2. 300202 天津, 天津医科大学第二医院
2. Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin, 300202, China
肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝组织长期受各种致病因素诱导与刺激所致的结缔组织异常增生, 肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的慢性病理结果[1]，肝组织在反复炎性损伤与修复过程中，诱导并促进了肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化与增殖、肝内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的增生与降解失衡，导致肝脏实质细胞数量减少和功能减退[2]。HF若未得到有效控制与逆转，可能发展为肝硬化、肝癌并出现各种严重并发症。HSC是位于肝脏Disse间隙的一种间质细胞，肝内ECM主要由活化的HSC产生，各种炎症、损伤因素可促进HSC的活化与增殖，从而导致HF的发生[3]。因此，抑制HSC的活化与增殖，促进其凋亡是逆转HF的细胞学基础所在。
钙网蛋白(calreticulin，CALR)是一种高度保守的内质网Ca2+结合蛋白，主要定位于内质网，具有分子伴侣活性、调节细胞内钙稳态以及细胞凋亡等多种生物学功能[4]。研究显示，CALR与多种肿瘤细胞有着密切的联系，多项实验通过外源性影响CALR的表达来抑制肿瘤细胞的生长，如敲除人膀胱癌细胞J82中的CALR能抑制细胞的增殖、迁移和黏附[5]。但CALR在HSC中的作用尚未发现被研究。因此该研究在细胞水平上探讨沉默CALR是否引起HSC细胞发生相关凋亡以及CALR与促纤维化因子转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的相互关系，进一步阐明CALR抗HF的相关机制, 为HF的逆转提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 细胞株及主要试剂人源性肝星状细胞株(LX-2)购于上海美轩生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购于美国BI公司；胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；CALR的siRNA干扰序列(CALR-siRNA)及非特异性序列(Nc-siRNA)由锐博公司设计并合成；转染试剂盒Lipofectamine(lip)2 000购于Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、反转录试剂盒、PCR荧光定量试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；PCR引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成；兔抗大鼠CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3一抗，兔抗β-actin多克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，均购于美国Arigo公司。
1.2 细胞培养及转染将存放于液氮中的人肝星状细胞复苏传代，于含有10 %胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的高糖培养基中进行常规培养，细胞孵育箱条件为37 ℃，5% CO2。选取形态规则良好的细胞，当其融合度达到80 %，做转染及加药处理。用空白培养基分别稀释Lip 2000和siRNA至所需浓度, 室温静置5 min。将稀释后的siRNA与Lip 2000按照1 ∶1混匀, 室温静置20 min, 使其形成稳定的siRNA-脂质体混合物。随后弃去细胞培养液, 将上述混合物加入到转染组细胞, 6 h后更换为空白培养基。
1.3 细胞分组及处理实验分为以下5组：对照组、阴性siRNA组、CALR-siRNA组、TGF-β1(5 ng/mL)组和CALR-siRNA+TGF-β1 (5 ng/mL)组。CALR-siRNA组和TGF-β1 (5 ng/mL)组分别将CALR-siRNA转入细胞作用48 h及5 ng/mL TGF-β1作用24 h，CALR-siRNA+TGF-β1组将CALR-siRNA转入细胞24 h后加入5 ng/mL的TGF-β1继续作用24 h后进行指标测量，阴性siRNA组及对照组分别将Nc-siRNA及等量的空白培养基转入细胞作用48 h。
1.4 倒置显微镜观察细胞形态变化将细胞培养瓶中生长至80%的细胞，胰蛋白酶消化成单个细胞，1 000 r/min离心5 min，调整细胞浓度为2×106/mL接种至6孔板，转染及加药处理后更换空白培养基，倒置显微镜(Nikon)下观察细胞形态及凋亡情况。
1.5 TUNEL法检测细胞凋亡取无菌玻片提前放入24孔板内，各孔加入500 μL细胞悬液，用以制备细胞爬片。转染结束后，PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞，室温孵育30 min后，PBS洗1次。各孔滴加20 μg/mL的Proteinase K 100 μL，使其覆盖爬片，室温孵育5 min，PBS洗涤3次。配制TUNEL检测液，现用现配，避光操作及保存，按每孔体积50 μL配制[5 μL TdT Enzyme (10×)，45 μL TRITC-dUTP Labeling Mix]加入各孔，周围孔加生理盐水以防干燥，避光操作，37℃孵育30 min，PBS洗3次。将载玻片放置于避光湿盒中并分组标记，于载玻片上滴DAPI 20 μL，爬片放于载玻片上，室温条件下复染5 min。调定荧光显微镜，激发波长、发射波长分别为546 nm、570 nm，取随机视野3个观察并拍照。凋亡率=凋亡数(红色标记数)/细胞总数(红、蓝色标记总数)×100%。
1.6 激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度将细胞以103~104/mL接种至共聚焦小皿中，每孔200 μL，置于细胞培养箱中，各组处理完成后，PBS洗2次，避光条件下加入Fluo-3探针(KPL)，细胞培养箱中放置40 min, PBS清洗3次，加入2 mL完全培养基静置20 min, 激光共聚焦显微镜(Olympus Japan Co., Ltd.)下观察Ca2+荧光强度。FV10-ASW 4.2 Viewer 软件分析各组细胞内Ca2+平均荧光强度。
1.7 Western blot法检测细胞CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达将细胞以2×106/mL接种至6孔板，向各处理组细胞中加入200 μL细胞裂解液提取总蛋白。BCA法进行蛋白浓度测定，蛋白变性保存于-20 ℃冰箱。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳制备试剂盒(Beyotime Biotechnology)用于测定CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达，经SDS-PAGE凝胶电泳, 将蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃过夜: CALR(1 ∶1 000; Arigo), GRP78 (1 ∶1 000; Arigo), caspase-12 (1 ∶1 000; Arigo) and caspase-3 (1 ∶1 000; Arigo)。HRP标记的二抗37℃孵育1 h, ECL发光显色，ImageJ软件对各条带灰度值进行分析，计算每组各蛋白的相对表达量。
1.8 统计学分析实验数据采用统计学软件SPSS 20.0分析，结果以x±s表示，多组均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两均数比较用LSD-t检验，P < 0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各处理组细胞形态变化情况倒置显微镜下不同处理组LX-2细胞形态改变如图 1所示。对照组(图 1A)细胞贴壁生长，紧密相连呈星状梭形，形态规则。阴性siRNA组(图 1B)细胞状态同对照组，出现少许死亡细胞，TGF-β1组(图 1D)细胞间隙变宽，呈长梭形改变，向扁平状肌成纤维样细胞转变。CALR-siRNA组(图 1C)细胞明显缩短，体积变小，空隙增大，细胞连接性变差，凋亡细胞显著增加。CALR-siRNA+ TGF-β1组(图 1E)细胞也出现严重的凋亡现象，但凋亡细胞较CALR-siRNA组有所减少且有部分细胞转变为长梭形。
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| A: 对照组；B: 阴性siRNA组；C: CALR-siRNA组；D: TGF-β1组；E: CALR-siRNA+ TGF-β1组 图 1 倒置显微镜观察细胞形态变化(×200) |
2.2 各处理组细胞凋亡情况
TUNEL法检测细胞凋亡结果如图 2A，对照组与阴性siRNA组凋亡率组间差异无显著性(P>0.05)；较对照组和阴性siRNA组，CALR-siRNA组凋亡率明显升高(P < 0.05)，TGF-β1组无显著性差异(P>0.05)，CALR-siRNA+ TGF-β1组凋亡率明显低于CALR-siRNA组(P < 0.05)。各组HSC细胞凋亡率间均有明显差异(P < 0.05，图 2B)。
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| A: TUNEL法检测细胞凋亡结果; B: 定量分析(n=3, x±s) a: P < 0.05，与对照组比较; b: P < 0.05，与阴性siRNA组比较; c: P < 0.05, 与CALR-siRNA组比较; d: P < 0.05, 与TGF-β1组比较 图 2 各处理组细胞凋亡情况 |
2.3 各处理组细胞内Ca2+荧光强度变化
激光共聚焦显微镜扫描结果显示，CALR-siRNA组(图 3C)Ca2+浓度高于对照组(图 3A)和阴性siRNA组(图 3B)，差异显著(P < 0.05)，TGF-β1组(图 3D)Ca2+浓度显著低于对照组，CALR-siRNA+ TGF-β1组(图 3E)Ca2+浓度介于CALR-siRNA组和TGF-β1组之间(P < 0.05)，对照组与阴性siRNA组间Ca2+浓度差异无统计学意义(P>0.05)。各组间Ca2+荧光强度均有显著性差异(P < 0.05，图 3F)。
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| A: 对照组；B: 阴性siRNA组；C: CALR-siRNA组；D: TGF-β1组；E: CALR-siRNA+ TGF-β1组；F：定量分析(n=3，x±s) 1:对照组；2:阴性siRNA组；3:CALR-siRNA组；4:TGF-β1组；5:CALR-siRNA+ TGF-β1组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与阴性siRNA组比较；c：P < 0.05，与CALR-siRNA组比较；d：P < 0.05，与TGF-β1组比较 图 3 各处理组细胞内Ca2+荧光强度变化 |
2.4 各处理组间CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达
Western blot法检测结果(图 4A)显示：对照组和阴性siRNA组比较无显著差异(P>0.05)，与这两组比较，CALR-siRNA组细胞CALR蛋白表达明显减少(P < 0.05)，GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达显著升高(P < 0.05)，TGF-β1组CALR表达较对照组显著升高(P < 0.05)，其余3种蛋白表达明显降低(P < 0.05)，CALR-siRNA+ TGF-β1组CALR蛋白的表达量显著高于CALR-siRNA组，GRP78、Caspase-12、Caspase-3显著降低(P>0.05)。各组间CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达差异有统计学意义(P < 0.05，图 4B)。
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| A: Western blot检测结果1:对照组；2:阴性siRNA组；3:CALR-siRNA组；4:TGF-β1组；5:CALR-siRNA+ TGF-β1组；B: 定量分析(n=3，x±s) a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与阴性siRNA组比较；c：P < 0.05，与CALR-siRNA组比较；d：P < 0.05，与TGF-β1组比较 图 4 各处理组细胞CALR、GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达 |
3 讨论
内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)所诱导的细胞凋亡是近年来才被了解的一种新的凋亡途径, 可引起细胞内Ca2+平衡紊乱，激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和Caspase-12介导的凋亡通路等信号途径[6-7]。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD, GRP78) 是位于内质网上重要的分子伴侣，其表达的持续性升高是细胞发生ERS的重要特征[8]。ERS在HF的发生发展中具有重要作用，文献报道, ERS能够降低激活的HSC分泌α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ), 促进活化的HSC凋亡，从而抑制HF的形成[9]。
含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，Caspase家族在细胞凋亡过程中发挥至关重要的作用。当内质网中的Ca2+稳态被破坏时，Caspase-12被激活，它可以进一步剪切Caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡过程中关键蛋白酶[10-11]。细胞凋亡3个信号传导通路都能激活凋亡执行者Caspase-3，它会水解各种各样的细胞成分使细胞发生凋亡[12]。
CALR是位于内质网内腔的质量控制分子伴侣，能够结合Ca2+以调节细胞内Ca2+稳态，其参与许多信号通路，包括细胞凋亡[13]。近年研究发现，与人正常肝细胞相比，CALR在人肝癌细胞系中表达也明显上调，同时CALR表达的下调可有效抑制肝癌细胞的生长和侵袭，促进其凋亡[14]。TGF-β1是目前已知最强的促纤维化细胞因子之一，是激活静态HSC的最强因子[15]。目前被认为是重要的HF始动因子之一，经常在体外实验中被用来刺激HSC成为成纤维细胞[16]。CALR是否与ERS介导的细胞凋亡之间有关以及和促纤维化因子TGF-β1的关系，尚未发现被提及。在这项研究中，我们发现以5 ng/mL TGF-β1刺激HSC 24 h后，细胞间隙增宽，呈长梭形改变，向扁平状肌成纤维样细胞转变，同时，细胞增殖能力增强，提示TGF-β1可促进HSC活化，与相关报道一致[17]。
本研究结果显示，siRNA沉默CALR后，细胞密度和体积均变小，发生脱落、皱缩，细胞碎片增加，出现大量凋亡细胞，凋亡率显著升高，提示CALR的siRNA能够明显促使HSC发生凋亡。阴性siRNA组也出现少许凋亡细胞，可能是转染试剂lip2000的细胞毒性所致，但影响不大。此外，HSC中CALR的减少能够引起细胞内Ca2+荧光强度增强，浓度升高。同时，CALR-siRNA转染细胞后，ERS指示剂GRP78和ERS相关蛋白Caspases-12表达上调，并伴有凋亡相关蛋白Caspase-3上调。由此推断，Ca2+可能充当凋亡相关基因的中间信使。CALR为Ca2+结合蛋白，能够结合细胞内Ca2+以维持Ca2+稳态和细胞正常生理功能，当CALR表达减少，细胞质内游离Ca2+增多，出现钙超载现象，激活ERS通路，引起细胞凋亡。我们之前的研究也发现，在体外实验过程中，Ca2+浓度升高与细胞凋亡有关[18]。
转染后在细胞中加入TGF-β1，和单纯转染组细胞相比，CALR表达明显增加，凋亡细胞数减少，凋亡率降低，Ca2+荧光强度减弱，GRP78、Caspases-12、Caspase-3表达明显升高。提示在HSC中TGF-β1能够直接或间接促进CALR的表达，减轻siRNA诱导的细胞凋亡。有研究证实[19]通过沉默人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts，HGFs) 中CALR的表达，HGFs中TGF-β1的表达量也有显著下降。CALR在HGFs表达TGF-β1的过程中，起重要作用。CALR的致纤维化作用，是近些年来国内外学者研究的热点。国外学者PRAKOURA[20]用野生型小鼠和CALR部分缺陷的杂合子小鼠做动物实验，研究在纤维化发展的过程中，CALR对TGF-β1的影响。结果发现，CALR缺陷，会导致可调节TGF-β1活化的TSP1表达受到抑制，也会使TGF-β1信号传导的中心介质——磷酸化的Smad3表达量降低，则可以推断出，CALR可通过影响TSP1表达，来调节TSP1介导的TGF-β1活化。由此推断，CALR在致纤维化过程中发挥重要作用，它可以与TGF-β1相互作用，相互促进，在HSC的纤维化进展中发挥作用。
我们的发现证实了沉默CALR能够引起HSC凋亡，可能的机制为CALR表达下调能够引起HSC内Ca2+稳态失调，介导ERS，从而启动细胞Caspase凋亡程序。同时，CALR和TGF-β1的表达能够相互影响，提示CALR可能在促纤维化过程中也有重要作用。
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