(使用50 μg/mL的ox-LDL诱导VSMCs 24 h后，接着使用1×105 nmol/L的Mel处理VSMCs 48 h)，并进行后续实验。
1.4 CCK-8实验将生长良好的VSMCs以1×104/孔接种于96孔细胞培养板上，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中过夜培养。按照1.3进行不同处理，每孔设置3个复孔。接着，每孔加入10 μL CCK-8溶液，混合均匀并置于细胞培养箱内继续培养1 h，培养结束后，使用酶联免疫检测仪测定每孔在波长450 nm处的光密度值D(450)。
1.5 流式细胞术将生长良好的VSMCs接种于6孔细胞培养板，按照使用ox-LDL联合Mel处理VSMCs，并进行实验分组及药物干预，实验结束后收集细胞，PBS洗涤细胞，用预冷的75%乙醇重悬细胞，在-20 ℃下固定24 h，弃去乙醇，再次使用PBS洗涤并重悬细胞，每组取450 μL细胞悬液，加2 μL RNase在37 ℃下孵育10 min，再加入500 μL碘化丙啶，37 ℃避光孵育30 min，通过流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.6 免疫荧光染色细胞爬片，处理完毕后，取出6孔板中的载玻片，PBS洗涤玻片，用4% 多聚甲醛固定15 min。室温下采用0.2%Triton X-100透化15 min。用PBS洗涤玻片。用5%胎牛血清室温封闭1 h，分别将鼠抗PCNA(1∶100)、兔抗α-SMA(1∶50)作为一抗加入，以在4 ℃下孵育过夜。次日PBS洗涤玻片后，滴加TRITC标记的山羊抗兔IgG(1∶100)或FITC标记山羊抗鼠IgG(1∶100)作为二抗，暗室室温孵育1 h，PBS洗涤。滴加DAPI染细胞核10 min，PBS再次洗涤后封片，在荧光显微镜观察并进行图像采集。
1.7 Western blot检测将VSMCs按照ox-LDL联合Mel处理VSMCs，并进行实验分组及药物干预，收集各组细胞，使用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，按BCA蛋白检测试剂盒步骤测定蛋白浓度。制备10% SDS-PAGE胶，通过50 V恒压电泳1.5 h，各条带明显分开后将电压调整为110 V电泳1 h来分离蛋白，分离后切胶并在恒流200 mA下转膜4 h，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加鼠抗PCNA(1∶2 000)、兔抗α-SMA(1∶1 000)、兔抗Cyclin A(1∶1 000)、兔抗P21(1∶1 000)、兔抗p-P21(1∶1 000)、兔抗ERK1/2(1∶1 000)、兔抗p-ERK1/2(1∶1 000)、鼠抗β-actin(1∶1 000)抗体，在4 ℃下孵育过夜，次日加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶5 000)后室温孵育2 h，滴加化学发光液ECL显影，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白质的灰度值。
1.8 统计学分析采用SPSS 23.0软件分析，实验结果以
CCK-8法细胞活力测定结果表明，与空白对照组比较，10、20、50 μg/mL的ox-LDL处理VSMCs 48 h可显著促进细胞增殖(P < 0.01)，说明在一定范围(0~50 μg/mL)内，ox-LDL呈浓度依赖性地促进VSMCs增殖，其中50 μg/mL ox-LDL作用效果最为显著(P < 0.01)。而ox-LDL浓度继续增加至100 μg/mL时，VSMCs增殖率较对照组显著下降(P < 0.01，图 1A)。
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a: P < 0.01，与空白对照组比较 A：不同浓度ox-LDL对VSMC增殖的影响；B：50 μg/mL ox-LDL作用不同时间对VSMC增殖的影响 图 1 ox-LDL对VSMCs增殖的影响(n=5，  |
接着使用50 μg/mL ox-LDL处理VSMCs 6、12、24、48 h，与空白对照组(0 h)比较，6~24 h时ox-LDL呈时间依赖性地促进VSMCs增殖，其中50 μg/mL ox-LDL作用24 h效果最为显著(P < 0.01，图 1B)。因此后续实验选择50 μg/mL ox-LDL处理VSMCs 24 h建立ox-LDL诱导模型。
2.2 Mel对ox-LDL诱导的VSMCs增殖的影响CCK-8法细胞活力测定结果表明，与空白对照组比较，ox-LDL组(50 μg/mL ox-LDL处理VSMCs 24 h)VSMCs细胞存活率显著提高(P < 0.01)；而1、1×103、1×105、1×106 nmol/L的Mel均可不同程度抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖(P < 0.01)，其中1×105 nmol/L Mel处理下细胞存活率为50%左右，因此Mel处理浓度以1×105 nmol/L为宜(图 2)。
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a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与ox-LDL组比较
图 2
Mel对ox-LDL诱导下VSMCs增殖的影响(n=5， |
2.3 Mel对ox-LDL诱导的VSMCs细胞周期的影响
流式细胞仪分析细胞周期，结果显示，与空白对照组比较，ox-LDL组VSMCs内S期与G1期细胞显著增加，G2期细胞显著下降(P < 0.01)，而Mel组S、G1期细胞显著下降，G2期细胞显著增加(P < 0.01)；与ox-LDL组比较，ox-LDL+Mel组G1期与S期细胞显著下降，G2期细胞显著增加(P < 0.01，图 3)。
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A：流式细胞术检测结果；B：各组细胞周期统计分析a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与ox-LDL组比较
图 3
各组VSMCs细胞周期分布情况(n=5， |
2.4 Mel对ox-LDL诱导的VSMCs内PCNA与α-SMA蛋白表达的影响
免疫荧光染色检测结果显示，ox-LDL组VSMCs内有大量PCNA、α-SMA表达，均较空白对照组显著升高(P < 0.01)，而Mel组PCNA与α-SMA的阳性率较对照组显著下降(P < 0.01)；与ox-LDL组比较，ox-LDL+Mel组PCNA与α-SMA的阳性率显著下降(P < 0.01，图 4)。
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1：空白对照组；2：ox-LDL组；3：褪黑素组；4：ox-LDL+褪黑素组；a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与ox-LDL组比较
图 4
各组VSMCs细胞PCNA(A)、α-SMA(B)免疫荧光染色(左)与阳性表达定量分析(右) (n=5， |
Western blot检测结果与上述结果一致，与空白对照组比较，ox-LDL组VSMCs内PCNA蛋白与α-SMA蛋白表达显著升高，而Mel组PCNA、α-SMA蛋白表达显著下降(P < 0.01)；ox-LDL+Mel组PCNA、α-SMA蛋白表达较ox-LDL组显著下降(P < 0.01，图 5)。
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1：空白对照组；2：ox-LDL组；3：褪黑素组；4：ox-LDL+褪黑素组；a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与ox-LDL组比较
图 5
各组VSMCs细胞PCNA与α-SMA的蛋白表达量(n=5， |
2.5 Mel对ox-LDL诱导的VSMCs内Cyclin A、p-ERK1/2、p-P21蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示，ox-LDL组VSMCs内Cyclin A、p-ERK1/2蛋白表达显著升高，而p-P21蛋白表达显著下降(P < 0.01)。Mel组检测结果与此相反，即Cyclin A与p-ERK1/2蛋白表达显著下降，p-P21蛋白表达显著升高(P < 0.01)；与ox-LDL组比较，ox-LDL+Mel组Cyclin A与p-ERK1/2蛋白表达显著下降，而p-P21蛋白表达显著升高(P < 0.01，图 6)。
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1：空白对照组；2：ox-LDL组；3：褪黑素组；4：ox-LDL+褪黑素组；a: P < 0.01，与空白对照组比较；b: P < 0.01，与ox-LDL组比较
图 6
各组VSMCs细胞Cyclin A、p-ERK1/2和p-P21的蛋白表达量(n=5， |
3 讨论
AS是多种心血管疾病病理与生理的病变基础，虽然经过多年研究，但目前AS的发病机制尚未完全明确，其病变复杂漫长，并涉及脂质代谢紊乱、炎症免疫、氧化应激、细胞增殖等多种过程间的相互作用[4, 8]。VSMCs在维持血管形状和机械稳定性中起着主要作用，而VSMCs的异常增殖与迁移是AS发病的基础[3]。有研究表明，VSMCs过度增殖跟ox-LDL诱导的体内氧化和抗氧化平衡失调有关，氧化损伤导致了细胞向内膜下增殖，血管壁增厚和管腔狭窄，从而加速了AS病变进程[9-10]。因此，寻找控制VSMCs过度增殖的靶点和有效药物，已成为当前防治AS性心血管疾病的重要方法之一。既往的研究已经发现Mel可以影响VSMCs的增殖与迁移[6]，但其具体的机制尚不十分明确，我们考虑其可能是通过干预VSMCs细胞周期，从而抑制ox-LDL诱导的VSMCs增殖。
3.1 Mel可能通过干预细胞周期来实现对VSMCs功能的影响本研究使用不同浓度ox-LDL刺激VSMCs后发现ox-LDL在一定范围(0~50 μg/mL)内能够明显促进VSMCs的增殖，与他人既往的研究结果相一致。同时发现50 μg/mL ox-LDL诱导24 h可通过增加细胞S期与G2/M期比例、减少G0/G1期比例来加速细胞周期进程，并促进细胞增殖。细胞增殖活力是反映增殖程度的重要指标[11]，抑制VSMCs的周期循环进程已被认为是控制VSMCs增殖与迁移的有效策略[12]。
既往的研究提示Mel具有保护血管VSMCs功能，减少细胞凋亡的作用。因此，我们拟通过研究不同浓度Mel对ox-LDL诱导的VSMCs增殖的影响，来揭示Mel影响VSMCs的可能分子机制。首先，通过流式细胞仪分析细胞周期发现不同浓度的Mel可以抑制ox-LDL诱导的VSMCs增殖，并且这种作用随着Mel浓度增加而增强，但当Mel浓度超过1×105 nmol/L时，细胞存活明显减少。在1×105 nmol/L Mel作用下，细胞S期与G2/M期比例减少，并可使G0/G1期阻滞。由此表明，Mel可以通过干预细胞周期来抑制由ox-LDL诱导的VSMCs增殖。进一步的分子生物学研究也证实了这一点。通过上述实验结果，我们认为Mel可能通过干预细胞周期来实现对VSMCs功能的影响。
3.2 抑制ERK1/2信号通路，调控VSMCs细胞周期，可抑制VSMCs过度增殖细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)是MAPK的一个亚家族，是将信号从表面受体传导至细胞核并产生生物学效应的关键。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导ELK-1、ATF、Ap-1、c-fos和c-Jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持及细胞凋亡等多种生物学反应。既往的研究证实，激活ERK信号通路可促进主动脉平滑肌细胞增殖[13]。ox-LDL诱导VSMC增殖的同时，伴随MAPK的活化，并可诱导ERK1/2的活化。ERK1/2活化可激活其下游底物MSKl、P90RSK、C-Myc、ELK-1的磷酸化，从而启动细胞增殖功能。使用ERK1/2的特异阻断剂可抑制ox-LDL诱导的VSMCs的增殖。本研究在利用Mel干预ox-LDL诱导的VSMCs增殖过程，使用Western blot分析观察到ERK1/2信号通路变化，结果显示，ox-LDL可以诱导ERK1/2蛋白磷酸化，从而启动VSMCs增殖过程。而在使用Mel进行干预后，该过程可以被明显抑制。该结果提示，Mel抑制VSMCs增殖与其特异性阻断ERK1/2信号通路有关。
细胞增殖是通过细胞周期调控的，而细胞周期又受正调节因子和负调节因子的调节。Cyclin A作为一种细胞周期蛋白，能够通过调节DNA合成和促进细胞有丝分裂起到正向作用[14]。p21是一种重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程，同时又与肿瘤发生密切相关，在细胞的生理、病理过程中发挥着重要的作用。过去的研究证实p21能够与Cyclin D/cdk形成复合物使细胞周期停滞在G1期；它还可以通过C端与PCNA相互作用，阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性从而抑制DNA的合成，使细胞周期停滞[15]。既往研究发现Mel具有调节P21蛋白的功能[16]。本研究通过Western blot分析发现，Mel可以通过上调p21表达并抑制Cyclin A蛋白的作用，从而起到调控VSMCs细胞周期的作用。VSMC表型的转化是许多血管增生性疾病，如动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等和移植性血管病变中共同的细胞病理基础。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是平滑肌的标志物，常用来反映VSMCs数量及其收缩能力的改变[17]，是VSMCs早期分化的特异性标志，也是应用最多的收缩型标志蛋白。增殖细胞核抗原(PCNA)是反映细胞增殖的标志物，其表达水平的高低可反映细胞的增殖活性[18]。本研究分别通过免疫荧光染色和Western blot检测观察Mel对ox-LDL诱导的VSMC增殖标志物PCNA以及α-SMA表达的影响，结果发现，Mel可显著抑制由ox-LDL诱导的VSMCs内PCNA、α-SMA表达的升高。这些结果进一步揭示了Mel对VSMCs细胞周期的作用，可能通过调控VSMCs细胞周期，起到抑制VSMCs增殖的作用。VSMCs并不是终末端分化型的细胞，在血管发育过程中VSMCs从去分化型逐渐发展为分化型，在病理条件下又可以从分化型转化回去分化型。VSMCs这种随微环境因素变化调控表型发生逆转，在内膜损伤修复、血管性疾病发生发展进程中发挥重要作用。
综上所述，Mel具有抑制VSMCs增殖的作用，其机制可能是通过抑制ERK1/2信号通路，使得ERK1/2表达减弱，从而调节PCNA、α-SMA、Cyclin A蛋白及p21蛋白表达，调控VSMCs细胞周期，起到抑制VSMCs过度增殖的作用。本研究的结果可望为探索AS的发病机制及药物作用靶点提供新的思路和实验依据。
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