2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院教学实验中心
2. Teaching and Experimental Center, College of Basic Medical Sciences, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是恶性程度最高的皮肤肿瘤，其发病率以每年3%的速度快速增长[1]。此前，除早期手术切除能获得相对较好的预后外，进展期MM，因对临床常规放化疗均不敏感，缺乏有效治疗手段，预后极差，尽管其发病率只占皮肤肿瘤4%，却占其死亡人数的75%[2]。近年来，针对丝/苏氨酸蛋白激酶BRAF的分子靶向治疗带来了突破性的进展，然而对于好发肢端型MM的亚洲人群而言，其应答率较低[3]，且易出现获得性耐药[4]，极大地限制了患者的临床获益。因此，探索MM新的分子治疗靶点及可能的作用机制对临床诊治意义重大。
NFATc3作为活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)家族成员之一，在食管癌[5]、三阴性乳腺癌[6]和恶性胶质瘤[7]等多种高恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。近年研究提示，NFAT与MM的进展有相关性[8]，但NFAT家族各亚型，尤其是NFATc3在MM中的表达与功能如何，目前尚不清楚。本研究探讨NFATc3在不同恶性程度黑素瘤组织及细胞中的表达及其与恶性度的关系，进一步通过Crispr/Cas9技术敲减NFATc3，验证NFATc3对MM发生、发展的影响，为临床治疗探索新的靶标提供依据。
1 材料与方法 1.1 主要耗材和试剂DMEM细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国HyClone公司；脂质体转染试剂(Lipofectamine 3000)购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所；CCK-8试剂盒及基质胶(Matrigel)购自北京索莱宝科技；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD公司；TB Green Premix Ex TaqⅡ试剂盒、PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自日本TaKaRa公司。
1.2 临床标本收集并筛选2014-2017年在陆军军医大学大坪医院手术后经病理证实的MM患者石蜡标本，其中未转移肿瘤组织标本20例，转移肿瘤组织标本11例。另选取癌旁组织标本3例作为对照。
1.3 Crispr/Cas9技术构建NFATc3敲减质粒NFATc3敲减质粒的构建使用lentiCRISPRv2-puro(#98290)为载体，使用BSMB Ⅰ酶切后，插入设计合成的sgRNA序列3对，sgRNA1-NFATc3正义链：5′-caccgAAGTTCTTGAGCAGACCGCT-3′，反义链：5′-aaacAGCGGTCTGCTCAAGAACTTc-3′；sgRNA2-NFATc3正义链：5′-caccgGATCAAGCTGCCATACTACC-3′，反义链：5′-aaacGGTAGTATGGCAGCTTGATCc-3′；sgRNA3-NFATc3正义链：5′-caccgCATCATCTATTGAAGTCTCC-3′，反义链：5′-aaacGGAGACTTCAATAGATGATGc-3′。重组的lentiCRISPRv2-puro质粒使用HindⅢ酶切及测序进行鉴定，转染293T细胞后使用Western blot检测在阴性对照组(转染sgRNA-NC)及敲减组(转染sgRNA-NFATc3)中NFATc3蛋白的表达。
1.4 细胞培养及转染4种人MM细胞系(皮肤原位来源MM细胞系A375和MeWo、神经节转移来源MM细胞系Mel-RM和肺转移来源MM细胞系Malme-3M)和永生化正常人色素细胞系PIG1(作为对照)均购自美国ATCC。上述细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37 ℃、5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养。待6孔板中细胞密度达到30%~40%时进行转染，sgRNA-NC及sgRNA-NFATc3转染用量为每孔3 μL，于转染48 h后收获细胞进行下一步实验。
1.5 免疫组化染色检测恶性黑素瘤组织的蛋白表达病理石蜡块制作3 μm切片，依次进行脱蜡、水化、抗原修复、脱色素、灭活、封闭后，使用兔抗NFATc3抗体(美国CST，1 ∶200)，4 ℃孵育过夜。二抗(羊抗兔HRP，美国Jackson公司)，孵育60 min。最后DAB显色，苏木精复染、封片。每张切片随机选取5个视野，按染色强度(无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分)及阳性细胞百分比(阳性细胞≤5%为0分、5% < 1分≤25%、25% < 2分≤50%、50% < 3分≤75%、4分>75%)分别计分。最终以染色强度计分×阳性肿瘤细胞百分比=每视野评分，取平均分作为切片终评分。
细胞爬片染色时，BSA封闭后，滴加稀释的一抗孵育液：鼠抗PCNA抗体(武汉博士德，1 ∶200)、兔抗Caspase-3抗体(美国CST，1 ∶200)，4 ℃孵育过夜。漂洗后，加二抗：羊抗鼠-cy3/抗兔-488(美国Jackson，1 ∶200)，孵育60 min。DAPI(武汉博士德，1 ∶1 000)复染核后封片并保存。使用Image Pro Plus(IPP)软件统计荧光染色阳性细胞比例。
1.6 qPCR检测不同细胞系NFATc3 mRNA表达设计NFATc3引物(Homo NFATc3正义链：5′-CACATCTTCATTACCTCCACTA-3′，反义链：5′-CCT-CGGCTACCTTCAGTT-3′，产物123 bp)。TRIzol法分别提取各组细胞的总RNA并逆转录成cDNA。以GAPDH(正义链：5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′，反义链：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，产物100 bp)为内参，SYBR Green试剂盒进行扩增，采用2-ΔΔCt法分析结果。
1.7 Western blot检测细胞中相关蛋白表达提取体外培养各组细胞中的蛋白，BCA蛋白定量后，每组样品加20 μg，电泳后经湿转转膜仪将蛋白移至PVDF膜上。BSA封闭2 h，加PBS稀释的一抗：兔抗NFATc3(#4998)/抗Caspase-3(#9662)/抗Cleaved Caspase-3(#9664)/兔抗Caspase-8(#4790)、鼠抗GAPDH(美国CST，1 ∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗：羊抗兔/抗鼠HRP(美国Jackson，1 ∶5 000)，室温孵育2 h；超敏发光试剂盒显影并进行分析。使用IPP软件统计条带灰度值。
1.8 CCK-8检测细胞存活细胞以3×103/孔接种在96孔板上，分为空白组和敲减组，每组5个复孔，在孵箱中培养24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h后用酶标仪在波长450 nm处检测光密度值[D(450)]。
细胞存活率=[实验组D(450)-空白孔D(450)]/ [对照组D(450)-空白孔D(450)]×100%
1.9 EdU检测细胞增殖细胞以5×103/孔接种在24孔板上，培养24 h。每孔加入50 μmol/L EdU溶液100 μL，继续在孵箱中培养2 h。随后每孔加入200 μL Apollo染色液，避光、37 ℃脱色摇床孵育30 min后，PBS漂洗2~3次。使用DAPI复染核后，封片并保存。使用IPP软件统计EdU阳性细胞比例。
1.10 流式细胞学及TUNEL染色检测细胞凋亡消化并收集细胞，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤后加入Binding Buffer悬浮细胞，Annexin V-FITC混匀避光孵育15 min，上机前5 min加入PI染液并分析凋亡细胞所占百分比。细胞以5×103/孔接种在24孔板上，培养24 h后，TUNEL荧光染色液于37 ℃避光孵育1 h，DAPI核复染，封片并保存。使用IPP软件统计TUNEL阳性细胞比例。
1.11 划痕实验检测细胞迁移能力每孔接种约5×105个细胞于6孔板中，在细胞铺满后，以直尺定位，用200 μL移液器枪头保持力度均匀、垂直于横线做“一”字划痕，随后加入无血清培养基，镜下观察并拍照，记录为0 h；置于细胞培养箱中培养24 h后在同一位置拍照。按公式计算细胞迁移率。
迁移率=(初始划痕面积-相应点划痕面积)/初始划痕面积×100%
1.12 Transwell小室实验检测细胞侵袭吸取5 mg/mL的Matrigel添加到孔径为8 μm的Transwell小室上室中，待胶体凝固后，用无血清培养基重悬饥饿12 h的细胞，调整浓度至1×105/mL，各吸取200 μL分别添加至上室后，在下室添加500 μL含15%血清的培养基，于培养箱中培养24 h后，0.1%结晶紫染色。
1.13 统计学分析使用SPSS 13.0统计软件。计量数据以x±s表示，进行组间t检验，P < 0.05被认为差异具有统计学意义。所有检测实验重复至少3次。
2 结果 2.1 NFATc3在不同MM组织及细胞系中的表达免疫组化染色显示，在转移灶癌组织(n=11)中NFATc3强阳性信号大量分布于胞核与胞质；在未转移癌组织(n=20)中可见散在分布的阳性信号；在癌旁组织几乎未见阳性信号(P < 0.01，图 1A、B)。qPCR检测结果显示，NFATc3 mRNA在MM细胞系和正常色素细胞系中均有表达，但在MM细胞系中高表达，并且转移灶来源的Mel-RM细胞系较原位来源的A375细胞系的高表达更为显著(P < 0.01，图 1C)。免疫荧光染色观察到NFATc3在Mel-RM细胞中荧光强度明显高于A375细胞(图 1D)。以上结果提示，NFATc3的表达与MM恶性程度有关。
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| A：免疫组化(酶标染色)比较癌旁组织、未转移癌组织与转移灶癌组织NFATc3的表达；B：NFATc3阳性强度统计1：癌旁组织；2：未转移癌组织；3：转移灶癌组织；a：P < 0.01, 与癌旁组织比较；b：P < 0.01, 与未转移癌组织比较；C：qPCR检测NFATc3在不同品系MM细胞系中的表达a：P < 0.01, 与PIG1比较；b：P < 0.01, 与A375比较；D：免疫荧光检测NFATc3在不同恶性程度MM细胞中的表达 图 1 NFATc3在MM组织和细胞系中的表达 |
2.2 构建NFATc3敲减质粒并转染Mel-RM细胞
将设计合成的3组质粒使用HindⅢ酶切后，与sgRNA-NC质粒(阴性对照)相比，重组质粒均缺失两个条带，长度分别为1 227、848 bp(图 2A)；转染293T细胞后，通过Western blot对比3组sgRNA-NFATc3质粒，其中sgRNA3转染后，NFATc3表达较其他两组显著减低，表明sgRNA3-NFATc3能达到最优敲减效果(P < 0.01，图 2B、C)，将用于后续实验。
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| M：标准；1：sgRNA-NC组；2：sgRNA1-NFATc3组；3：sgRNA2-NFATc3组；4：sgRNA3-NFATc3组A：重组质粒经Hind Ⅲ酶切后电泳图；B、C：Western blot鉴定4组质粒转染293T细胞后NFATc3蛋白表达及半定量分析 a：P < 0.01，与sgRNA-NC组比较; D、E：Western blot检测转染sgRNA3-NFATc3后Mel-RM细胞中NFATc3蛋白表达及半定量分析 a：P < 0.01，与对照组比较 图 2 sgRNA质粒构建及转染Mel-RM后NFATc3蛋白的表达 |
将sgRNA3-NFATc3敲减质粒和阴性对照质粒sgRNA-NC转染Mel-RM细胞，转染48 h后，Western blot检测结果显示，敲减组细胞中NFATc3蛋白的表达显著低于对照组(P < 0.01，图 2D、E)，提示sgRNA3-NFATc3敲减的Mel-RM细胞构建成功。
2.3 敲减NFATc3对MM细胞活性的影响转染Mel-RM细胞48 h后，CCK-8检测结果显示，敲减组细胞活性(73.85±7.51)明显低于对照组(100.00±11.02)(P < 0.01)。EdU染色结果表明，敲减组EdU阳性细胞较对照组无明显差异(P>0.05，图 3)；免疫荧光检测可观察到，敲减组Mel-RM细胞中总Caspase-3阳性荧光信号分布于胞质中，且阳性细胞比率较对照组明显升高(P < 0.05)，而增殖细胞核抗原PCNA阳性荧光细胞比率与对照组无明显差异(P>0.05，图 4)。提示抑制NFATc3的表达可能通过促进细胞凋亡而非影响细胞增殖从而降低细胞活性。
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| 图 3 EdU增殖染色观察Mel-RM细胞增殖情况(A)及定量分析(B) |
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| a：P < 0.05，与对照组比较 图 4 免疫荧光PCNA/Caspase-3双重染色(A)及定量分析(B) |
2.4 敲减NFATc3促进MM细胞凋亡
转染后48 h，流式细胞学检测结果显示，敲减组凋亡细胞比率增加(P < 0.01，图 5A、B)；进一步采用TUNEL凋亡染色也发现，敲减组TUNEL阳性细胞较对照组明显增多(P < 0.01，图 5C、D)；Western blot检测结果发现，敲减组可分别在18×103及17×103处观察到活化的Caspase-8及Caspase-3蛋白表达明显增加(图 6)。上述结果提示抑制NFATc3的表达能增强Caspase-8、Caspase-3活化，促进细胞凋亡的发生。
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| A、B：流式细胞仪检测NFATc3敲减后细胞凋亡及定量分析a：P < 0.01，与对照组比较；C、D：TUNEL凋亡染色观察NFATc3敲减后细胞凋亡情况及定量分析a：P < 0.01，与对照组比较 图 5 敲减NFATc3对MM细胞凋亡的影响 |
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| 图 6 Western blot检测Mel-RM细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达 |
2.5 敲减NFATc3抑制MM侵袭迁移能力
细胞划痕实验结果显示，敲减组细胞愈合百分比显著减小(P < 0.01，图 7A、B)；Transwell迁移实验结果表明，与对照组相比，敲减组细胞穿透小室的数量显著减少(P < 0.01，图 7C、D)。Transwell侵袭实验观察到敲减组转染24 h后细胞穿透小室的数量较对照组显著减少(P < 0.01，图 7C、D)。上述结果提示，敲减NFATc3能抑制Mel-RM细胞迁移，并减弱其侵袭能力。
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| A、B：细胞划痕实验及细胞划痕修复面积比分析 a：P < 0.01，与对照组比较；C、D：Transwell小室实验观察细胞迁移、侵袭及统计分析 a：P < 0.01，与对照组比较 图 7 敲减NFATc3抑制MM侵袭迁移能力 |
3 讨论
目前已报道的NFAT家族成员包含5个亚型，除NFATc5外，均受胞内高浓度[Ca2+]信号激活，作为转录因子广泛调控多种细胞增殖、分化、迁移等生命活动[9-10]。近年来，有研究表明NFAT家族参与了多种肿瘤发生、发展[11-12]。其中，NFATc3尽管已经被证实在多种恶性肿瘤中异常高表达[5, 7]，且与不良预后相关[13]，但在MM中NFATc3的表达与功能尚不明确。本研究通过对临床转移灶MM(11例)与未转移MM(20例)进行石蜡切片染色证实，NFATc3在癌旁组织几乎无表达，而在恶性程度不同的黑素瘤组织中均有表达，其中在转移性MM组织中表达呈现显著增强。采用不同恶性程度MM细胞系进行qPCR检测也证实，在神经节及肺转移来源的高恶性细胞系Mel-RM及Malme-3M中，NFATc3的表达量较皮肤原位来源MM细胞A375、MeWo明显增加，提示NFATc3高表达与MM的转移性及高恶性程度有关。这一结果与LIU等[14]在结肠癌不良预后中观察到的NFATc3出现异常激活的结果相一致。此外，LAN等[5]研究发现，在食管癌中，NFATc3表达上调引起肿瘤细胞增殖和免疫逃逸，再次印证NFATc3的高表达与黑素瘤的恶性程度具有相关性。
为了进一步探究NFATc3对MM发生、发展的影响，本研究采用Crispr/Cas9技术特异性敲减高表达NFATc3的MM细胞系Mel-RM，发现敲减NFATc3虽对Mel-RM细胞增殖无明显作用，但能显著增加Mel-RM细胞的凋亡水平，降低Mel-RM细胞活性。在肿瘤细胞中，凋亡缺失一直是各类抗肿瘤药物的关注焦点，与疾病恶性程度、病情进展及治疗抵抗密切相关[15]。MM作为对常规放化疗不敏感的典型代表，可能由其促凋亡效应因子失活、抗凋亡因子激活或生存途径强化共同作用所致[16]。进一步通过Western blot检测发现，降低NFATc3的表达后，Mel-RM细胞中活化的Caspase-8、Caspase-3表达明显增多。其中，Caspase-8对死亡受体诱导的细胞凋亡途径至关重要，当被募集到死亡受体复活物后发生构象改变，级联激活下游“凋亡执行者”Caspase-3的表达，从而导致细胞凋亡的发生。说明敲减NFATc3能通过促进Mel-RM细胞凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-3的活化发挥抗肿瘤作用。这一结论与BUTTERICK等[17]在辛伐他汀通过激活NFATc3与Bcl-2蛋白启动子结合，上调各类抗凋亡蛋白丰度，从而保护细胞不受凋亡因子影响的结果相互印证，提示NFATc3可能通过多种途径在细胞凋亡的调控中发挥重要作用。
此外，MM细胞的侵袭、迁移能力也反映了其恶性程度高低，与肿瘤进展及不良预后密切相关。本研究采用细胞划痕实验及Transwell实验发现在敲减NFATc3培养24 h后，Mel-RM细胞的划痕区细胞修复面积、穿膜细胞数目显著变少，提示其迁移能力和侵袭能力均明显降低。虽然目前尚缺乏NFATc3对MM细胞迁移侵袭能力机制的直接研究，但有研究在星形胶质瘤细胞中检测到NFATc3可上调基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)表达[18]。MMP-3可以引起细胞上皮间质转化(EMT)和恶性转化[19]，在乳腺非典型导管增生向乳腺癌转变过程中也具有重要意义[20]。此外，在三阴性乳腺癌研究表明，高表达的NFATc3能通过Notch介导的通路促进肿瘤细胞迁移和侵袭[6]。结合本实验结果可以推测，降低NFATc3表达能明显抑制MM细胞侵袭迁移的能力。
总之，本研究通过实验证明NFATc3在MM中异常高表达，且与其恶性程度有关。敲减NFATc3能显著降低MM细胞侵袭迁移能力，并能通过增加活化的Caspase-8、Caspase-3表达促进MM细胞凋亡，从而抑制MM的发生、发展。表明NFATc3有望成为MM潜在的治疗靶点，其具体作用机制有待进一步深入探索。
| [1] |
WHITEMAN D C, GREEN A C, OLSEN C M. The growing burden of invasive melanoma: projections of incidence rates and numbers of new cases in six susceptible populations through 2031[J]. J Invest Dermatol, 2016, 136(6): 1161-1171. |
| [2] |
DAVIS L E, SHALIN S C, TACKETT A J. Current state of melanoma diagnosis and treatment[J]. Cancer Biol Ther, 2019, 20(11): 1366-1379. |
| [3] |
NAMIKAWA K, YAMAZAKI N. Targeted therapy and immunotherapy for melanoma in Japan[J]. Curr Treat Options Oncol, 2019, 20(1): 7. |
| [4] |
SOSMAN J A, KIM K B, SCHUCHTER L, et al. Survival in BRAF V600-mutant advanced melanoma treated with vemurafenib[J]. N Engl J Med, 2012, 366(8): 707-714. |
| [5] |
LAN X, ZHAO J, SONG C, et al. TRPM8 facilitates proliferation and immune evasion of esophageal cancer cells[J]. Biosci Rep, 2019, 39(10): BSR20191878. |
| [6] |
LIU X, WANG T, WANG Y, et al. Orai1 is critical for Notch-driven aggressiveness under hypoxic conditions in triple-negative breast cancers[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2018, 1864(4 pt a): 975-986. |
| [7] |
URSO K, FERNÁNDEZ A, VELASCO P, et al. NFATc3 controls tumour growth by regulating proliferation and migration of human astroglioma cells[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 9361. |
| [8] |
XIAO T, CHEN W C, WANG S F, et al. Tacrolimus and ascomycin inhibit melanoma cell growth, migration and invasion via targeting nuclear factor of activated T-cell 3[J]. Melanoma Res, 2020, 30(4): 325-335. |
| [9] |
MOGNOL G P, CARNEIRO F R, ROBBS B K, et al. Cell cycle and apoptosis regulation by NFAT transcription factors: new roles for an old player[J]. Cell Death Dis, 2016, 7: e2199. |
| [10] |
WANG G, WANG Y Z, YU Y, et al. The critical role of calcineurin/NFAT (C/N) pathways and effective antitumor prospect for colorectal cancers[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(12): 19254-19273. |
| [11] |
SHOU J, JING J, XIE J, et al. Nuclear factor of activated T cells in cancer development and treatment[J]. Cancer Lett, 2015, 361(2): 174-184. |
| [12] |
BUCHER P, ERDMANN T, GRONDONA P, et al. Targeting chronic NFAT activation with calcineurin inhibitors in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Blood, 2020, 135(2): 121-132. |
| [13] |
XIN B, JI K Q, LIU Y S, et al. Higher expression of calcineurin predicts poor prognosis in unique subtype of ovarian cancer[J]. J Ovarian Res, 2019, 12(1): 75. |
| [14] |
LIU X, WAN X, KAN H, et al. Hypoxia-induced upregulation of Orai1 drives colon cancer invasiveness and angiogenesis[J]. Eur J Pharmacol, 2018, 832: 1-10. |
| [15] |
CARNEIRO B A, EL-DEIRY W S. Targeting apoptosis in cancer therapy[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2020, 17(7): 395-417. |
| [16] |
ZHAO B, XIE J, ZHOU X, et al. YAP activation in melanoma contributes to anoikis resistance and metastasis[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2020, 1535370220977101. |
| [17] |
BUTTERICK T A, IGBAVBOA U, ECKERT G P, et al. Simvastatin stimulates production of the antiapoptotic protein Bcl-2 via endothelin-1 and NFATc3 in SH-SY5Y cells[J]. Mol Neurobiol, 2010, 41(2/3): 384-391. |
| [18] |
NERIA F, DEL CARMEN SERRANO-PEREZ M, VELASCO P, et al. NFATc3 promotes Ca2+ -dependent MMP3 expression in astroglial cells[J]. Glia, 2013, 61(7): 1052-1066. |
| [19] |
SCHEAU C, BADARAU I A, COSTACHE R, et al. The role of matrix metalloproteinases in the epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma[J]. Anal Cell Pathol (Amst), 2019, 2019: 9423907. |
| [20] |
袁媛, 费乐学, 刘岩, 等. 基质金属蛋白酶-3与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在乳腺癌演变过程中的表达及意义[J]. 实用医学杂志, 2008, 24(1): 10-13. YUAN Y, FEI L X, LIU Y, et al. Expressions of matrix metalloproteinase-3 and extracellular matrix metallo-proteinase inducer in the carcinogenesis of breast cancer and theirs significances[J]. J Pract Med, 2008, 24(1): 10-13. |