肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的病死率在全球癌症死亡率中排名第二，并且是全球癌症相关死亡的第三大主要原因[1], 大约50%的HCC是由乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染引起的[2]。而在HBV中, 病毒调节蛋白HBx的长期稳定表达可以紊乱细胞转录和增殖，并使肝细胞对致癌因子敏感。在肝癌的早期，HBx是HBV的关键蛋白，起着重要作用，它被募集到细胞染色质中并调节特定遗传基因座的染色质动力学[3]。MiRNA是小的保守非编码RNA，可与靶基因mRNA分子的3'-UTR互补，从而促进靶基因mRNA的降解或抑制mRNA翻译。它在调节基因表达中起重要作用，并参与多种生物学过程。现有研究显示，HBx可通过上调或下调miRNA表达来诱导肝癌的发展[4-6]。MiRNA-145是目前已发现的抑癌基因, 其通过调节靶基因c-Myc和Kras的表达来调节肿瘤细胞的增殖[7-9]。而c-Myc和Kras作为原癌基因，在癌症发展过程中均为高表达[10]。miRNA-145在肝癌中作为抑癌基因处于低表达水平[11-12]，而在胃癌中，miRNA-145可以通过抑制靶基因c-Myc的表达来抑制胃癌细胞的增殖和侵袭[13]。
由于HBx是否能导致HCC这一理论和具体机制均尚未阐明，本研究采用转染HBx的肝前体细胞(HBx-EGFP-14-19)和转染HBx不同时间段的小鼠，观察HBx对miRNA-145a-5p及其靶基因c-Myc和Kras的调节作用；通过给予HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠(饲养至180 d)miRNA-145a-5p模拟物和抑制剂，观察miRNA-145a-5p对肝细胞的凋亡、增殖和周期的调节作用，探讨HBx诱导HCC的机制，为HBx导致HCC理论提供新的依据，也为HCC的诊断和治疗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞及动物永生化小鼠肝前体细胞株14-19由美国芝加哥大学分子肿瘤研究中心馈赠，经慢病毒转染后的EGFP-14-19(空载对照)和HBx-EGFP-14-19细胞株由本课题组前期构建并保存。无特殊病原体(specific pathogen free，SPF)级昆明小鼠由重庆医科大学动物中心提供并饲养。
1.1.2 主要试剂FBS胎牛血清购自CELL BOX公司，细胞培养基DMEM(高糖)购自HyClone公司，TRIzol总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，柱式microRNA抽提试剂盒和miRNA第一链cDNA合成(茎环法)试剂盒均购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，反转录试剂盒购自Vazyme公司，2×SYBR Green qPCR Master Mix购自Bimake公司，HBx抗体购自Abcam公司，GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司，c-Myc、Kras抗体购自Abcepta公司，Bad、Bax、Bcl-2抗体均购自Abclonal公司，CDK4、CyclinE抗体购自万类生物科技有限公司, CyclinE抗体购自Abways公司，EndoFectinTM-Max转染试剂购自GeneCopoeia公司，miRNA-145a-5p mimic、inhibitor、agomir、antagomir均购自莱博斯生物公司，CCK-8试剂盒购自MCE公司，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自碧云天生物技术公司，ECL显影液购自Advansta公司，DAB显色液及免疫组化SP试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养及分组肝前体细胞株14-19、EGFP-14-19、HBx-EGFP-14-19在含有10%胎牛血清的DMEM高葡萄糖培养基中于37 ℃，5%CO2条件下培养，并传代3次后进行后续测试。细胞转染时分为6组：①normal组(HBx-EGFP-14-19细胞)，②EndoFectin组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂)，③mimics-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+mimics-miR-145)，④mimics-NC-miR145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+mimics-NC-miR-145)，⑤inhibitor-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+inhibitor-miR-145)，⑥inhibitor-NC-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+inhibitor-NC-miR-145)。
1.2.2 动物模型的构建及分组根据课题组前期报道[14]，构建动物模型时，将小鼠分为3组：生理盐水组(n=10)、EGFP-14-19细胞组(n=10)和HBx-EGFP-14-19细胞组(n=40)。分别将200 μL生理盐水、EGFP-14-19细胞和HBx-EGFP-14-19细胞(5×105细胞悬浮于200 μL PBS)悬浮液通过肝门静脉注射入小鼠体内。选择6~8周龄的小鼠，手术前24 h禁食，乙醚麻醉小鼠，待小鼠昏迷后固定其四肢，用酒精对腹部进行消毒，剑突下行约2 cm纵向切口使肝门静脉暴露，用血管夹夹住门静脉远端，从近端缓慢注射。注射完成后，用PBS湿润的棉签按压止血，并在止血后迅速缝合腹腔。肝脏收集时间为手术后30、90、180、360 d。进行机理研究时将小鼠分为6组：①HBx 180 d组(n=10)，②HBx 180d-NS(生理盐水)组(n=10)，③HBx 180d-agomir-miR-145组(n=10)，④HBx 180 d-agomir-NC-miR-145(阴性对照)组(n=10)，⑤HBx 180 d-antagomir-miR-145组(n=10)，⑥HBx 180 d-antagomir-NC-miR-145(阴性对照) 组(n=10)。术后180 d，通过尾静脉注射agomir-miR-145a-5p、antagomir-miR-145a-5p、agomir-NC-miR-145a-5p、antagomir-NC-miR-145a-5p和生理盐水。24 h后对小鼠实施安乐死。所有收集的肝脏组织保存在4%多聚甲醛和液氮中，以备后续试验使用。
1.2.3 miR-145a-5p的agomir、antagomir、模拟物、抑制剂和对应NCmiR-145a-5p模拟物是双链RNA：有义序列(5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′)和反义序列(5′-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3′)，miR-145a-5p抑制剂为单链(5′-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC)，且与miR-145a-5p完全互补。非靶向的阴性对照序列(对于模拟物：有义序列5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′；反义序列5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUGUUGUGA-3′；对于抑制剂：5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3′)用作对照。模拟物和抑制剂用于体外实验；miR-145a-5p agomir和antagomir分别与模拟物序列和抑制剂序列一样，但对组织细胞的亲和力更高，因此将agomir和antagomir用于体内实验。
1.2.4 苏木素-伊红(HE)染色法小鼠肝脏切片脱蜡后染色并封片，于光学显微镜下观察拍照。
1.2.5 反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)总RNA和miRNA经提取后检测其质量和相应浓度，反转录试剂盒将RNA和miRNA(茎环法)反转录为cDNA，利用SYBR荧光定量法检测其浓度，检测体系为10 μL (cDNA 2μL，SYBR 5 μL，引物1 μL，无酶水2 μL)。引物序列见表 1。
| 基因 | 序列(5’-3’) |
| GAPDH | 上游：CTCGTCCCGTAGACAAAATGGT |
| 下游：GAGGTCAATGAAGGGGTCGTT | |
| HBx | 上游：TGCGGACGACCCTTCTCGGG |
| 下游：GGGCAACATTCGGTGGGCGT | |
| c-Myc | 上游：CCCAAGGGAAGACGATGACG |
| 下游：GCTGAGAAACCGCTCCACATAC | |
| Kras | 上游：GGACTCTGAAGATGTGCCTATGG |
| 下游：TGCTGAGGTCTCAATGAACGGA | |
| U6 | 上游：AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG |
| 下游：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG | |
| 上游：CGGTCCAGTTTTCCCAGGA | |
| miR-145a-5p | 下游：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT |
| 上游：TCCATCTGACCCTCCGCC | |
| Bcl-2 | 下游：CCCAGTTCACCCCATCCCT |
| 上游：CTCCGAAGGATGAGCGATGAG | |
| Bad | 下游：TTGTCGCATCTGTGTTGCAGT |
| 上游：TGAAGACAGGGGCCTTTTTG | |
| Bax | 下游：AATTCGCCGGAGACACTCG |
| 上游：GCGTACCCTGACACCAATCTC | |
| CyclinD1 | 下游：ACTTGAAGTAAGATACGGAGGGC |
| 上游：CTCCGACCTTTCAGTCCGC | |
| CyclinE | 下游：CACAGTCTTGTCAATCTTGGCA |
| 上游：TCAGCACAGTTCGTGAGGTG | |
| CDK4 | 下游：TCCATCAGCCGTACAACATTG |
1.2.6 Western blot检测
将适量的小鼠肝组织放入标记好的EP管中，加入200 μL预先配制的裂解液(RIPA ∶PMSF =100 ∶1)，用组织研磨机充分研磨后，在冰上放置30 min，每5分钟振动1次。裂解后，于4 ℃以12 000 r/min离心20 min，吸出上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。将上样缓冲液添加到剩余的上清液中，在100 ℃下加热15 min，然后在-80 ℃下保存。电泳分离蛋白质后将其转移到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，摇床上孵育一抗，于4 ℃下过夜。经TBST洗涤后，将PVDF膜与二抗在室温下孵育2 h。用ECL显色法显色，Analysis分析软件对目的条带进行检测分析。
1.2.7 细胞转染试验HBx-EGFP-14-19细胞在96孔(或6孔)平板中以1×105/mL的浓度培养。用EndoFectinTM-Max转染试剂转染miR-145a-5p mimic、miR-145a-5p mimic NC、miR-145a-5p inhibitor和miR-145a-5p inhibitor NC。转染24 h后，进行后续操作。
1.2.8 细胞增殖试验(CCK-8)在96孔板中以1×105/mL的浓度培养HBx-EGFP-14-19细胞，并根据上述转染方法对其进行处理。转染处理24 h后，向每个孔中添加10 μL CCK8试剂，并在37 ℃下孵育2~4 h，在多功能酶标仪上490 nm处测量光密度值D(490)。
1.3 统计学分析GraphPad Prism 5统计软件统计数据，数据以 x±s表示，采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 体内外HBx表达鉴定为了验证HBx是否成功转染到14-19细胞中，通过qRT-PCR和Western blot检测HBx-EGFP-14-19细胞中HBx的表达。与EGFP-14-19细胞和14-19细胞相比，HBx在HBx-EGFP-14-19细胞中特异性表达(图 1A、C、E)。qRT-PCR和Western blot结果也表明，与正常组小鼠和EGFP组小鼠相比，HBx-EGFP-14-19组小鼠在30、90、180、360 d能稳定表达HBx(图 1B、D、F)。
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| A、C、E：分别为HBx在细胞内mRNA和蛋白的表达 1：14-19细胞株组；2：EGFP-14-19细胞株组；3：HBx-EGFP-14-19细胞株组；a：P < 0.05，c：P < 0.001，与14-19组、EGFP-14-19组比较；B、D、F：分别为HBx在小鼠体内mRNA和蛋白的表达1：NS小鼠组；2：EGFP-14-19小鼠组；3~6：分别为30、90、180、360d的HBx-EGFP-14-19小鼠组；a：P < 0.05，c：P < 0.001，与NS小鼠组、EGFP-14-19小鼠组比较 图 1 细胞株及小鼠HBx的鉴定 |
2.2 miR-145a-5p，c-Myc和Kras在3种细胞株中的表达变化
与未转染HBx的14-19细胞相比，HBx-EGFP-14-19细胞中miR-145 a-5p的表达低于EGFP-14-19组和14-19组(图 2A)，而c-Myc和Kras的mRNA和蛋白质的表达增加(图 2)。
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| 1：14-19细胞株组；2：EGFP-14-19细胞株组；3：HBx-EGFP-14-19细胞株组；b：P < 0.01，c：P < 0.001，与14-19组、EGFP-14-19组比较。A：miR-145a-5p、c-Myc和Kras的mRNA表达；B、C：c-Myc和Kras的蛋白表达及半定量分析 图 2 miR-145，c-Myc和Kras在3种细胞株中的表达 |
2.3 miR-145a-5p，c-Myc和Kras在HBx小鼠不同时间时期的表达变化
与未转染HBx的小鼠相比，miR-145a-5p在HBx小鼠中的表达低于正常组和对照组，并且其表达随时间下降(图 3A)。c-Myc的mRNA表达在第30和90天，与对照组和盐水组相比无统计学意义，而第180和360天时其表达明显高于对照组和盐水组(图 3A)。然而，Kras的mRNA表达在30、90、180 d时，低于盐水组和对照组，但在第360天显着高于盐水组和对照组(图 3A)。在对c-Myc和Kras蛋白表达进行检测时发现, 在30、90、180、360 d的蛋白表达均高于盐水组和对照组(图 3B、C)。表明HBx可以在体内和体外将miR-145a-5p维持在较低水平，从而降低miR-145a-5p对c-Myc和Kras的调节作用，并促进原癌基因c-Myc和Kras的表达。
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| 1：NS小鼠组；2：EGFP-14-19小鼠组；3~6：分别为30、90、180、360 d的HBx-EGFP-14-19小鼠组；a：P < 0.05，b：P < 0.01，c：P < 0.001，与NS小鼠组、EGFP-14-19小鼠组比较。A：miR-145a-5p、c-Myc和Kras mRNA在各组HBx小鼠中的表达；B、C：c-Myc和Kras蛋白在各组小鼠中的表达及半定量分析。 图 3 小鼠感染HBx后不同时期miR-145、c-Myc和Kras表达变化 |
2.4 小鼠肝脏组织肿瘤鉴定
观察360 d的HBx小鼠肝脏组织时，发现一些小鼠有肉眼可见的直径约1 cm的结节性病变从肝脏表面突出。HE染色结果显示，肝小叶结构基本消失，肝细胞异型增生且大小不一，核染色质浓染及多核(图 4)。
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| A：肝肿瘤组织照片；B：正常肝组织；C：肝癌组织 图 4 小鼠肝脏组织肿瘤的鉴定结果 |
2.5 miR-145a-5p的上调抑制了HBx-EGFP-14-19细胞的增殖以及c-Myc和Kras的表达
首先检测miR-145a-5p，c-Myc和Kras的表达，结果表明，miR-145a-5p模拟物已成功转染到HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中。与对照组相比，miR-145a-5p的表达量升高可逆转由HBx引起的体外(图 5A~G)和体内(图 6)c-Myc、Kras、细胞周期因子和凋亡因子的异常表达。CCK-8结果表明，miR-145a-5p的过表达可以抑制HBx-EGFP-14-19细胞的增殖(图 5H)。
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| 1：mimics-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；2：mimics-NC-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；3：EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；4：HBx-EGFP-14-19细胞组；a：P < 0.05，b：P < 0.01，c：P < 0.001，与mimics-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组比较。A：miR-145、c-Myc和Kras mRNA表达；B：Bcl-2、Bad和Bax mRNA表达；C：CDK4、CyclinE和Cyclin D1的mRNA表达；D~G：c-Myc、Kras、Bcl-2、Bad、Bax、CDK4、CyclinE和Cyclin D1的蛋白表达及半定量分析；H：转染mimics-miR-145后HBx-EGFP-14-19细胞活力。 图 5 miR-145a-5p模拟物在体外的作用 |
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| 1：HBx180d-agomir-miR-145小鼠组；2：HBx180d-agomir-NC-miR-145小鼠组；3：HBx180d-NS；4：HBx180d；a：P < 0.05，b：P < 0.01，c：P < 0.001，与HBx180d-agomir-miR-145小鼠组比较 A：miR-145、c-Myc和Kras mRNA表达；B：Bcl-2、Bad和Bax mRNA表达；C：CDK4、CyclinE和Cyclin D1的mRNA表达；D~G：c-Myc、Kras、Bcl-2、Bad、Bax、CDK4、CyclinE和Cyclin D1的蛋白表达及半定量分析。 图 6 miR-145a-5p模拟物在体内的作用 |
2.6 下调miR-145a-5p可促进HBx-EGFP-14-19细胞增殖以及c-Myc和Kras的表达
与对照组相比，miR-145的体外表达量降低可促进由HBx引起的体外(图 7A~G)和体内(图 8)c-Myc、Kras、细胞周期因子和凋亡因子的异常表达。CCK8结果表明，miR-145a-5p的低表达可以促进HBx-EGFP-14-19细胞的增殖(图 7H)。
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| 1：inhibitor-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；2：inhibitor-NC-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；3：EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组；4：HBx-EGFP-14-19细胞组；a：P < 0.05，b：P < 0.01，c：P < 0.001，与inhibitor-miR-145+EndoFectin+HBx-EGFP-14-19细胞组比较。A：miR-145、c-Myc和Kras mRNA表达；B：Bcl-2、Bad和Bax mRNA表达；C：CDK4、CyclinE和Cyclin D1的mRNA表达；D~G：c-Myc、Kras、Bcl-2、Bad、Bax、CDK4、CyclinE和Cyclin D1的蛋白表达及半定量分析；H：转染inhibitor-miR-145后HBx-EGFP-14-19细胞活力 图 7 miR-145a-5p抑制剂在体外的作用 |
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| 1：HBx180d-antagomir-miR-145小鼠组；2：HBx180d-antagomir-NC-miR-145小鼠组；3：HBx180 d-NS；4：HBx180 d；a：P < 0.05，b：P < 0.01，c：P < 0.001，与HBx180d-antagomir-miR-145小鼠组比较。A：miR-145、c-Myc和Kras mRNA表达；B：Bcl-2、Bad和Bax mRNA表达；C：CDK4、CyclinE和Cyclin D1的mRNA表达；D~G：c-Myc、Kras、Bcl-2、Bad、Bax、CDK4、CyclinE和Cyclin D1的蛋白表达及半定量分析。 图 8 miR-145a-5p抑制剂在体内的作用 |
3 讨论
这项研究结果显示，当HBx显着上调时，它会导致肝癌的发生。miR-145a-5p的表达在HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中均被下调。miR-145a-5p的表达随转染HBx时间的增长而降低。而当过表达miR-145a-5p时可抑制HBx-EGFP-14-19细胞的增殖，下调miR-145a-5p则可促进HBx-EGFP-14-19细胞的增殖。机制研究表明，可能通过HBx-miR-145a-5p-c-Myc/Kras轴促进HCC的形成。
HBV在HCC的发生和发展中起着重要作用[15]。在HBV感染过程中，适应性免疫从免疫耐受转变为进行性免疫刺激, 经过失活，激活和疲惫后，它会触发免疫反应疾病因子[16]。HBx是HBV病毒中的关键基因片段，可干扰多种细胞过程，例如氧化，DNA修复，信号转导，转录，蛋白质降解，细胞周期进程和凋亡。HBx的致癌因素可能是HBx介导的转录反式激活和信号通路[17]。HCC具有较高的发病率和死亡率，当前有效的潜在治疗方法仍然仅限于手术切除和肝移植，给社会带来了沉重的负担[18]。在HCC的早期筛查中，并非总是能够找到最广泛使用的肝癌生物标志物-AFP(甲胎蛋白)。因此，迫切需要寻找新的诊断和特异性生物标志物用于靶向治疗[19]。
MiRNA失调可导致多种癌症并影响细胞稳态[20]。MiR-145可用于临床疾病的诊断，FU等[21]检测结核病患者血清中miR-145的表达，并通过绘制特定的受体曲线来评估miR-145的诊断准确性。HE等[22]研究显示，抗miR-145和减活miR-145均会触发小鼠肝脏的代谢性炎症。这从一定角度解释了HBx小鼠在老年期出现肝癌：miR-145在老年HBx小鼠中表达较低，从而导致了代谢性肝炎和HCC。
为了了解HBx是否可以通过调控miR-145a-5p表达导致肝癌的发生，我们使用两种不同的方法：抑制miR-145a-5p表达和过表达miR-145a-5p。结果表明，抑制miR-145-5p会导致细胞增殖和周期加快，细胞凋亡减慢以及肿瘤因子的过度表达。而miR-145a-5p的过表达结果则与抑制miR-145a-5p相反。
作为miR-145a-5p的靶基因之一，c-Myc已被证明为一种癌蛋白，在多种癌症(包括HCC)和预后中均高度表达[23-24]。在动物实验中发现，c-Myc的过度表达可导致低分化HCC的发生。目前，c-Myc被认为是“不可治疗的”[25-26]。而miR-145a-5p的另外一个靶基因Kras在人类肝癌中突变被认为是最高的过度表达，Kras属于Ras家族，HCC中发现Ras通路均被激活[27]。YE等[28]在转基因的Alb-Cre; Kras G12D小鼠中发现肝细胞特异性KrasG12D的表达可引起小鼠肝细胞癌，而在KrasG12D和HBx双转基因小鼠中，HBx的共表达促进了KrasG12D诱导的HCC的发生和发展。以上研究表明，寻找c-Myc和Kras的上游调控因子可以抑制HCC的发生发展。
然而，基于miRNA的疗法的实施仍面临重大挑战，主要是解决miRNA模拟物/抑制剂被循环RNA酶破坏并将miRNA准确地递送至病灶的问题。随着美国食品药品监督管理局(FDA)批准首个用于治疗可损害心脏和神经功能的罕见疾病的RNAi药物patisira，核酸药物已成为临床事实，也为核酸药物的临床应用带来了曙光[29]。随着新型冠状病毒的全球流行，RNA疫苗的研究也越来越多[30-31]。
综上所述，本研究通过观测miR-145a-5p在HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中的生物学功能，为miR-145a-5p作为肝癌的诊断物和靶向治疗奠定了基础，miRNA可能是今后在HCC进程中进行研究和干预的新方向。
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