阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是中老年常见神经系统退行性疾病，也是痴呆发生的最常见原因[1]。AD的致病原因和发病机制目前还不清楚，缺乏有效干预措施[2]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在AD发生、发展过程中的作用越来越受到重视[3]。BDNF首先是以脑源性神经营养因子前体蛋白(precursor of brain-derived neurothrophic factor，proBDNF)的形式由细胞合成和分泌。proBDNF裂解后产生脑源性神经营养因子前肽(BDNF propeptide，pBDNF)和成熟BDNF(mature BDNF，mBDNF)。BDNF能起到促进细胞增殖、分化和存活，促进长时程增强(long-term potentiation, LTP)，促进突触生长、突触传递以及可塑性的作用，改善AD鼠的认知功能[4-5]，而proBDNF能够加剧AD鼠脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积[6]，抑制海马神经元增殖，促进细胞凋亡，降低突触可塑性，从而降低小鼠的学习与记忆功能[7]。近期研究表明：在AD患者的海马标本中，pBDNF水平是健康人的16倍，而pBDNF/BDNF比值是健康人的30倍；pBDNF能够与Aβ蛋白一起在AD的发生、发展中发挥协同毒性作用[8]。但有关pBDNF在AD发病中的作用及机制尚不明确，因此，本研究采用AD鼠海马注射携带pBDNF基因的腺相关病毒基因整合载体(AAV-pBDNF)，观察内源性pBDNF对AD鼠学习与记忆功能以及海马突触后致密蛋白-95(postsynaptic density protein 95，PSD-95)表达的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组采用阿尔茨海默病模型转基因小鼠为实验动物，购自江苏集萃药康生物科技有限公司(APPswePS1dE9，18只，雄性，4月龄，体质量28~32 g)，饲养于本院实验动物中心。当AD鼠长至6月龄时，采用抛硬币法随机分为空载体对照组、AAV-pBDNF组、AAV-pBDNF+ p75NTR抗体组，每组6只。空载体对照组右侧海马注射AAV-GFP(2 μL，1×1012 vg/mL，和元生物，中国)，pBDNF组右侧海马注射AAV-pBDNF(2 μL，1×1012 vg/mL，和元生物，中国)，pBDNF+p75NTR抗体组右侧海马注射AAV-pBDNF(2 μL，1×1012 vg/mL)和p75NTR抗体(2 μL，10 μg/mL，Alomone，以色列)。AAV-pBDNF和AAV-GFP血清型皆为AAV8，对神经系统靶向性强。
1.2 右侧海马药物注射6%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，固定于立体定位仪，头部剃毛，从小鼠头部中缝处剪开皮肤，把囟门作为中心点，坐标点的定位坐标值为：前后-1.75 mm，右侧旁开2.3 mm。然后用小电钻在颅骨上钻1个小孔。再次定位后穿刺1.5 mm深，此时针尖到达右侧海马部位，采用微量注射器以0.5 μL/mL的速度进行注射。注射完毕后针头停留5 min再缓慢拔针，防止注射药物溢出。缝皮、固定，手术之后安静放置，注意保暖，观察30 min，小鼠没有异常后，1只/笼继续饲养。
1.3 水迷宫实验检测AD鼠的学习记忆功能所有小鼠于海马注射4周后进行Morris水迷宫实验。将圆形游泳池分为4个象限，在第3象限内放置1个20 cm高的平台，加入自来水至水面约高于平台2 cm。小鼠先学习训练5 d：将小鼠从1、2、4象限分别3次放入游泳池中，若小鼠在1 min内找到平台，并在平台上停留＞3 s，则系统自动停止录像；若1 min后仍没找到平台，则引导它停留在平台上10 s；接下来另外2个象限重复实验。到第6天时，撤去平台，记录小鼠在第3象限内的时间和穿越平台的次数。
1.4 免疫荧光检测AAV-pBDNF在AD鼠脑内转染情况水迷宫检测完毕后，次日处死小鼠并取材，右侧半脑组织用于免疫组化，左侧半脑组织用于Western blot实验。右侧半脑组织固定、脱水后冰冻切片，每片约35 μm。每组动物分别取2组脑片，清洗、打孔、封闭。然后其中1组脑片加入鼠来源NeuN抗体(1 ∶500，Abcam，英国)，另1组脑片加入鼠来源GFAP抗体(1 ∶1 000，Abcam，英国)，4 ℃过夜。PBST清洗脑片后加入Cy3鼠来源抗体(1 ∶500，Abcam，英国)，37 ℃孵箱避光孵育1 h。贴片，荧光显微镜下拍照，观察AAV-pBDNF的转染情况。
1.5 Western blot检测AD鼠脑内PSD-95表达水平取左侧半脑组织，裂解、取上清，制成样本后放入冰箱保存待用。免疫印迹法跑电泳，转膜后牛奶封闭1 h，一抗4 ℃过夜，加一抗为兔来源PSD-95抗体(1 ∶500，CST，美国)和小鼠来源β-actin(1 ∶1 000，Sigma，美国)。再加二抗为兔来源IRDye 800CW荧光抗体和小鼠来源IRDye 800CW(1 ∶1 000，LI-COR，美国)。再加二抗避光室温1 h。洗膜后显影，Image J软件计算各个目的条带的灰度值，用PSD-95/β-actin值来表示PSD-95的相对蛋白表达量。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0统计与制图，所有计量资料以x±s表示，水迷宫实验前5 d各组之间的游泳速度比较应用双因素方差分析，其他指标：两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 AAV-pBDNF在AD鼠脑内转染情况免疫荧光检测结果发现：AAV-pBDNF和AAV-GFP集中表达于神经元内，而胶质细胞内未见pBDNF或者GFP表达(图 1)。
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白色箭头示pBDNF阳性细胞; 红色箭头示GFP阳性细胞 A: pBDNF与NeuN共染; B: CFP与NeuN共染; C: pBDNF与GFAP共染; D: GFP与GFAP共染 图 1 AAV-pBDNF在AD鼠脑内转染情况(×40) |
2.2 AAV-pBDNF对AD鼠学习记忆能力的影响
水迷宫实验结果显示：在水迷宫实验前5 d，同1 d内各组小鼠的运动速度无明显差异。第5天时，对照组(P=0.004 5，F=4.054)与AAV-pBDNF+p75NTR抗体组(P=0.002 4，F=4.504)的逃避潜伏期均较第1天有明显下降，而pBDNF组AD鼠的逃避潜伏期虽然也较第1天有所缩短，但差异无统计学意义。在空间探索实验中，AAV-pBDNF组AD小鼠穿越平台次数较其余两组少(P=0.020 1，F=4.225)，而AAV-pBDNF+p75NTR抗体组小鼠平台穿越次数与对照组相比无明显差异(图 2)。
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a : P<0.05, 与AAV-pBDNF组比较 A: 各组小鼠的游泳速度; B: 各组小鼠找到平台的潜伏期; C: 各组小鼠穿越平台次数﹐1:空载体对照组; 2:AAV-pBDNF组; 3:AAV-pBDNF+p75NTR抗体组; D: 各组小鼠游泳轨迹图 图 2 AAV-pBDNF对AD鼠学习记忆能力的影响 |
2.3 AAV-pBDNF对AD鼠脑内PSD-95表达的影响
Western blot检测结果显示：AAV-pBDNF组PSD-95表达量低于对照组和pBDNF+p75NTR抗体组(P < 0.05)，而AAV-pBDNF+p75NTR抗体组PSD-95表达量与对照组比较差异无统计学意义(图 3)。
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| A : Western blot检测; B: 半定量分析1 : 空载体对照组; 2:AAV-pBDNF组; 3:AAV-pBDNF+p75NTR抗体组; a: P<0.05, 与对照组比较; b: P<0.01, 与AAV-pBDNF组比较 图 3 AAV-pBDNF对AD小鼠PSD-95表达的影响 |
3 讨论
BDNF是神经营养因子家族中重要的一员，BDNF首先是以前体蛋白proBDNF的形式由细胞合成和分泌，proBDNF在细胞内被弗林酶、前体蛋白转化酶，或者被分泌到细胞外并被血浆纤维溶酶和基质金属蛋白酶-9等蛋白裂解酶裂解，释放出pBDNF和mBDNF，pBDNF、proBDNF、mBDNF三者共同存在于中枢神经系统中[9-10]。在生理状态下，海马部位pBDNF与mBDNF等摩尔存在，但含量比proBDNF高10倍以上[11]。pBDNF分子质量约为17×103，是proBDNF的N端片段[12]。既往认为pBDNF只是参与BDNF的修饰及转运，其本身无生物学活性且很快被降解，近年的研究表明proBDNF裂解后产生的pBDNF本身有着重要作用[1]。Met-pBDNF可改变神经元形态，抑制培养海马神经元生长锥；Val-pBDNF促进海马长时程抑制，而Met-pBDNF抑制海马长时程抑制；Val-pBDNF还可抑制短粗树突的生长，降低树突棘数量[13]。临床研究表明重度抑郁症患者脑脊液内pBDNF水平降低，尤其是男性患者下降更为明显[14-15], 同时还发现Met-pBDNF可以降解树突棘进而减少海马神经元的突触形成，从而改变了恐惧消退的路径[16]。在1项尸检研究中发现：抑郁症患者的顶叶皮层中mBDNF水平较低，而pBDNF水平较高[17]。说明pBDNF参与了神经精神疾病的发生、发展。
本研究采用转基因AD鼠海马注射携带pBDNF基因的腺相关病毒基因整合载体(AAV-pBDNF)，免疫组化结果表明：AAV-pBDNF集中表达于神经元内，而胶质细胞内未见pBDNF，说明AAV-pBDNF在神经元成功转染。水迷宫实验结果表明：海马注射AAV-pBDNF及p75NTR抗体对AD鼠的运动速度无明显影响。海马注射AAV-pBDNF后AD鼠学习及记忆能力均明显下降，而海马同时注射AAV-pBDNF和p75NTR抗体(中和p75NTR受体)后，AD鼠学习及记忆能力与对照组比较无明显差异，说明pBDNF可能通过p75NTR信号通路降低AD鼠的学习记忆能力。
PSD-95是兴奋性突触后致密区核心构架蛋白，具有调节、聚合受体，稳定突触连接结构以及传导膜受体信号的作用，主要参与调控突触可塑性及皮质和海马神经元长时程增强效应(LTP)，在记忆形成和信息传递中发挥重要的调控作用[10, 18-19]。本研究结果表明：AD鼠海马注射AAV-pBDNF后AD鼠脑内PSD-95含量较AAV-GFP组降低，提示其神经突触后兴奋性传递水平下降，pBDNF使PSD-95表达下降，提示这也许是AD鼠学习记忆功能下降的原因之一。而海马同时注射AAV-pBDNF和p75NTR抗体后，PSD-95含量与对照组无明显差异，说明p75NTR抗体中和p75NTR后能够拮抗pBDNF的作用，pBDNF可能通过p75NTR信号通路降低PSD-95的表达。
本研究结果显示：AD鼠海马注射AAV-pBDNF后穿越平台次数减少、逃避潜伏期无明显缩短、学习记忆能力下降、PSD-95的表达降低，而p75NTR抗体能够拮抗AAV-pBDNF上述作用，说明pBDNF可能通过p75NTR信号通路降低PSD-95的表达，导致AD鼠的学习记忆能力下降。本研究初步发现BDNF代谢过程中产生的pBDNF可能参与了AD的发病，为进一步了解pBDNF在神经精神疾病中的作用提供参考。但本研究仍然存在一定的局限性。例如，p75NTR抗体可能还通过阻断其他信号通路来促进AD鼠的学习记忆功能与PSD-95表达；p75NTR是否作为pBDNF主要受体传导信号，影响其功能；AD鼠突触可塑性功能的变化还需要更多的实验进行验证。因此，在未来的研究中，可以进一步研究pBDNF对AD鼠脑内其他蛋白表达以及神经功能的影响，以及p75NTR具体是如何调控pBDNF作用的。
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