矮小症是指身高低于同年龄、同性别健康人身高均值两个标准差以上或处于第3百分位以下。矮小症的病因众多,但目前对于矮小症的治疗方式有限,所以探索矮小症的发生、发展机制成为课题组研究的重要方向。人的身高主要取决于四肢长骨的纵向生长,生长板是位于骨骺和干骺端之间的软骨组织,是四肢长骨纵向生长的关键[1]。人矮小同源盒基因(short stature homobox,SHOX)自胚胎12周起至青春期持续表达于生长板,调节生长板软骨的形成和发育,进而影响肢体骨骼的发育和线性生长[2-3]。且SHOX基因具有剂量依赖性,SHOX基因单倍体剂量不足和多倍体高剂量在临床上分别表现为矮身材和高身材[3],且在临床上SHOX基因单倍体剂量不足(低表达)常常与特发性矮小(idiopathic short stature,ISS)、特纳综合征[4]以及Leri-Weill软骨骨生成障碍[5]密切相关。
越来越多的证据表明非编码单链RNA(micro RNA,miRNA)在调节骨发育的过程中发挥着重要作用[6]。miR-370-3P是本课题组前期在SHOX过/低表达的人关节软骨细胞(human chondrocytes- articular,HC-a)模型中筛选的差异表达的miRNA,在SHOX基因低表达组miR-370-3P较正常对照组表达量升高,提示我们miR-370-3P可能也参与SHOX基因缺陷相关性矮小症以及骨骼发育异常的调节过程[3]。
miRNA靶向预测软件提示JAK2、STAT5B可能为其潜在的靶向分子。生长激素(growth hormone,GH)-胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1,IGF1)生长激素轴是调节生长板的重要的神经内分泌轴,其中JAK2/STAT5B是参与生长激素轴的重要信号通路[7]。本研究拟以人关节软骨细胞(HC-a)为研究对象,通过脂质体转染构建miR-370-3P过表达/低表达人关节软骨细胞模型,探讨miR-370-3P是否通过影响JAK2/STAT5B信号通路参与软骨细胞的增殖过程,为进一步理解miR-370-3P参与SHOX基因缺陷相关性矮小症的发生、发展机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料包括:293T细胞(由重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所中心实验室保存),HC-a、CM培养基、软骨细胞生长添加物、青-链霉素、胎牛血清(均订购于美国ScienCell实验室),胰蛋白酶(北京百泰克生物技术有限公司),反转录试剂盒、SYBR QPCR试剂盒(日本TaKaRa公司),miR-370-3P mimics/inhibitor/mNC/iNC(上海生工生物工程有限公司),miRNA U6内参引物、miRNA引物(北京天根生化科技有限公司),TRIzol、LipofectamineTM 2000、Opti-MEM(美国Invitrogen公司),全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司),5×上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司),预染蛋白marker(美国Thermo公司),SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司),兔多克隆抗JAK2、STAT5B一抗(美国Abcam公司),兔多克隆抗β-actin一抗、山羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司),PVDF膜、化学发光HRP底物ECL发光液(美国Millipore公司)。
1.2 方法 1.2.1 Targetscan Human7.2 miRNA靶向预测软件预测靶基因使用TargetScan Human7.2 (http://www.targetscan.org)miRNA的靶基因生物信息学预测软件对miR-370-3P的靶基因及其预测结合位点并进行分析预测。
1.2.2 过表达/低表达miR-370-3P的HC-a细胞模型构建在无菌条件下,HC-a细胞置于含5%胎牛血清、1%青-链霉素、1%软骨细胞生长添加物的CM培养基中,于37 ℃、5%CO2恒温孵箱中培养。Lipofectamine 2000、Opti-MEM进行miR-370-3P转染,分为5组:miR-370-3P模拟物mimic组(miR-370-3P过表达组)、miR-370-3P遏制物inhibitor组(miR-370-3P低表达组)、正常对照组、空载体对照组(mimic normal control,mNC)和空载体对照组(inhibitor normal control,iNC),在无血清培养基中转染4 h后,换含有5%胎牛血清的CM培养基继续培养。
1.2.3 RT-PCR检测miR-370-3P转染效率miR-370-3P转染HC-a细胞24 h后,用TRIzol提取总RNA,以U6为内参,采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒对miR-370-3P进行加尾法反转录及扩增,反转录反应条件:42 ℃ 60 min、95 ℃ 2 min,进行miRNA加A尾反应和反转录反应,95 ℃ 3 min酶失活反应;qRT-PCR反应条件:95 ℃ 15 min (起始模板变性),94 ℃ 20 s PCR(循环中模板变性)、60 ℃ 34 s (退火、延伸)共40个循环,检测各组miR-370-3P相对表达量。
1.2.4 RT-PCR检测各组JAK2、STAT5B mRNA表达量miR-370-3P转染HC-a细胞24 h后,用TRIzol提取总RNA,以GAPDH为内参,采用RT-PCR试剂盒对miR-370-3P过表达组、miR-370-3P低表达组、正常对照组、mimic NC组和inhibitor NC组JAK2、STAT5B进行反转录和扩增,反转录的条件设定为42 ℃ 2 min、37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s,实时荧光定量PCR条件设定为95 ℃ 3 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,共39个循环,检测各组JAK2、STAT5B的表达量。JAK2引物序列上游:5′-GCAACAGAGCCTATCGGCATGG-3′,下游:5′- CCGCCACTGAGCAAAGAGGTAAG-3′,92 bp;STAT5B引物序列上游:5′-GCGGAAGCAGCAGACCATCATC-3′,下游:5′-GCCAACTTCTCACACCAGGACTG-3′,129 bp。
1.2.5 Western blot检测各组JAK2、STAT5B蛋白表达量miR-370-3P转染HC-a细胞48 h后,用全蛋白提取试剂盒提取蛋白,BCA法测蛋白浓度后,97 ℃将蛋白变性10 min,置于-80 ℃冰箱保存待用。以β-actin为内参,以20 μg/孔加样,10%SDS-PAGE电泳分离蛋白,250 mA恒流转膜2 h,快速封闭液室温下摇床封闭25 min,加入兔单克隆一抗JAK2、STAT5B、内参β-actin 4 ℃下摇床孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温下孵育1 h,TBST洗膜3遍并显影,用Image Lab软件分析条带灰度值,SPSS 25.0软件分析各组蛋白灰度值趋势。
1.2.6 MTT检测各组细胞增殖miR-370-3P转染HC-a细胞24 h后,在96孔板中以3×104/孔铺板,每孔加入100 μL CM培养基,每组3个复孔,分别在铺板24、48、72 h后,每孔加入10 μL MTT试剂,37 ℃、5%CO2恒温孵箱中培养4 h后,弃掉培养基,加入DMSO 150 μL/孔,室温下摇床混匀10 min,酶标仪490 nm下测定光密度值D(490),检测各组细胞存活率情况。
1.2.7 双荧光素酶实验检测miR-370-3P和JAK2、STAT5B的结合情况将293T细胞以每孔5×105个铺板于12孔板,于37 ℃、5%CO2恒温孵箱中培养24 h。配制miR-370-3P和JAK2、STAT5B报告载体转染液,共分为10组:①JAK2-3′UTR-野生型(WT)+hsa-miR-370-3P;②JAK2-3′UTR-突变型(MUT)+hsa-miR-370-3p;③JAK2-3′UTR-野生型(WT)+hsa-miR-370-3P-NC;④JAK2-3′UTR-突变型(MUT)+hsa-miR-370-3P-NC;⑤空白对照组1(对照质粒+hsa-miR-370-3P-NC);⑥空白对照组2(对照质粒+miR-370-3p);⑦STAT5B-3′UTR-野生型(WT)+hsa-miR-370-3p;⑧STAT5B-3′UTR-突变型(MUT)+hsa-miR-370-3p;⑨STAT5B-3′UTR-野生型(WT)+hsa-miR-370-3p-NC;B10 STAT5B-3′UTR-突变型(MUT)+hsa-miR-370-3p-NC。在无血清DMEM培养基中加入转染液后,在37 ℃恒温培养箱中反应5 h,换10%血清的DMEM培养基继续培养至转染后24 h收样,使用双荧光素酶检测系统检测,并进行统计与分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,GraphPad Prism 7.0绘图。计量资料以 x±s表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果软件提示JAK2、STAT5B可能为miR-370-3P靶向基因,并预测其结合位点,见图 1。
2.2 miR-370-3P转染效率
相比于正常对照组,miR-370-3P mimic组miR-370-3P表达上调,miR-370-3P inhibitor组miR-370-3P表达下调(图 2),提示miR-370-3P差异表达的HC-α模型构建成功。空载体对照组与正常对照组之间的差异无统计学意义,提示载体对miR-370-3P转染软骨细胞的干扰可不计。
2.3 miR-370-3P对HC-a细胞中JAK2、STAT5B mRNA表达的影响
与正常对照组相比,miR-370-3P mimic组JAK2、STAT5B mRNA表达下调,miR-370-3P inhibitor组JAK2、STAT5B mRNA表达上调(P < 0.05,图 3),提示在转录水平过表达miR-370-3P会抑制JAK2、STAT5B mRNA的表达。
2.4 miR-370-3P对HC-a细胞中JAK2、STAT5B蛋白表达的影响
相比于正常对照组,miR-370-3P mimic组JAK2、STAT5B蛋白表达下调,miR-370-3P inhibitor组JAK2、STAT5B蛋白表达上调(P < 0.05,图 4),提示在翻译水平过表达miR-370-3P会抑制JAK2、STAT5B蛋白的表达。
2.5 miR-370-3P对HC-a细胞存活率的影响
miR-370-3P mimic组、miR-370-3P inhibitor组、空载体对照组和正常对照组在转染铺板后24、48、72 h,组内各时间点细胞的相对增殖率差异无统计学意义;与正常对照组和空载体对照组相比,miR-370-3P mimic转染组在24、48、72 h细胞的存活率降低,miR-370-3P inhibitor转染组在24、48、72 h细胞的存活率增加,差异具有统计学意义(P < 0.05,图 5)。提示过表达miR-370-3P会抑制HC-a细胞增殖。
2.6 miR-370-3P作用下各组细胞中JAK2、STAT5B的荧光表达变化
双荧光素酶实验结果显示:miR-370-3P和JAK2-WT(野生型)、STAT5B-WT(野生型)质粒共转染后,荧光表达相比于对照组有显著下调(P < 0.05,图 6),提示miR-370-3P可与JAK2-3′UTR、STAT5B-3′UTR直接结合发挥调控作用。
3 讨论
矮小症的发生与骨骼的发育异常密切相关,骨骼的发育主要包括膜内成骨和软骨内骨化两种方式,人的身高主要取决于四肢长骨的生长发育,其中四肢长骨生长发育主要是通过软骨内骨化方式[8-9],软骨细胞的增殖是参与软骨内骨化的重要过程。且有研究表明微小RNA(microRNA,miRNA)在软骨细胞增殖过程中发挥了重要的调控作用[10]。生物信息学提示miR-370-3P可能通过作用于JAK2、STAT5B信号分子参与软骨细胞生长发育过程的调控。
微小RNA(microRNA,miRNA)是广泛存在于真核生物体内的约由22个核苷酸组成的内源性非编码单链RNA,通过与mRNA的3′非翻译区的互补序列相结合,对靶基因产生降解或抑制翻译的生物学效应,从而调控基因的表达[11]。有研究发现miR-370-3P可通过靶向骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP2)进而调控成骨细胞的分化[11];miR-370-3P在人骨髓间充质干细胞中可通过上调wnt2B,从而促进其成骨作用[12]。但miR-370-3P在人关节软骨细胞中的分子调控机制目前尚未探明。本研究通过脂质体转染方法构建了miR-370-3P过表达/低表达人关节软骨细胞(HC-α)模型,miRNA实时荧光定量PCR显示:过表达组的miR-370-3P表达显著高于正常对照组,低表达组相比于正常对照组miR-370-3P表达量降低,且两个空载体对照组与正常对照组之间的差异无统计学意义,提示miR-370-3P过表达/低表达HC-a模型构建成功。
JAK2能参与调控细胞的增殖、分化和细胞因子的产生等生物学过程[13],JAK2通过启动STAT通路的信号级联影响其下游信号分子发挥其作用,其中STAT5与细胞的增殖密切相关[14]。在JAK2/STAT5B信号通路中,STAT5B被激活后进入细胞核调控靶基因表达,引起软骨细胞增殖,进而刺激骨骼发育以促进生长[15-16],且临床上STAT5B缺陷患者表现为生长激素不敏感综合征(growth hormone insensitivity syndrome,GHIS)、严重的胰岛素样生长因子缺陷(insulin-like growth factor deficiency,IGFD) 以及严重的出生后生长迟滞[17]。
本研究双荧光素酶实验提示miR-370-3P可与JAK2-3′UTR、STAT5B-3′UTR直接结合发挥其调控作用;通过对软骨细胞miR-370-3P过表达处理后,JAK2、STAT5B信号分子在转录水平的mRNA表达下调;且通过Western blot实验验证了在蛋白水平miR-370-3P过表达也会抑制JAK2、STAT5B蛋白的表达;在本研究MTT细胞增殖实验中,分别在细胞铺板后24、48、72 h检测各组细胞存活率,相比于正常对照组,miR-370-3P过表达组人关节软骨细胞的存活率降低,表明过表达miR-370-3P会抑制人关节软骨细胞的增殖。本研究在转录、翻译和细胞水平进一步证实了miR-370-3P通过影响JAK2/STST5B信号通路进而调控软骨细胞增殖过程的实验设想。但miR-370-3P在SHOX基因缺陷相关性矮小患儿机体中的具体作用机制尚待进一步研究。
综上所述,miR-370-3P可通过直接靶向JAK2、STAT5B信号分子从而抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖,进而调节骨骼的发育过程,为阐明SHOX基因缺陷相关性矮小症的发生、发展机制提供了新的理论依据。
[1] |
HALLETT S A, ONO W, ONO N. Growth plate chondrocytes: skeletal development, growth and beyond[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(23): 6009. |
[2] |
VANNELLI S, BAFFICO M, BUGANZA R, et al. SHOX deficiency in children with growth impairment: evaluation of known and new auxological and radiological indicators[J]. Italian J Pediatr, 2020, 46(1): 163. |
[3] |
许珂, 徐雪姣, 宋萃, 等. 软骨细胞SHOX基因过/低表达的差异miRNA筛选与验证[J]. 第三军医大学学报, 2018, 40(3): 211-215. XU K, XU X J, SONG C, et al. Screening and verification of differential miRNAs in chondrocytes with over-expression and low expression of SHOX[J]. J Third Mil Med Univ, 2018, 40(3): 211-215. |
[4] |
GENONI G, MONZANI A, CASTAGNO M, et al. Improving clinical diagnosis in SHOX deficiency: the importance of growth velocity[J]. Pediatr Res, 2018, 83(2): 438-444. |
[5] |
BUNYAN D J, BAFFICO M, CAPONE L, et al. Duplications upstream and downstream of SHOX identified as novel causes of Leri-Weill dyschondrosteosis or idiopathic short stature[J]. Am J Med Genet A, 2016, 170(4): 949-957. |
[6] |
RAZMARA E, BITARAF A, YOUSEFI H, et al. Non-coding RNAs in cartilage development: an updated review[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(18): 4475. |
[7] |
JOUNG Y H, LIM E J, DARVIN P, et al. MSM enhances GH signaling via the Jak2/STAT5b pathway in osteoblast-like cells and osteoblast differentiation through the activation of STAT5b in MSCs[J]. PLoS One, 2012, 7(10): e47477. |
[8] |
莫奇非, 杨鹏, 苏楠, 等. 成纤维细胞生长因子受体在成骨细胞中的表达及作用研究[J]. 第三军医大学学报, 2019, 41(24): 2386-2392. MO Q F, YANG P, SU N, et al. Expression of fibroblast growth factor receptor and its role in regulating osteoblast differentiation[J]. J Third Mil Med Univ, 2019, 41(24): 2386-2392. |
[9] |
BERENDSEN A D, OLSEN B R. Bone development[J]. Bone, 2015, 80: 14-18. |
[10] |
JEE Y H, WANG J, YUE S N, et al. Mir-374-5p, mir-379-5p, and mir-503-5p regulate proliferation and hypertrophic differentiation of growth plate chondrocytes in male rats[J]. Endocrinology, 2018, 159(3): 1469-1478. |
[11] |
YU L, CEN X, XIA K, et al. microRNA expression profiles and the potential competing endogenous RNA networks in NELL-1-induced human adipose-derived stem cell osteogenic differentiation[J]. J Cell Biochem, 2020, 121(11): 4623-4641. |
[12] |
JIA B, WANG Z P, SUN X, et al. Long noncoding RNA LINC00707 sponges miR-370-3p to promote osteogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells through upregulating WNT2B[J]. Stem Cell Res Ther, 2019, 10(1): 67. |
[13] |
PERNER F, PERNER C, ERNST T, et al. Roles of JAK2 in aging, inflammation, hematopoiesis and malignant transformation[J]. Cells, 2019, 8(8): 854. |
[14] |
JIANG L, ZHAO X H, MAO Y L, et al. Long non-coding RNA RP11-468E2.5 curtails colorectal cancer cell proliferation and stimulates apoptosis via the JAK/STAT signaling pathway by targeting STAT5 and STAT6[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2019, 38(1): 465. |
[15] |
SANPAOLO E R, ROTONDO C, CICI D, et al. JAK/STAT pathway and molecular mechanism in bone remodeling[J]. Mol Biol Rep, 2020, 47(11): 9087-9096. |
[16] |
HWA V. Human growth disorders associated with impaired GH action: defects in STAT5B and JAK2[J]. Mol Cell Endocrinol, 2021, 519: 111063. |
[17] |
KLAMMT J, NEUMANN D, GEVERS E F, et al. Dominant-negative STAT5B mutations cause growth hormone insensitivity with short stature and mild immune dysregulation[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 2105. |