膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，总体上排名第九。据统计，男性膀胱癌的发病率是女性的3倍[1]。膀胱癌分为肌层浸润性膀胱癌(muscleinvasive bladder cancer，MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌(non-muscleinvasive bladder cancer，NMIBC)。NMIBC占新病例的70%~80%，并经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)进行治疗。但是，NMIBC患者治疗后复发率很高，需要多次复查，因此给患者的生活带来不便。膀胱镜检查仍是诊断膀胱癌和检测复发的金标准[2]。但仍然有大约30%的复发性肿瘤最终会发展成MIBC。这类患者通常采用以手术为主的综合治疗，涉及放疗、化疗及生物治疗等方法[3]。尽管治疗效果取得了进步，但目前还没有有效的治疗方法来阻止膀胱癌的发展[4]。因此，迫切需要阐明膀胱癌发生发展的分子机制，以开发出对该疾病的早期诊断和治疗的方法。
核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2)是编码核糖核苷酸还原酶的两个不同亚基之一。有研究表明，RRM2能够促进胶质母细胞瘤[5]、前列腺癌[6]及乳腺癌[7]等肿瘤的进展。但是在膀胱癌中的作用尚不明确。因此，本研究观察RRM2在膀胱癌中的表达，探讨其对膀胱癌细胞的增殖和侵袭等生物学的作用，并初步探索其可能的调控机制，以期为阐明膀胱癌的发生机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料收集2019年6月至2020年12月在本院泌尿外科行手术治疗、病理诊断为膀胱癌患者的膀胱癌组织和癌旁组织。人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1，人膀胱癌细胞T24、5637、Ej、BIU-8购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI1640培养基、F-12K培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Total RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)、Real-time PCR试剂盒购自天根公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；引物购自上海吉玛制药技术有限公司；抗RRM2抗体(ab57653)和抗GAPDH抗体(ab205719)购自英国Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Real-time PCR仪购自意大利Applied Biosystems公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；Transwell小室购自Corning公司。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学预测采用肿瘤基因图谱(TCGA)数据库(http://cancergenome.nih.gov/)及Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)分析RRM2表达。参考文献[8]用K-M Plot在线分析网站(https://kmplot.com/analysis/)进行生存分析。
1.2.2 细胞培养采用5种膀胱癌细胞系：5637、T24，Ej、BIU-87和正常的人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)。其中，5637、T24、Ej和BIU-87培养基包括RPMI 1640、10%胎牛血清和1%链霉素青霉素。SV-HUC-1培养方法包括：F-12K、10%的胎牛血清和1%的链霉素青霉素。以上均在37℃，5%CO2的培养箱中培养。
1.2.3 细胞转染合成靶向RRM2的3个siRNA进行转染并检测其沉默效率。siRNA序列及对照序列(Blank) 由吉凯基因合成，序列见表 1。将细胞接种到6孔板中至70%~90%汇合度。siRNA和LipofectamineTM 3000混匀后加入细胞中继续孵育一段时间进行后续实验。设置空白对照组(Blank)和阴性对照组(NC)。
| 基因 | 序列(5’-3’) |
| siRRM2-1 | CCAUCGAGUACCAUGAUAUTT |
| siRRM2-2 | GGAGCGAUUUAGCCAAGAATT |
| siRRM2-3 | GCACUCUAAUGAAGCAAUATT |
| Blank | GCAAGCTGACCCTGAAGTT |
1.2.4 总RNA和cDNA合成
根据制造商的方案使用TRIzol试剂从细胞中分离总RNA。然后，使用逆转录试剂盒20 μL含有1 μg RNA的体系中合成cDNA。将反应混合物在37 ℃下孵育5 min，在95 ℃下加热30 min，然后在冰上冷却。
1.2.5 实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测使用SYBR Premix Taq Ⅱ以GAPDH作为内部参照进行qRT-PCR。引物序列设计如下：RRM2正向5′-GTGGAGCGATTTAGCCAAGAA-3′；反向5′-CACAAGGCA-TCGTTTCAATGG-3′。GAPDH正向5′-GGAGCGAGA-TCCCTCCAAAAT-3′；反向5′-GGCTGTTGTCATACTTC-TCATGG-3′。每种20 μL反应混合物均包含引物0.5 μmol/L，10 μL SYBR Premix，7 μL RNase水和2 μL cDNA。使用Real-time PCR仪进行扩增，初始变性在95 ℃进行30 s；随后进行40个循环，分别是95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s和72 ℃ 30 s。所有反应重复3次。使用△△Ct方法对基因表达进行定量。
1.2.6 Western blot检测使用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物提取细胞蛋白，并使用碧云天BCA蛋白测定试剂盒测量浓度。将蛋白质样品(20 μg)在10%的凝胶上进行SDS-PAGE，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶在50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl和0.1%Tween-20(TBST)中封闭膜1 h，用鼠抗RRM2抗体(1 ∶4 000)在4 ℃过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG，1 ∶8 000)在TBST中于室温孵育1 h后显影。
1.2.7 CCK-8检测细胞增殖测定将细胞按4 000/孔接种在96孔板中。培养24 h后，将CCK-8试剂在不同时间点添加到平板中，然后在37 ℃孵育2 h。采用酶标仪测量波长450 nm处的光密度值[D(450)]。
1.2.8 Transwell实验检测细胞侵袭使用孔径为8 μm的Transwell室(Corning公司)，在上部室中预先涂上Matrigel基底膜基质(BD Biosciences公司)，将40 000个细胞接种在无血清培养基中的上腔中，并向下腔中添加500 μL补充有10%FBS的培养基。将细胞在37 ℃下孵育24 h或48 h后，将孔置于100%甲醇中以固定细胞，然后使用棉签小心地清除保留在腔室上侧的细胞。将已侵袭的细胞用台盼蓝染色，然后用PBS洗涤小室。使用奥林巴斯显微镜对5个独立视野拍摄照片。
1.2.9 组织芯片制作及染色标本经过2位病理学专家确诊后，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋后打孔标记，制成组织芯片。采用二步法免疫组化染色。
1.3 统计学分析取3次独立重复实验结果，采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。数据以 x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用双侧检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RRM2在膀胱癌患者中的表达及对生存的影响肿瘤基因图谱(TCGA)数据分析结果显示，RRM2在膀胱癌患者中有表达升高的趋势(差异表达倍数Log2Fold Change=4.546，P < 0.01，图 1A)。采用Oncomine数据库进一步分析显示，膀胱癌组织中RRM2 mRNA表达水平显著高于膀胱正常组织(n=157，Fold Change=5.388，P < 0.001，图 1B)。K-M Plot网站生存分析显示，RRM2高表达的患者总体生存率(overall survival，OS)较差(图 1C)。进一步检测10例临床膀胱癌样本及配对癌旁组织中RRM2的表达。结果显示，RRM2 mRNA在膀胱癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P < 0.01，图 1D)；组织芯片结果显示，在膀胱癌组织中RRM2蛋白表达也高于癌旁组织(图 1E)。
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| a：P < 0.01，与癌旁组织比较；b：P < 0.01，与正常组织比较. A：TCGA数据库分析；B：Oncomine数据库分析；C：不同RRM2表达水平膀胱癌患者生存分析；D：10例膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中RRM2 mRNA的表达；E：RRM2蛋白在膀胱癌患者中的表达(×100) 图 1 RRM2在膀胱癌组织中的表达及OS分析 |
2.2 膀胱癌细胞系中RRM2 mRNA表达增高
通过RT-qPCR检测RRM2在人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞系(5637、T24、Ej、BIU-87)中的差异表达情况。结果显示，与SV-HUC-1相比，5637和T24细胞系中RRM2表达升高(P < 0.05，图 2A)，而在Ej和BIU-87细胞系中，RRM2的表达相对较低。因此挑选高表达RRM2的5637和T24细胞进行沉默实验。
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| A、B：siRNA沉默RRM2 mRNA及蛋白的表达水平 a：P < 0.01，b：P < 0.05，与对照组(Blank和NC)比较C：CCK-8检测RRM2表达降低对膀胱癌细胞增殖的影响 a：P < 0.01，b：P < 0.05，与Blank组比较；D：膀胱癌细胞系中RRM2的表达情况 a：P < 0.05，与SV-HUC-1细胞比较；E: RRM2表达降低膀胱癌细胞侵袭指数的变化；F：Transwell检测RRM2表达降低对膀胱癌细胞侵袭的影响 a：P < 0.01，与Blank组比较 图 2 沉默RRM2对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响 |
2.3 下调RRM2抑制膀胱癌细胞增殖和侵袭
siRNA沉默5637细胞后采用qRT-PCR和Western blot评估其转染效率，选择效果最优的siRRM2-2作为沉默组(siRRM2)进行后续实验。结果显示，与空白对照组(Blank)和阴性对照组(NC)比较，沉默后siRRM2组细胞中RRM2的表达水平降低(图 2B、C)。CCK-8实验结果显示，与5637和T24细胞比较，siRNA转染后72、96 h显著抑制了膀胱癌细胞的增殖(P < 0.01，图 2D)。Transwell实验结果显示，与5637和T24细胞比较，siRNA转染后膀胱癌细胞的迁移能力显著减弱(P < 0.01，图 2E)。
2.4 RRM2沉默显著降低wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达为了探究膀胱癌中RRM2是否通过wnt/β-catenin信号通路影响膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在5637及siRNA转染的细胞中检测相关蛋白表达情况，结果发现沉默RRM2后，总β-catenin表达水平显著降低。同时，与对照组相比，RRM2沉默后，Wnt/β-catenin信号通路的下游蛋白，包括在肿瘤进展中起重要作用的细胞周期蛋白D1和c-Myc也显著降低(图 3)。表明抑制Wnt/β-catenin通路可能是RRM2沉默诱导膀胱癌细胞进展的潜在分子机制之一。
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| A：Western blot检测结果；B：半定量分析，a：P < 0.05，与对照组(Blank和NC)比较 图 3 沉默RRM2抑制Wnt/β-catenin信号相关蛋白的表达 |
3 讨论
膀胱癌由于早期预后不良和复发的问题，仍然是临床上的主要挑战。膀胱癌的癌变涉及多个致癌基因和多个抑癌基因的变化。因此，许多分子标志物可用于提供可信的方法来改善癌症的预后和治疗。但是，目前在应用方面却不尽如人意。
RRM2是致癌基因，不仅在膀胱癌中过表达，还在各种类型的肿瘤细胞中也过表达，例如乳腺癌、人类胶质母细胞瘤、前列腺癌等[5-6, 9-10]。本研究通过在线网站分析发现RRM2在膀胱癌中表达升高，并且与预后不良相关。通过qPCR在膀胱癌临床样本及细胞系中进行了验证。结果显示，与SV-HUC-1细胞比较，5637和T24细胞高表达RRM2，而在Ej和BIU-87细胞中，RRM2的表达相对较低。本研究发现在不同类型的膀胱癌细胞中，RRM2的表达情况不同，与文献[11]报道相同致癌基因在不同细胞中作用不同，甚至可以抑癌相符。
有证据表明，RRM2在癌症进展中的作用。LI等[5]研究表明，高表达RRM2促进胶质母细胞瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，但抑制细胞凋亡。SUN等[12]研究发现RRM2在人神经胶质瘤组织中表达水平增加，沉默RRM2抑制神经胶质瘤细胞的迁移及增殖。RRM2可能通过促进细胞的侵袭、迁移和VEGF表达，成为促进乳腺癌转移的促转移因子[13]。然而，关于其在膀胱癌中的表达模式及生物学功能的作用知之甚少。在这项研究中，我们确定了RRM2在膀胱癌组织中的表达升高，低表达RRM2可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
Wnt信号通路在各种生物学过程的调控中起着重要作用，包括细胞分化、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。REN等[14]研究发现，促进wnt/β-catenin通路后，miR-454-3p在转移性乳腺癌中扩增和表达增高，并且与乳腺癌患者的总体生存率和无复发生存率相关。YUE等[15]研究结果显示，由低氧神经胶质瘤细胞特征性表达和分泌的exo-miR-301a是Wnt/β-catenin通路的有效调节剂，然后通过靶向抗癌基因TCEAL7降低放射敏感性。REN等[16]研究发现经巨噬细胞条件处理的胰腺癌细胞的差异表达基因与wnt/β-catenin途径相关。因此，我们认为，RRM2上述表型可能也是通过靶向Wnt/β-catenin通路所实现。本研究结果表明，在膀胱癌细胞中，wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平降低。同样证明了在膀胱癌中RRM2可能通过wnt/β-catenin信号通路促进膀胱癌细胞的发展。
总之，本研究整合了来自TCGA及Oncomine数据库的数据，通过一系列的体外实验以揭示RRM2对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响，提示RRM2可能是膀胱癌的预后指标。但本研究也有一些不足，例如纳入的临床样本比较有限，需要更多的临床样本进行验证；其次对机制的探索不够充分，需要更多的实验来进一步明确机制。
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