坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是早产儿常见的炎症性胃肠道疾病,特别是在极低体质量出生的早产儿中,其发病率达9%,病死率在30%~50%[1]。NEC主要以肠道的炎症为特征,并伴有不同程度的出血、坏死和穿孔,严重者需要手术治疗[2]。存活的NEC患儿常伴有多种短期和长期并发症,包括肠道衰竭、短肠综合征、神经发育障碍等[3]。NEC与神经认知障碍之间的关系已经得到了很多研究者的证实。一项回顾性的研究表明,约40%的NEC患儿存在不同类型的神经发育障碍(neurodevelopmental impairment,NDI),如:脑瘫、视觉、听力和认知障碍,比未合并其他疾病的早产儿更严重、持续时间更久[4]。与药物治疗的NEC患儿相比,接受手术治疗的严重NEC患儿在脑核磁共振成像(MRI)上表现出严重的脑损伤,且预后更差[5-6]。这似乎表明NEC对新生儿大脑的影响程度与肠道损伤的严重程度相关。
在NEC患儿中,细胞因子特别是IL-1β、IL-6和TNF-α在NEC的发病机制中具有重要作用,可导致机体产生过度的炎症反应,并且与肠道损伤的严重程度相关[7]。临床研究发现,这些细胞因子在具有认知障碍的NEC患儿中升高更明显[8]。NEC发生脑损伤和NDI的作用机制还未完全阐明,围产期的全身炎症已被证明与新生儿脑损伤有关。由于肠道和全身炎症是NEC的主要过程之一,我们推测神经炎症可能参与了NEC脑损伤的发病机制。为进一步证明NEC肠道损伤的程度与脑损伤相关性,本研究拟通过建立坏死性小肠结肠炎模型,观察不同程度NEC的脑组织损伤情况和神经炎症的水平,为尽早减轻NEC患儿病情和改善神经发育结果提供新的预防策略。
1 材料与方法 1.1 实验动物60只新生5 d的C57BL/6小鼠购自重庆医科大学动物实验中心,雌雄不限,体质量2.0~3.0 g,饲养在重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心。本研究通过重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心伦理审查委员会批准(2020年2月)。
1.2 主要试剂Similac奶粉购自美国Abbott Laboratories;倍乐酷狗代乳粉购自PetAg;脂多糖(L2880)购自美国Sigma;4%多聚甲醛、柠檬酸钠修复液(pH=6.0)和组织自发荧光淬灭剂购自北京赛维尔公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;反转录和实时荧光定量PCR试剂购自MCE公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司;Nissl染色液(焦油紫法)和驴血清购自北京索莱宝科技有限公司;兔抗鼠Ibal抗体购自Abcam公司,兔抗鼠GFAP抗体购自CST公司,荧光二抗Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG和抗荧光淬灭封片剂均购自碧云天公司;DAPI染色液购自北京雷根生物科技有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 动物分组与NEC模型建立SPF级新生5 d的C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为CON组(n=20)和NEC组(n=40),CON组小鼠和母鼠同笼,母乳喂养,NEC组小鼠饲养在保育箱(温度36±1 ℃,湿度45%~60%)。按照CHEN等[9]的方法建立NEC模型,灌胃喂养配方奶30~50 μL/g,每日5次(8:00、12:00、16:00、20:00、23:00);在5%氧气的缺氧箱中缺氧10 min,每日3次(8:30、16:30、23:30);灌胃喂养脂多糖LPS 5 mg/(kg·d),连续建模4 d。
1.3.2 一般情况观察观察新生小鼠的活动度、腹胀、腹泻等情况,并记录每日的体质量和死亡情况。
1.3.3 组织取材最后一次喂养后12 h,断头处死所有小鼠,获取胃端至直肠的整段肠组织,观察肠道组织的大体形态;取回肠、空肠和十二指肠的肠道组织固定于4%多聚甲醛中;迅速剥离脑组织后将其一分为二,一半冻存于-80 ℃,另一半用4%多聚甲醛固定。
1.3.4 肠道组织HE染色CON组和NEC组的肠道组织经过甲醛固定,脱水,石蜡包埋后切成4 μm厚度的薄片,在烤箱烘烤2 h,二甲苯脱蜡后进行HE染色,中性树脂封片,在光学显微镜下观察肠组织病理形态学变化。根据DRUCKER等[10]的评分标准,采用双盲法评分,每个标本选取3个视野,取平均值作为每个标本的评分值,评分≥2分认定为发生了NEC。固有层和黏膜下层明显分离或(和)伴有局部绒毛脱落为轻度NEC(n=12);绒毛全部脱落或坏死为重度NEC(n=12)。
1.3.5 脑组织Nissl染色取CON组、轻度NEC组和重度NEC组的脑组织,经固定、脱水和包埋后在冠状位切片,切片厚度为4 μm,烤干后备用。经脱蜡至水后,取一部分脑片行Nissl染色,在Cresyl violet Stain中56 ℃滴染1 h,Nissl Differentiation分化1 min,梯度乙醇脱水后中性树脂封片。用光学显微镜观察海马的病理学变化。
1.3.6 荧光定量PCR检测脑组织炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平Trizol法提取脑组织中的总RNA,取2 μg总RNA按照反转录试剂说明书反转录成cDNA,以cDNA为模板扩增IL-1β、IL-6和TNF-α,GAPDH作为内参。反应条件设定为95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 20 s共40个循环。引物序列见表 1。
基因 | 序列(5′→3′) | 片段大小/bp |
IL-1β | 正义:CCAGCTTCAAATCTCACAGCAG 反义:CTTCTTTGGGTATTGCTTGGGATC |
175 |
IL-6 | 正义:CCAATTTCCAATGCTCTCCT 反义:ACCACAGTGAGGAATGTCCA |
182 |
TNF-α | 正义:TTCCGAATTCACTGGAGCCTCGAA 反义:TGCACCTCAGGGAAGAATCTGGAA |
144 |
GAPDH | 正义:TGAAGCAGGCATCTGAGGG 反义:CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG |
102 |
1.3.7 ELISA检测脑组织炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达水平
取冻存的脑组织,每20 mg组织加入200 μL含1 mmol/L PMSF的蛋白酶抑制剂,匀浆后离心(4 ℃,14 000 r/min)10 min,取上清液,根据ELISA试剂盒方法检测。
1.3.8 免疫荧光检测活化的小胶质细胞和星形胶质细胞数量脑组织的石蜡切片在二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,自来水冲洗3 min;柠檬酸钠修复液(pH值=6.0)修复15 min,PBS洗涤3次;组织自发荧光淬灭剂A室温孵育30 min,PBS洗涤3次;驴血清37 ℃封闭30 min,一抗4 ℃孵育过夜。次日PBS洗涤3次,荧光二抗室温孵育2 h;PBS洗涤3次,DAPI染色5 min,组织自发荧光淬灭剂B孵育5 min,PBS洗涤3次;抗荧光淬灭剂封片。在倒置荧光显微镜下采集数据图像,使用Image-J处理和分析图像。
1.4 统计学分析使用SPSS 24.0软件进行统计学分析,计量资料均采用
CON组小鼠活动度良好,无腹胀、腹泻;NEC组小鼠活动度差,出现不同程度的腹胀、腹泻。CON组小鼠体质量逐渐增加,NEC组小鼠的体质量逐日递减,两组差异具有统计学意义(P < 0.05,图 1A);CON组小鼠无死亡,NEC组小鼠死亡16只(40%),两组差异有统计学意义(P < 0.001,图 1B)。
2.2 NEC小鼠肠组织的大体形态和病理学改变
大体观察,CON组小鼠肠组织呈淡黄色,弹性佳,无扩张、积气;轻度NEC小鼠肠组织大部分呈淡黄色,弹性稍差,部分肠管扩张,积气;重度NEC小鼠肠组织弹性差,肠管积气、扩张明显,部分呈串珠样改变,见图 2A。肠道HE染色显示,回盲部是肠道损伤最重的部位,空肠和十二指肠也存在不同程度的损伤。CON组肠组织结构完整,肠上皮细胞结构连续,绒毛完整,固有层、黏膜下层和肌层无水肿或分离,无炎性细胞浸润。轻度NEC组小鼠肠组织结构紊乱,部分绒毛水肿或脱落,固有层和黏膜下层分离,并伴有黏膜下层和肌层水肿,少量炎性细胞浸润;重度NEC组小鼠肠组织结构消失,绒毛完全脱落,见图 2B。
2.3 NEC小鼠脑组织海马区的神经细胞缺失
Nissl染色显示,在海马CA1区,与CON组(125.83±6.40)相比,NEC组Nissl体数量减少,颜色变浅(P < 0.05);与轻度NEC组(103.83±7.93)相比,重度NEC组(75.50±8.87)Nissl体数量减少更明显(P < 0.05),见图 3;且相关性分析显示,肠道损伤越重,神经细胞缺失越多(r=-0.943,P < 0.001)。
2.4 NEC小鼠脑组织炎症因子的表达水平增加
RT-qPCR和ELISA结果显示,与CON组相比,NEC组小鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平均明显增加(P < 0.05),且重度NEC组小鼠脑组织的炎症因子表达水平明显高于轻度NEC组(P < 0.05,图 4、5)。
2.5 NEC小鼠脑组织海马区活化的小胶质细胞和星形胶质细胞增加
免疫荧光结果显示,与CON组(1.73±0.16,8.85±3.14)相比,在海马中,轻度NEC组活化的小胶质细胞(7.96±1.35)和星形胶质细胞(25.49±1.22)增加(P < 0.05),且重度NEC组(16.15±1.00,35.16±5.07)增加更明显(P < 0.05,图 6、7)。
3 讨论
NEC是新生儿期常见的严重胃肠道急症,常伴有肠道坏死和/或穿孔,可对神经系统的发育产生不良影响,且炎症在早产儿脑损伤的发生中具有重要。本研究应用NEC小鼠模型,研究不同肠道病变程度的NEC,其对应的神经病理学变化及神经炎症水平,结果提示NEC小鼠发生了急性脑损伤,且肠道病变越严重,缺失的神经细胞越多,大脑中的炎症因子和活化的胶质细胞越多。
本研究成功建立了NEC小鼠模型,并且发现在相同的干预条件下,NEC小鼠的肠道损伤程度不同,部分小鼠只出现了轻度的肠道损伤,而部分小鼠肠道损伤非常严重。肠道损伤后可破坏肠道屏障,导致大量的炎症介质释放和细菌入血,进而引起全身炎症反应[2]。NEC好发于早产儿,此时大脑处于快速、动态发育的关键时期,包括神经发生、神经元迁移和突触形成,容易受到各种炎症介质、缺血缺氧和营养不良等因素的影响[11]。因此NEC可能影响早产儿大脑的发育。海马参与学习记忆的形成,是早产儿脑损伤的敏感区域[12]。本研究发现,NEC小鼠海马区的神经细胞出现不同程度的缺失,这表明NEC可导致新生小鼠发生急性脑损伤。在早产仔猪的NEC模型中同样发现,海马区的神经细胞出现了损伤[13]。本研究进一步评估了肠道损伤程度和神经细胞数量之间的关系,结果发现,肠道损伤越重,缺失的神经细胞越多。这与临床上观察的结果相一致,与药物治疗的NEC患儿和非NEC患儿相比,接受手术治疗的严重NEC患儿脑损伤的程度更重[4]。这表明受损的肠道和大脑之间存在联系,肠-脑轴可能参与其中。肠道菌群失调激活的Toll样4受体(TLR4)是NEC肠道损伤的重要发病机制。TLR4激活后可引起肠道的CD4+ T淋巴细胞和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放,直接或间接作用于小胶质细胞引起脑损伤[14-15]。除此之外,失调的微生物还可通过引起和加剧全身炎症反应、增加血脑屏障通透性、产生各种神经递质以及影响迷走神经系统对大脑产生影响[16]。但是肠道菌群在NEC脑损伤中的具体作用机制还需进一步探索。
本研究结果显示:NEC可导致脑组织中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达以及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活增加。这表明NEC脑组织发生了神经炎症。BIOUSS等[17]的研究表明,与母乳喂养的小鼠相比,NEC小鼠的全身炎症和神经炎症均增加。在NEC仔猪脑组织中,神经炎症和缺氧相关的差异表达基因上调,活化的小胶质细胞增多[18]。肠道受损后释放的大量细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6,可通过产生全身炎症、破坏血脑屏障进入大脑引起炎症反应[19]。许多研究已证实,NEC小鼠不仅肠道屏障受损,血脑屏障和血脑脊液屏障也同样遭到破坏[13, 20]。细胞因子还可激活早产儿大脑中的星形胶质细胞和小胶质细胞,它们通过分泌细胞因子和趋化因子参与脑内的炎症反应。星形胶质细胞和小胶质细胞也表达细胞因子特异性受体,如IL-1β、TNF-α和干扰素-γ(IFN-γ)受体,并可被这些细胞因子激活,加剧脑内的炎症反应[21]。最新的研究表明,NEC小鼠肠道的CD4+ T淋巴细胞,可通过受损的肠道屏障和血脑屏障流向大脑,其释放的IFN-γ可激活小胶质细胞,从而引起认知功能障碍[15]。NEC患儿的脑损伤在影像学上主要表现为脑白质的异常,以少突胶质细胞的减少和髓鞘缺失为特征。早产儿大脑中的少突胶质细胞处于高度分化的状态,对炎症、缺血缺氧和氧化应激等因素具有高度易损性。各种细胞因子和胶质细胞的激活均可影响少突胶质细胞的分化和成熟,导致髓鞘形成障碍。在NEC动物模型中证实了认知障碍的发生与小胶质细胞激活导致少突胶质细胞减少和髓鞘形成受损有关[14]。由此可知,小胶质细胞的激活是NEC脑损伤的中心靶点。
综上所述,本研究发现NEC引起的急性脑损伤与肠道损伤的严重程度相关,神经炎症反应在脑损伤中起重要作用,特别是小胶质细胞的激活。我们应尽早制定合理的护理和治疗方案,减轻NEC肠道损伤的程度,并同时考虑到对早产儿神经系统的影响,尽早采取脑保护策略,从而改善NEC患儿的神经发育结果。
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