2. 1400010 重庆，重庆医科大学：超声影像学研究所
2. Department of Nuclear Medicine, Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Molecular Imaging, Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China
恶性肿瘤已成为威胁人类健康的主要原因之一[1]，目前的治疗方式虽能在一定程度上抑制肿瘤生长，但其不良反应不容忽视[2]，因此，寻找新的抗肿瘤治疗方法迫在眉睫。声动力治疗(sonodynamic therapy，SDT)是近年来兴起的新型治疗方法，是将超声波和声敏剂结合，通过超声空化作用、氧自由基产生氧化损伤等机制诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，具有无创、低成本、高选择性、高组织穿透性等优点[3-4]。声敏剂是SDT发生的关键因素。然而，传统有机声敏剂水溶性低，化学、生物稳定性差，血流清除快，从而导致肿瘤聚集性差、治疗效果差等问题[5]。纳米医学的快速发展为解决这一问题带来了希望，基于各种敏化剂的纳米颗粒得到广泛应用，如基于华卟啉钠(sinoporphyrin sodium，DVDMS)的仿生纳米粒EXO-DVDMS、基于IR780的脂质体纳米粒IR780-NDs等[6-7]。现有研究表明：DVDMS、IR780均是性能良好的声敏剂，主要位于肿瘤细胞的线粒体中，可被超声有效激活，导致肿瘤细胞的损伤，对正常细胞的毒性较小[7-8]。全氟己烷(perfluorinated hexane，PFH)作为液态氟碳中的一员，支持通过液气相变进行超声成像[9]。
基于此研究现状，我们设想将DVDMS、IR780包载到同一纳米粒中，以达到1+1>2的效果。为了验证这一科学假设，本研究选用FDA认证的聚乳酸-乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)纳米材料，制备搭载DVDMS、IR780和PFH的多功能复合纳米粒DIPP-NPs，旨在探讨其协同增强SDT作用，为进一步开发靶向SDT分子探针提供新的可能。考虑到超声/光声成像技术更适用于浅表肿瘤的诊断与监控，故选用乳腺癌为本实验研究模型。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 1.1.1 主要试剂包括：羧基端乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGACOOH，聚合比50:50，济南岱罡)；IR780碘化物(美国Sigma公司)；DVDMS(青龙高科技股份有限公司)；PFH(上海麦克林生化科技有限公司)；Dil(碧云天生物公司)；DAPI(博士德生物公司)；单线氧荧光探针(singlet oxygen sensor green reagent，SOSG，美国Thermo Fisher公司)；CCK-8试剂盒(东仁化学有限公司)；小鼠乳腺癌4T1细胞(重庆医科大学超声影像学研究所)。
1.1.2 主要仪器包括：声振仪(Sonic，美国)；磁力搅拌器(DF-101，德国)；光学显微镜(Olympus IX71，日本)；透射电镜(HITACHI，日本)；粒径测量仪(Malvern公司，英国)；紫外可见光分光光度计(岛津2500UV-VIS，日本)；激光共聚焦显微镜(Nikon公司，日本)；流式细胞仪(Beckman coulter公司，美国)；多功能酶标仪(Thermo公司，美国)；小动物光声成像仪(Vevo® LAZR2100，加拿大)；低强度聚焦超声治疗仪(LIFU，重庆医科大学超声分子影像学研究所研制)。
1.2 方法 1.2.1 DIPP-NPs的制备及表征超声双乳化法制备纳米粒，将1 mg DVDMS溶解于100 μL PBS溶液中，25 mg PLGA、1 mg IR780溶解于1 mL三氯甲烷溶液中(油相)；再将溶解好的DVDMS溶液(水相)、PFH溶液(水相)各100 μL加到溶解好的油相溶液中，用声震仪(3 min，震5 s、停5 s，功率45%)进行第1次乳化；再向其中加入4 mL 4% PVA溶液，再次声震仪乳化(3 min，震5 s、停5 s，功率30%)；最后加入5 mL 2%的异丙醇，混合乳液磁力搅拌4~6 h；待三氯甲烷完全挥发后，双蒸水离心洗涤(11 000 r/min，5 min)3次，制备获得DIPP-NPs，于4 ℃条件下保存备用。以上所有步骤均在避光、冰浴条件下进行。DPP-NPs(未添加IR780)、IPP-NPs(未添加DVDMS)、PP-NPS(IR780、DVDMS均未添加)3种纳米粒的制备与上述过程类似。
DIPP-NPs制备成功后，肉眼观察其外观性状；光镜、激光共聚焦显微镜、透射电镜下观察其形态及结构特征；Malvern粒径仪检测其粒径大小、电位分布；紫外分光光度计检测其光密度值，绘制紫外吸收光谱图；标准曲线法计算DVDMS、IR780的包封率。DVDMS/IR780包封率=M1/M2×100%，M1表示包载于PLGA纳米粒中的DVDMS/IR780含量，M2表示DVDMS/IR780的投入总量。
1.2.2 DIPP-NPs体外超声/光声成像实验将DIPP-NPs(1 mL，1 mg/mL)加入凝胶模型后进行超声辐照(3 W，0、60、180、300 s；辐照条件根据本实验室既往研究选定)，光镜下观察、记录纳米粒的变化，超声成像系统评价其体外超声成像能力，DFY-Ⅱ型超声图像定量分析仪分析各靶区声强值。
将DIPP-NPs(200 μL，1 mg/mL)加入凝胶模型后，光声成像系统行全波长(680~970 nm)扫描，选取光声值最大处对应波长的激光，激发不同浓度DIPP-NPs(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)，采集各组光声图像，并定量分析各组光声信号强度。
1.2.3 DIPP-NPs体外靶向实验将处于对数期的4T1细胞(1×105/皿)接种于共聚焦培养皿中，24 h后将细胞分为以下4组：PP-NPs组、DPP-NPs组、IPP-NPs组、DIPP-NPs组。各组加入等量(50 mg/mL，1 mL/皿)DiI标记的相应纳米粒，与细胞共培养4 h后，PBS多次洗涤、清除未靶向的纳米粒，4%多聚甲醛1 mL固定细胞15 min，DAPI染料200 μL染色细胞核15 min。激光共聚焦显微镜观察纳米粒与细胞的结合情况。
1.2.4 DIPP-NPs体外活性氧检测实验用SOSG作为单线态氧指示剂。将DIPP-NPs(1.2 mL，100 μg/mL)、SOSG甲醇溶液(0.3 mL)、PBS(1.5 mL)充分混匀，混合物经由超声辐照(3 W，0、15、30、60、120、240 s；辐照条件根据本实验室既往研究选定)，荧光分光光度计记录500~700 nm上SOSG的荧光强度。
1.2.5 DIPP-NPs的细胞毒性及其体外声动力治疗实验在5%CO2、37 ℃培养箱中用DMEM完全培养基(10%胎牛血清、1%双抗)培养4T1细胞，实验均采用对数期生长细胞。将4T1细胞(1×104/孔)接种于96孔板中，24 h后分为6组，每组3~5个复孔。各组加入等量(200 μL/孔)不同浓度DIPP-NPs培养基稀释液(0、20、40、60、80、100 μg/mL)，与细胞共培养24 h后，加入CCK-8试剂，继续培养1~4 h，多功能酶标仪检测并计算细胞存活率。
将4T1细胞(1×104/孔)接种于96孔板中，24 h后分为以下6组：阴性对照组、仅US组、仅DIPP-NPs组、DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组、DIPP-NPs+US组，每组3~5个复孔。各组加入等量(50 μg/mL，200 μL/孔)相应纳米粒后进行超声辐照(3 W，30 s；辐照条件根据本实验室既往研究选定)。于辐照后2 h加入CCK-8试剂继续培养1~4 h，多功能酶标仪检测并计算细胞存活率。
1.2.6 动物模型的建立及DIPP-NPs的体内声动力治疗实验选取6~8周龄的雌性BALB/c小鼠(16~20 g)18只，将4T1细胞悬液(1×106/mL)皮下注射于小鼠右侧腹部(0.1 mL/只)建立荷瘤鼠模型，待肿瘤体积长至约100 mm3，用于体内声动力治疗研究。
将18只荷瘤小鼠分为以下6组(n=3)：阴性对照组、仅US组、仅DIPP-NPs组、DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组、DIPP-NPs+US组。各组经尾静脉注射等量(3 mg/mL，200 μL)相应纳米粒或生理盐水后24 h，用涂抹了耦合剂的超声探头对荷瘤鼠肿瘤部位进行垂直辐照(3 W，3 min；辐照条件根据本实验室既往研究选定)。上述治疗过程每3天重复1次，肿瘤体积每2天记录1次，连续16 d。肿瘤体积(mm3)=(短径2×长径)/2。治疗周期结束后，剖离瘤块并称其质量，计算肿瘤体积/质量抑制率。肿瘤体积抑制率=(V对照组-V实验组)/V对照组×100%，肿瘤质量抑制率=(M对照组－M实验组)/M对照组×100%。
1.3 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以x±s表示，两变量比较采用线性相关分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，两组间进一步比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 DIPP-NPs的基本理化性质成功制备DIPP-NPs，肉眼观察呈墨绿色乳化液(图 1A)；光镜下大小均一、分散性良好(图 1B)；激光共聚焦显微镜下DiI标记的DIPP-NPs呈均一的红色颗粒(图 1C)；透射电镜下呈圆球形(图 1D)；马尔文粒径仪测得其粒径、电位分别为(341.17±16.97)nm(图 1E)、(-12.77±0.88)mV(图 1F)；紫外吸收光谱图显示：DIPP-NPs于405、795 nm处各出现了1个特征吸收峰(图 1G)，说明DVDMS、IR780成功包载于PLGA纳米粒中；根据DVDMS、IR780的紫外吸收光谱图(图 1H、I)绘制DVDMS、IR780的标准曲线回归方程分别为：y=0.093 2x+0.021 9，R2=0.998 9、y=0.320 3x-0.183 3，R2=0.996 2。最后计算得到DVDMS、IR780的包封率分别为(92.84±1.58)%、(96.57±1.48)%。
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| A：纳米粒外观性状，从左到右依次为PP-NPs、IPP-NPs、DPP-NPs、DIPP-NPs；B：DIPP-NPs的光镜图；C：DIPP-NPs的激光共聚焦显微镜图；D：DIPP-NPs的透射电镜图；E：DIPP-NPs的粒径分布；F：DIPP-NPs的电位分布；G：不同纳米粒/材料的紫外吸收光谱图；H：DVDMS的紫外吸收光谱图；I：IR780的紫外吸收光谱图 图 1 DIPP-NPs的基本理化性质 |
2.2 DIPP-NPs的体外超声/光声成像能力
光镜下观察到随着超声辐照时间的延长，大量DIPP-NPs转化为微泡，其直径也由原来的300 nm左右增加至20 μm左右(图 2A)，超声成像结果显示其回声信号随辐照时间逐渐增强(图 2B)，回声强度定量分析结果与图像结果一致(图 2C)；光声成像结果显示，DIPP-NPs行全波长扫描后，于795 nm处出现光声信号最大值，在λ=795 nm的激光辐照下，光声信号随DIPP-NPs浓度线性增加(图 2D)，光声信号定量分析结果与图像结果一致(图 2E)。以上结果表明DIPP-NPs具有良好的超声、光声成像能力。
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| A：不同超声辐照条件下DIPP-NPs的体外相变光镜观察及超声/造影成像；B：不同超声辐照条件下DIPP-NPs体外超声/造影成像定量分析(n=3)；C：不同浓度DIPP-NPs的体外光声成像；D：不同浓度DIPP-NPs的体外光声成像定量分析(n=3) 图 2 DIPP-NPs的相变、体外超声/光声成像及定量分析 |
2.3 DIPP-NPs与4T1细胞的体外结合情况
与4T1细胞共培养4 h后，PP-NPs组可见蓝染的细胞核周围仅有极少量DiI标记的红色纳米粒聚集，而DPP-NPs组、IPP-NPs组、DIPP-NPs组细胞核周围均可见大量红色纳米粒聚集，且DIPP-NPs组周围的红色纳米粒多于其他两组(图 3)。结果表明DVDMS、IR780均有助于纳米粒在肿瘤细胞的摄取，当DVDMS、IR780联合作用时，摄取作用增强。
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| 图 3 激光共聚焦显微镜观察DIPP-NPs与4T1细胞的结合情况 |
2.4 DIPP-NPs的体外活性氧产生情况
随着超声辐照时间的延长，含DIPP-NPs的SOSG甲醇溶液的荧光强度逐渐增强(图 4A)。表明产生的活性氧逐渐增多。
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| A：不同超声辐照条件下SOSG荧光强度；B：DIPP-NPs的细胞毒性(n=3)；C：DIPP-NPs的体外声动力治疗效果(n=3) 1：阴性对照组；2：仅US组；3：仅DIPP-NPs组；4：DPP-NPs+US组；5：IPP-NPs+US组；6：DIPP-NPs+US组；a：P < 0.05，与阴性对照组比较；b：P < 0.05，与DPP-NPs+US组比较；c：P < 0.05，与IPP-NPs+US组比较 图 4 DIPP-NPs的体外活性氧产量、细胞毒性及体外声动力治疗效果评价 |
2.5 DIPP-NPs的细胞毒性及体外声动力治疗效果
细胞毒性结果显示(图 4B)：4T1细胞与不同浓度DIPP-NPs共培养24 h后，细胞存活率均无明显降低，表明DIPP-NPs具有较高的生物安全性，可进行下一步实验。
体外声动力治疗结果显示(图 4C)：仅US组、仅DIPP-NPs组的细胞存活率与阴性对照组比较，差异无统计学意义，表明单纯超声辐照、单纯DIPP-NPs没有明显的细胞毒性；DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明DVDMS、IR780介导的SDT抑制了肿瘤细胞的生长；此外，DIPP-NPs+US组与DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明当DVDMS、IR780联合作用时，SDT作用增强。
2.6 DIPP-NPs的体内声动力治疗效果阴性对照组、仅US组、仅DIPP-NPs组对肿瘤生长无明显影响，差异不具有统计学意义，表明单纯超声辐照、单纯DIPP-NPs没有明显的抗肿瘤活性；DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明DVDMS、IR780介导的SDT抑制了肿瘤的生长；DIPP-NPs+US组与DPP-NPs+US组、IPP-NPs+US组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明当DVDMS、IR780联合作用时，SDT作用增强(图 5)。
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1：阴性对照组；2：仅US组；3：仅DIPP-NPs组；4：DPP-NPs+US组；5：IPP-NPs+US组；6：DIPP-NPs+US组；a：P < 0.05，与阴性对照组比较；b：P < 0.05，与DPP-NPs+US组比较；c：P < 0.05，与IPP-NPs+US组比较 A：肿瘤体积变化；B：肿瘤体积抑制率；C：肿瘤质量；D：肿瘤质量抑制率 图 5 DIPP-NPs的体内声动力治疗效果评价(n=3) |
3 讨论
近年来，随着对SDT的深入研究，越来越多的优质声敏剂被发现、合成并应用。DVDMS作为基于光卟啉合成的新一代声敏剂，其化学纯度为98.7%，声活性远高于血卟啉单甲氧醚(HMME)等其他卟啉衍生物，具有水溶性强、皮肤敏感性较短、单线态氧产率高等优点，已获得中国自主知识产权[10-11]。IR780作为具有肿瘤靶向性的经典敏化剂，其靶向性与肿瘤细胞质膜电位相对较高、肿瘤细胞上过表达的有机阴离子转运体多肽(OATPs)有关[12-13]。
受上述研究成果的启发，本研究成功构建复合纳米粒DIPP-NPs。DIPP-NPs的紫外图谱呈现双特征吸收峰，标准曲线法计算得到DVDMS、IR780的包封率分别为(92.84±1.58)%、(96.57±1.48)%，说明DVDMS、IR780成功且有效包载于PLGA纳米粒中。此外，本研究发现DVDMS包载于PLGA纳米粒中发生了红移现象，其紫外特征吸收峰从367 nm左右移动到405 nm，这可能与包载后DVDMS的疏水作用、溶剂极性的变化有关[14]。体外靶向结果表明IR780的主动靶向性、DVDMS的肿瘤聚集效应，使得DIPP-NPs可在肿瘤部位有效聚集。此外，结合肿瘤新生血管内皮间隙为380~780 nm[15-16]、DIPP-NPs的粒径为(341.17±16.97)nm，说明DIPP-NPs也可通过EPR效应聚集于肿瘤部位。敏化剂的有效包载与纳米粒肿瘤部位的有效聚集，为下一步发挥SDT作用奠定了基础。现有研究表明：纳米微泡介导的肿瘤SDT效应涉及多种机制，包括氧自由基损伤作用、超声空化效应、超声靶向肿瘤血管破坏技术等，尽管机制复杂，但活性氧的产生是关键因素之一[17-18]。本研究SOSG体外活性氧检测结果表明DIPP-NPs可在超声辐照下产生活性氧，结合体外细胞存活率的降低、体内肿瘤体积/质量抑制率的提高，均说明DVDMS、IR780介导的SDT抑制了肿瘤的生长，而当两者联合作用时，SDT作用增强。本研究也存在一定的不足，如缺少其他肿瘤模型SDT作用对比研究，且结果尚需进一步体内实验验证。
综上所述，本研究成功构建肿瘤靶向多功能复合纳米粒DIPP-NPs，实现了双敏化剂协同增强SDT作用，为建立高效、安全的肿瘤分子成像与靶向治疗方法提供了新的思路。
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