2. 857000 西藏 日喀则,陆军第953医院急诊医学科
2. Department of Emergency, No. 953 Hospital PLA Army, Shigatse, Tibet Autonomous Region, 857000, China
网状上行激活系统(ascending reticular activating system, ARAS)起源于脑干网状结构,主要包括蓝斑、桥脚背盖区/背外侧背盖区、中缝背核(dorsal raphe, DRN)等核团[1-2]。ARAS分别发出经中脑-下丘脑-基底前脑的腹侧通路和经丘脑的背侧通路至大脑皮层,诱发皮层活动去同步化,参与皮层兴奋性和觉醒状态的调控。感觉输入一方面经丘脑上行到感觉皮层,形成感觉,另一方面躯体、头面部、视觉和听觉等特异性感觉上行传导通路经过脑干时,发出侧枝进入ARAS调控觉醒[3]。感觉输入具有唤醒作用,可诱发睡眠向觉醒的转换[3-4];降低感觉输入或感觉剥夺则导致觉醒水平降低[5]。
DRN位于脑干中缝,是ARAS的组成结构之一。DRN是5羟色胺(serotonin, 5HT)能神经元的集中分布脑区,同时还包含多巴胺能、谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元[6]。DRN神经元通过其全脑范围内的弥散投射参与调节多种行为,如觉醒、奖赏、应激、摄食和认知活动等[4, 7]。作为觉醒系统的重要组成部分,DRN神经元在觉醒期表现出最高水平的活动[4, 8],并可被多种与觉醒相关的感觉输入激活,如触觉、味觉和声音刺激等[4, 9]。基于狂犬病毒的逆行单突触示踪结果表明,DRN神经元接受脑干感觉中继核团的输入[10-11],但是感觉中继核团的种类和分布及其与DRN神经元间的连接模式尚未充分阐明。为此,本研究采用逆行和顺行神经环路示踪技术,观察DRN神经元接受的脑干感觉相关输入,为感觉输入参与调控ARAS活动及觉醒行为提供形态学基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物实验使用成年(8~12周龄)雄性SPF级C57BL/6小鼠, 体质量为25~30 g,购自陆军军医大学实验动物中心。小鼠饲养于光照/黑暗(12 h/12 h)环境中,自由摄食和饮水,环境温度维持在(22±1)℃。所有实验操作严格遵守陆军军医大学实验动物福利和伦理规范, 并尽量减少实验动物的痛苦和使用量。
1.2 方法 1.2.1 神经环路示踪实验将9只小鼠按随机数字表法分成3组:DRN+RetroBeads组、臂旁核(parabrachial nucleus, PBN)+AAV-CaMKIIα-EGFP组和PBN+RetroBeads组,每组3只。小鼠手术操作流程参考课题组已发表的工作[12]。小鼠在浓度为2%的异氟烷(瑞沃德公司,中国)中诱导麻醉5 min,然后将小鼠固定于单臂数显脑立体定位仪(瑞沃德公司,中国),手术全程在浓度为1.5%的异氟烷中进行。参照Franklin & Paxinos小鼠脑图谱,以前囟点作为目标脑区定位的坐标零点,对DRN(前囟后4.60 mm,中线旁开0.00 mm,脑膜下深度2.20 mm)和PBN(前囟后5.30 mm,中线旁开1.30 mm,脑膜下深度2.70 mm)进行立体定位。使用玻璃电极(3-000-203-G/X,Drummond Scientific公司,美国)吸取50 nL RetroBeads(Lumafluor公司,美国)或50 nL AAV-CaMKIIα-EGFP(上海和元生物技术公司,中国)。按照坐标将玻璃微电极缓慢推进到相应位置后停留5 min,注射速率为20 nL/min,注射完成后留针5 min,防止示踪剂漏出和回吸。手术结束后,缝合皮肤,单笼饲养,给予充足的食物与饮水。密切观察小鼠活动情况和精神状态,禁止非实验人员接触小鼠,避免外界干扰。
1.2.2 灌注与取材RetroBeads注射3 d或AAV-CaMKIIα-EGFP注射10 d后,将小鼠用含4% 多聚甲醛(158127,Sigma公司,美国)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS,ZLI-9061,中杉金桥公司,中国)灌流固定。小心将鼠脑取出后,置于4%多聚甲醛中后固定4 h,然后转移到含30%蔗糖(生工公司,中国)的PBS溶液中脱水直至鼠脑完全沉底。使用冰冻切片机(CM1900,Leica公司,美国)将延髓到中脑段部分做连续冰冻切片,切片厚度30 μm。
1.2.3 切片制作与标记神经元分析将切好的小鼠脑组织切片每3张取1张(即间隔90 μm)进行从延髓末端向中脑端进行连续贴片,待其自然风干后,使用含DAPI的防荧光淬灭封片剂(F6057,Sigma公司,美国)进行封片。组织切片使用荧光显微镜(BX53,Olympus,日本)和共聚焦显微镜(Zeiss公司,德国)获取图像,注射位点RetroBeads感染范围超过70%纳入统计。各脑区被标记的神经元数量使用Image Pro Plus软件统计。
1.3 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件,以x±s表示实验结果。
2 结果 2.1 鉴定投射至DRN的脑干感觉中继核团种类和分布特异性感觉传导通路在经过脑干、丘脑(thalamus) 进而上行至大脑皮层(cortex)产生特定感觉的过程中,还发出纤维侧支调控ARAS的活动(图 1A)。为了观察ARAS内DRN接受的脑干感觉中继核团种类和分布,向小鼠DRN注射逆行示踪荧光微粒RetroBeads(图 1B)。RetroBeads注射3 d后,灌注固定并分离小鼠脑组织,进行全脑干切片。通过无偏倚的检测RetroBeads标记的神经元并将其所在脑区与标准小鼠脑图谱进行比对[14],进而鉴定DRN接受的脑干感觉中继核团种类和分布模式。在本研究的实验条件下,中继躯体和头面触压觉、本体感觉及痛温觉的薄束核(gracile nucleus, Gr)、楔束核(cuneate nucleus, Cu)以及三叉神经感觉主核(principal sensory trigeminal nucleus, Pr5)和三叉神经脊束核(spinal trigeminal tract, Sp5)中未发现明显RetroBeads标记的神经元(图 1C、D),提示DRN不直接接受上述感觉中继核团的输入。听觉中继核团上橄榄核(superior paraolivary nucleus, SPO)中有少量RetroBeads标记神经元(图 1E),占DRN脑干总输入的3.11%。其他听觉相关核团如蜗腹侧核(ventral cochlear nucleus, VC)、蜗背侧核(dorsal cochlear nucleus, DC)及斜方体核(nucleus of the trapezoid body, Tz)未发现RetroBeads标记的神经元。在本研究的实验条件下,味觉中继核团孤束核头侧(rostral nucleus of the solitary tract, rNTS)与内脏感觉中继核团孤束核尾侧(caudal nucleus of the solitary tract, cNTS)中有较多RetroBeads标记的神经元(图 1F),分别占DRN脑干总输入的2.95%和10.40%。此外,平衡觉中继核团前庭神经核群中前庭内侧核旁细胞部(medial vestibular nucleus, parvicellular part,MVePC)和前庭内侧核巨细胞部(medial vestibular nucleus, magnocellular part,MVeMC)有较多RetroBeads标记的神经元(图 1G),分别占DRN脑干总输入的10.45%和1.75%。上述结果显示,DRN不接受直接的躯干四肢和头面部触压觉、本体感觉以及视觉输入,但是接受味觉和内脏感觉中继核团NTS、听觉中继核团SPO以及平衡觉中继核团Ve的直接输入,提示这些感觉输入可以直接参与调控DRN神经元在觉醒/睡眠周期中的活动。
2.2 PBN与DRN的神经环路联系特征
在本研究的实验条件下,通过在DRN注射RetroBeads(图 2A),发现PBN中外侧臂旁核(lateral parabrachial nucleus,LPBN)和内侧臂旁核(medial parabrachial nucleus,MPBN)有大量RetroBeads标记的神经元(图 2B),分别占DRN脑干总输入的51.52%和19.81%,表明DRN接受PBN的输入。此外,进一步观察投射至DRN的PBN神经元在大脑前后轴径上的分布模式。统计分析结果显示,投射至DRN的PBN神经元在其前后轴径上逐渐减少,主要集中在PBN偏前部与中部,在后部分布较少(图 2C、D)。为了进一步验证PBN与DRN的环路联系,采用顺行示踪的方法观察PBN神经元末梢在DRN的分布情况。为此,在小鼠PBN注射顺行示踪病毒AAV-CaMKIIα-EGFP特异性标记谷氨酸能神经元(图 2E)。病毒感染10 d后,发现在DRN内有大量EGFP标记的PBN神经元纤维末梢(图 2F)。以上结果显示,DRN接受PBN的大量神经输入,PBN神经元末梢能够投射到DRN区域。
2.3 鉴定投射至PBN的脑干感觉中继核团种类和分布
逆行和顺行示踪实验结果显示,DRN接受大量(71.33%)来自PBN的输入。基于此,推测PBN可能是DRN接受脑干感觉输入的中间节点,即感觉中继核团首先向PBN发出投射,再通过PBN进而投射至DRN(图 3A)。为验证该假设,在PBN注射RetroBeads,观察其接受的脑干感觉中继核团分布情况(图 3B)。与DRN接受的感觉输入类似,在味觉中继核团rNTS与内脏感觉中继核团cNTS有大量RetroBeads标记的神经元(图 3C),分别占PB脑干总输入的11.67%和20.53%。同时,在平衡觉中继核团MVePC可见较多的RetroBeads标记神经元(图 3D),占PB脑干总输入的8.94%。与DRN接受的感觉输入不同,在中继头面部痛温觉、触压觉的Pr5和Sp5中发现大量RetroBeads标记的神经元(图 3E、F),分别占PB脑干总输入的6.14%和49.86%,提示PB接受头面部痛温觉和触压觉输入。此外,还在脑干感觉输入中继核团下橄榄核(inferior olive, IO)发现少量标记的神经元(图 3G),占PB脑干总输入的2.14%。以上结果提示,头面部触压觉、痛温觉,听觉,味觉、内脏感觉,平衡觉相关中继核团可以直接或间接通过PBN来调控DRN的活动,进而参与相应的生理活动。
感觉中继核团类型 | 核团 | 中缝背核(DRN) | 臂旁核(PBN) | |||||
均值(标准差) | 百分比 | 数目 | 均值(标准差) | 百分比 | 数目 | |||
躯干触压觉、本体感觉 | 薄束核(Gr) | - | - | - | - | - | - | |
楔束核(Cu) | - | - | - | - | - | - | ||
头面部触压觉、痛温觉 | 三叉神经感觉主核(Pr5) | - | - | - | 446.67 (248.57) | 6.14% | ++ | |
三叉神经脊束核(Sp5) | - | - | - | 3629.33 (406.34) | 49.86% | ++++ | ||
视觉 | 视束副核 | - | - | - | - | - | - | |
听觉 | 蜗腹侧核(VC) | - | - | - | - | - | - | |
蜗背侧核(DC) | - | - | - | - | - | - | ||
上橄榄核(SPO) | 33.67 (14.84) | 3.11% | + | - | - | - | ||
斜方体核(Tz) | - | - | - | - | - | - | ||
味觉、内脏感觉 | 孤束核头侧(rNTS) | 32.00(12.67) | 2.95% | + | 849.33(248.92) | 11.67% | +++ | |
孤束核尾侧(cNTS) | 112.67(5.19) | 10.40% | ++ | 1494.67(102.85) | 20.53% | ++++ | ||
平衡觉 | 前庭内侧核旁细胞部(MVePC) | 113.33(27.78) | 10.45% | ++ | 651.00 (330.83) | 8.94% | +++ | |
前庭内侧核巨细胞部(MVeMC) | 15.00(6.48) | 1.75% | + | - | - | - | ||
脑干多种感觉中继核团 | 内侧臂旁核(MPB) | 214.67(56.41) | 19.81% | ++ | - | - | - | |
外侧臂旁核(LPB) | 558.33(28.00) | 51.52% | +++ | - | - | - | ||
下橄榄核(IO) | - | - | - | 156.00 (128.66) | 2.14% | ++ | ||
-:无,+:<50,++:<500,+++:<1 000,++++:>1 000 |
3 讨论
感觉输入是维持觉醒系统兴奋性的重要因素。面对外部环境的感觉输入刺激时,能够由睡眠转为觉醒状态以及觉醒水平升高,对提升反应能力以及维持个体生存至关重要[17]。觉醒由弥散分布于脑内的觉醒系统活动控制[1-2],而感觉输入是通过怎样的神经环路调控觉醒系统神经核团的活动,目前仍未充分阐明。本研究发现ARAS的DRN神经元接受听觉(SPO)、内脏感觉和味觉(NTS)以及平衡觉(Ve)传导通路的直接输入,并可通过PBN间接接受头面部触压觉、痛觉和温度觉(Pr5、SP5)输入。本研究是在DRN接受脑干感觉中继核团输入的基础上,进一步精细区分DRN接受的感觉中继核团种类及其连接模式,为感觉输入调控觉醒系统活动提供了神经环路基础。
DRN作为重要的觉醒脑区,可被多种感觉刺激激活。MORIYA等[9]通过在体光纤钙活动记录技术观察DRN 5HT能神经元活动,发现痛觉和温度觉刺激可显著激活5HT能神经元。此外,CHO等[4]发现听觉、味觉和痛觉等感觉刺激提高DRN多巴胺能神经元活动水平,并且抑制多巴胺能神经元明显降低听觉刺激诱发的睡眠向觉醒转换概率。本研究发现DRN可直接接受来自听觉传导通路中继核团SPO和味觉中继核团NTS的输入,这可能是听觉和味觉刺激激活DRN多巴胺能神经元的神经环路基础。虽然DRN不接受痛觉和温度觉的直接输入,但我们发现其接受大量的与痛觉和温度觉处理密切相关的PBN输入,提示PBN可能介导痛觉和温度觉刺激对DRN神经元的作用。需要表明的是,由于本研究使用的逆行示踪荧光微粒RetroBeads不具有细胞选择性,下一步需采用细胞特异性的示踪技术观察感觉中继核团如何与不同的DRN神经元类型建立突触联系。
PBN是包括痛痒觉、温度觉、味觉和内脏感觉等信息上行传递至大脑皮层的关键部位[13]。本研究显示PBN接受大量中继味觉和内脏感觉的NTS输入以及中继头面部触压觉、痛觉和温度觉的Pr5与SP5输入,与之前的研究报道一致[13]。PBN不仅是重要的感觉中继核团,同时也在觉醒调控中具有重要作用。化学遗传学激活PBN谷氨酸能神经元可通过基底前脑和下丘脑途径促进觉醒[14],而毁损PBN神经元或局部敲除囊泡型谷氨酸转运蛋白则减少觉醒时间[15]。由于痛觉、温度觉和内脏感觉刺激会激活PBN神经元,PBN可能是以上感觉刺激诱发觉醒的神经节点。此外,外侧PBN表达降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)的神经元还介导了高CO2诱发的觉醒[16],NTS可能在其中发挥了中继作用。
通过对比DRN和PBN接受的脑干感觉相关核团输入,我们发现感觉输入与DRN和PBN的联系表现为如下3种模式,即:同时支配至DRN和PBN,如NTS和Ve,提示内脏感觉、味觉和前庭觉等输入可同时直接传递至DRN和PBN神经元;只支配至DRN或PBN,如SPO仅投射至DRN,提示听觉输入直接传递至DRN而非PBN;经PBN中继后进而支配DRN,如Pr5、SP5,提示虽然DRN不直接接受头面部感觉输入,但是其可经PBN中继后进而影响DRN神经元活动。值得注意的是,DRN不仅直接或间接接受脑干多个感觉中继输入,而且其输入神经元种类可能也存在多样性。例如,PBN可以进一步区分LPBN和MPBN,二者在神经元类型和生理功能上均差别存在。虽然PBN主要由谷氨酸能神经元组成,但是LPBN谷氨酸能神经元表达多种肽类标记物,如强啡肽、胆囊收缩素和速激肽等,主要参与痛觉和温度觉反应[13, 17-18];而MPBN谷氨酸能神经元主要调控味觉反应[13]。本研究显示,DRN接受PBN的输入,LPBN和MPBN分别占DRN脑干总输入的51.52%和19.81%。上述连接模式一方面反映了DRN与脑干感觉中继核团连接的复杂性,另一方面也提示感觉输入可通过不同途径调控包括DRN在内的ARAS,为特殊情况下的感觉刺激诱发快速觉醒提供保证。
综上,本研究采用逆行和顺行神经环路示踪技术,观察了ARAS中DRN接受的脑干感觉中继核团输入。研究结果为深入了解感觉输入整合至觉醒系统的神经环路机制提供了初步依据。
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