Nogo是一种髓磷脂蛋白,可抑制中枢神经损伤后再生。研究表明:使用抗Nogo单克隆抗体IN-1能明显促进神经突起生长,通过主动接种髓磷脂衍生蛋白可促进轴突再生[1-2]。Nogo复合物也有类似的作用[3]。但这种保护作用的机制尚不清楚。有研究表明视神经损伤后在受损部位有短暂的内源性T细胞聚集[4],被动转移髓磷脂反应性T细胞可减轻视神经继发性退行性变,提高视神经节细胞的存活率和视神经的传导程度[5]。通过髓磷脂蛋白主动免疫也同样有神经保护作用,可显著促进神经功能恢复[6-7]。髓鞘或脊髓匀浆复合物可使脊髓损伤的大鼠长距离轴突再生,且髓鞘免疫组再生轴突数目和再生范围远超过抗体组,免疫组除了解剖再生外还有更好的功能恢复[8]。表明使用髓磷脂复合物接种较被动转移髓磷脂特异性抗体更能促进CNS受损神经元修复再生。我们在前期工作中分离、表达、纯化了Nogo66蛋白,并制备成复合物,证实了Nogo66蛋白具有免疫原性[9]。本研究拟建立慢性高眼压模型,探讨Nogo66蛋白复合物对视网膜视神经损伤的免疫保护作用机制,为进一步研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料 1.1.1 主要试剂包括:Nogo66蛋白(本室表达纯化[10]),弗氏完全佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)和复视不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant,IFA)(Sigma, 美国),刀豆蛋白A(ConA)(Sigma, 美国),Rabbit anti-rat GAP43、Rabbit anti-rat CD3、Rabbit anti-rat BDNF(Abcam, 美国),Rabbit anti-rat GDNF(Santa Cruz Biotechnology, 美国),荧光金FG(Sigma, 美国)。
1.1.2 主要仪器包括:Zeiss光学手术显微镜(Zeiss, 德国),532-二极管激光(Alcon, 美国),光学生物显微镜(Olympus CH20, 日本),Tono-PenXL眼压计(Medtronic SALON, 美国),全光谱激光共聚焦显微镜(Nikon, 日本)。
1.2 动物模型的建立选择正常成年SD大鼠18只,8~10周龄,体质量200~220 g,雌雄不拘,由本院实验动物中心提供[许可证号: SCXK(渝)20020003]。建立慢性高眼压大鼠模型:用532-二极管激光对SD大鼠右眼经角膜缘行小梁网及颞上、颞下巩膜浅层静脉血管激光光凝。TONO-PenXL眼压计检测眼压。激光光凝后,每周再次测眼压,持续1周眼压超过21 mmHg认为造模成功。左眼为对照眼。
1.3 Nogo66蛋白复合物接种将本室表达纯化的Nogo66蛋白溶液与CFA或IFA按1∶1体积比例混合,反复碾磨使之完全乳化,4 ℃保存备用。以相同的方法制备卵清蛋白(ovalbumin,OVA)弗氏佐剂复合物。将造模成功的慢性高眼压大鼠均分为2组:Nogo66蛋白弗氏佐剂复合物组(Nogo66-FA组)和卵清蛋白弗氏佐剂复合物组(OVA-FA组),每组9只。Nogo66-FA组给予Nogo66蛋白弗氏佐剂复合物300 μL(含Nogo66蛋白100 μg)接种于四肢皮下,于第7天和第14天各加强接种1次,共3次。OVA-FA组以相同策略分别接种相同卵清蛋白复合物。
1.4 主要检测指标及方法 1.4.1 荧光金逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)于末次接种后2周分别取两组实验大鼠各2只,麻醉动物并固定于立体定位仪上,消毒、沿颅顶中线切开皮肤,30%双氧水涂抹颅骨骨缝,辨认Bregma点。按Paxinos大鼠脑立体定位图谱确定上丘及外侧膝状体的位置[3]。用牙科钻钻开颅骨。通过微量进样器向双侧上丘及外侧膝状体分别缓慢注入2% FG 1 μL,2 min内注射完。人工骨粉封闭骨孔,缝合皮肤。肌注青霉素10万单位。7 d后左心室-主动脉插管,生理盐水和4%多聚甲醛250 mL灌注后,分别取出左右眼球。沿角巩膜缘剪去角膜,去除晶状体、玻璃体,再置于4%多聚甲醛液中固定过夜。仔细剥离视网膜,以玻璃体面朝上,将其平铺于多聚赖氨酸处理的载玻片上。75%甘油封片。在荧光显微镜下(激发波长323 nm)观察视网膜神经节细胞,并采集图片,使用spot(Diagnostic Instruments. Inc, version 3.5.2)软件对每张图片单位面积内的FG标记RGCs进行细胞计数。
1.4.2 免疫荧光观察GAP43、CD3、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在视网膜中的表达于末次接种后2、4、6周分别取两组实验大鼠各2只,3%戊巴比妥钠以1.3/kg行大鼠腹腔注射麻醉。左心室-主动脉插管,生理盐水和4%多聚甲醛250 mL灌注,分别取出左右眼球,用OCT胶包埋速冻后,冰冻切片,厚度为10 μm。倾掉固定液,4 ℃保存。0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗5 min×3次。0.1%Triton X-100通透10 min,0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗3次,每次5 min,或0.01 mol/L枸橼酸盐(pH=6.0),92 ℃ 15 min,自然冷却,0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗3次,每次5 min。5%BSA封闭15 min,倾掉。滴加1∶300倍稀释的第一抗体,4 ℃过夜,0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗5 min×3次。滴加1∶200倍稀释二抗,37 ℃培养箱1 h,0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗3次,每次5 min。滴加DAPI显色剂工作液室温1 min,0.1 mol/L PBS(pH值:7.2~7.6)洗3次,每次5 min。抗荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜镜检。
1.4.3 免疫组化观察GAP43、CD3、BDNF、GDNF在视网膜的表达于末次接种后2、4、6周分别取两组实验大鼠各2只,同前多聚甲醛250 mL灌注后,取左右眼球,浸入4%多聚甲醛固定48 h。将固定好的标本蒸馏水稍洗,修成大约2.0 cm×2.0 cm×0.2 cm的组织块,脱水透明包埋:70%乙醇4 h→80%乙醇4 h→95%乙醇2 h→95%乙醇2 h→无水乙醇1 h 20 min→无水乙醇2 h 20 min→二甲苯1∶1无水乙醇10 min→二甲苯30 min→二甲苯30 min→60 ℃熔点石蜡10 min→62 ℃熔点石蜡15 min→62 ℃熔点石蜡1 h→包埋,蜡块自然冷却后,修掉标本周围多余的蜡,贴上标本对应的标签于蜡块正上方。蜡块稍冻,3~5 μm切片,62 ℃烤箱烘烤1 h。脱蜡至水;二甲苯10 min,二甲苯10 min,100%乙醇2 min,95%乙醇2 min,80%乙醇2 min,自来水洗1 min,蒸馏水洗1 min。将盛有0.01 mol/L (pH=6.0)柠檬盐溶液加热至沸腾(98~100 ℃),切片放入进行抗原修复,其中继续加热10 min。置室温下自然冷却20 min。PBS洗5 min×3次,每片滴加50 μL过氧化酶阻断剂,以阻断内源性过氧化物酶活性,室温孵育10 min。5%BSA封闭15 min,倾掉。滴加50 μL GAP-43第一抗体,4 ℃冰箱过夜。PBS洗5 min×3次,每片滴加50 μL生物素标记的二抗,37 ℃温箱孵育10 min。PBS洗5 min×3次,每片滴加50 μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,37 ℃温箱孵育10 min。PBS洗5 min×3次;每片滴加100 μL新鲜配制的DAB+H2O2溶液,显色5 min;流水冲洗,苏木精复染3 min,自来水洗,0.6%盐酸酒精分化15 s,自来水冲洗15 min。梯度酒精干燥脱水:80%乙醇2 min,95%乙醇2 min,100%乙醇2 min,100%乙醇2 min。透明:二甲苯10 min,二甲苯10 min。中性树胶封片。显微镜下观察。
1.4.4 Western blot检测视网膜BDNF、GDNF蛋白表达同前多聚甲醛250 mL灌注后,取左右眼球,剥离视网膜,研磨成匀浆,蛋白变性,SDS PAGE电泳,一抗(兔抗大鼠BDNF,兔抗大鼠GDNF)4 ℃摇床孵育过夜,TBST漂洗;二抗(FITC山羊抗兔IgG,CY3兔抗山羊IgG,CY3山羊抗兔IgG)室温摇床孵育2 h,TBST漂洗;PVDF膜曝光。
1.5 统计学分析应用Image-Pro Plus Version 6.0图像分析软件处理免疫组化图片;使用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,两组之间数据采用成组比较t检验或t'检验,检验水准: α=0.05。
2 结果 2.1 实验组和对照组眼压比较532-激光造模前,实验组和对照组眼压无明显差别。激光造模后第3天,实验组眼压开始升高,但仍 < 21 mmHg,在正常范围之内。此后持续缓慢升高。1周时超过21 mmHg,与对照组眼压比较差异有统计学意义(P < 0.05)。第4周时达最高峰,到12周时眼压未见明显下降,与对照组比较眼压差异有统计学意义(P < 0.05)。整个观察过程中对照组眼压在正常范围,未见明显波动(表 1)。
组别 | 激光前 | 激光后3 d | 激光后1周 | 激光后4周 | 激光后8周 | 激光后12周 |
对照组 | 16.8±3.9 | 17.1±3.2 | 16.2±3.3 | 17.1±3.0 | 17.4±2.8 | 16.2±3.7 |
实验组 | 17.0±3.2 | 19.6±4.0 | 21.5±3.7a | 24.8±3.2a | 23.1±3.4a | 20.8±2.1a |
a: P < 0.05,与对照组比较 |
2.2 Nogo66-FA复合物接种后RGCs数量增加
接种Nogo66蛋白复合物后,慢性高眼压大鼠RGCs单位面积计数为(1 839.30±62.46),虽然仍低于对照组大鼠(t=4.685,P < 0.001),但高于OVA-FA组单位面积计数(1 721.19±57.53),差异有统计学意义(t=1.492,P=0.039, 图 1)。
2.3 Nogo66-FA复合物接种后视网膜GAP43、CD3表达上调
慢性高眼压模型大鼠Nogo66-FA组视网膜有大量GAP43表达,主要在节细胞层和外丛状层,内核层、外丛状层和外核层亦有少量表达;OVA-FA组仅有外丛状层有少量表达(图 2)。Nogo66-FA组视网膜节细胞层和外丛状层有CD3表达;OVA-FA组视网膜未见明显CD3表达(图 3)。
2.4 Nogo66-FA复合物接种后视网膜BDNF、GDNF表达上调
慢性高眼压模型大鼠Nogo66-FA组视网膜各层大量表达BDNF和GNDF,主要分布在节细胞层、内丛状层和内核层;OVA-FA组视网膜可见少量BDNF和GNDF表达,主要分布在内核层。Western blot结果亦显示Nogo66-FA组视网膜BNDF、GDNF蛋白表达显著高于OVA-FA组(P < 0.01, 图 4)。
3 讨论
慢性高眼压动物模型的建立是研究青光眼相关视网膜视神经损害所必需的,目前有多种造模方式,以破坏小梁结构[11]为主,另外还有在角膜缘植入硅胶环[12-13],或者直接缝合房角[14]等方法,目的均为通过阻止房水外流来升高眼压,眼压升高且维持一段时间是鉴定造模成功的主要指标[11]。本研究使用523激光破坏小梁组织来达到眼压升高的目的,损伤小,易操作,造模成功率较高。
中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后的再生修复一直是困扰医学界的世界性难题。胚胎时期的CN具有良好的再生性,但成熟的CN在损伤后却几乎无再生能力,其原因可能有两个:一是CNS神经元自身缺乏足够的再生能力;二是CNS神经元所生存的外部微环境中各种外源性生长促进性和抑制性因子的影响。目前认为外部微环境起主要作用。CNS中许多阻断轴突再生的抑制分子与髓磷脂有关,已确认的有Nogo、髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein, OMgp),它们被证实与相同的神经元受体NgR结合而发出抑制信号。目前一致认为Nogo具有最强的抑制作用[15]。
本研究将Nogo66蛋白复合物接种于慢性高眼压模型大鼠后,考察其视网膜微环境改变。发现慢性高眼压模型大鼠接种Nogo66蛋白复合物后视网膜均有明显T细胞浸润,考虑弗氏佐剂有一定的免疫增强作用,同时发现视网膜RGCs存活率明显高于对照组,视网膜局部神经营养因子表达上调,可能是视网膜局部浸润的T细胞影响所致,这种微环境的变化对受损的视网膜视神经有一定的保护作用,这个结论和国外报道一致[16-17]。T细胞的浸润可能与视网膜视神经损伤后血视网膜外屏障功能改变和视网膜血管渗透率改变有关。前期实验已证实,Nogo66蛋白复合物接种后,可刺激动物机体特异性IgG抗体增殖和T细胞活化,并产生以细胞免疫为主的自身免疫反应[9]。研究表明:损伤时CNS存在很弱的自身免疫神经保护作用,被动转移自身免疫性T细胞可增强这种保护作用[18]。据此可以推测,在视网膜视神经受损的病理情况下,视网膜血管通透率增高,T细胞进入视网膜并在受损部位聚集,可能增强了视网膜局部受损的神经细胞的自我修复。
目前对自身免疫T细胞的神经保护作用机制尚了解不多。自身免疫T细胞的神经保护作用可能主要是拯救那些逃脱了原发性损伤的濒危神经元,减轻损伤引起的继发性损害[19-20]。其依据有:①从损伤到恢复的时间较短,尚不足以形成再生;②对完全横断的脊髓损伤几乎无保护作用;③形态学和影像学研究显示组织结构近似于正常组织,而非新生组织[21]。
有研究证实:聚集的自身反应性T细胞分泌多种细胞因子和神经生长因子,在T细胞介导的神经保护作用中很明确地起到了重要作用[22-23]。不同抗原特异性T细胞可表达神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3 (NT-3)和神经营养因子- 4/5(NT-4/5)的mRNA和蛋白[24],神经营养因子可改善受损神经元局部微环境,促进神经元再生修复。本研究亦发现Nogo66蛋白复合物接种实验大鼠后,视网膜局部多种神经营养因子如BDNF、GDNF表达上调,这改善了受损视网膜神经元周围微环境,为促进受损神经元再生提供了良好了条件,可能为视网膜视神经损伤后RGCs再生修复的机制之一。
另外,在分子水平,神经发育和再生时轴突的生长与一组生长相关蛋白(growth-associated proteins, GAPs)的表达有关,GAP43是其中重要成员,主要影响神经发育和再生轴突的生长能力[25],其参与突触重建过程,能调节神经元对轴突引导信号的反应,通过引导轴突生长和调节新连接形成而影响轴突生长能力[26],即使在缺乏其他营养因子时,GAP43也能使神经元发出新的终末[27]。所以GAP43被认为是神经元生长期的内在决定因子,可作为神经再生的标志。本研究发现Nogo66蛋白复合物接种后慢性高眼压大鼠视网膜局部节细胞层和外丛状层GAP43表达增多,提示视网膜神经节细胞轴突再生活跃。有研究表明神经营养因子可刺激神经轴突GAP43表达上调,故而推测实验大鼠视网膜局部GAP43表达增多可能与视网膜神经营养因子表达上调有关。局部微环境的改善和GAP43表达上调可能是慢性高眼压大鼠RGCs再生活跃的原因之一。
本研究初步探讨了Nogo66蛋白复合物促进慢性高眼压大鼠视网膜神经细胞再生修复的机制,但慢性高眼压损伤后,视网膜局部GAP43是通过何种机制表达增加的?是否与局部聚集的T细胞和表达上调的神经营养因子有关?局部表达增多的神经营养因子是否由局部聚集的T细胞直接分泌而来?总之,各种因子变化的相关性尚需进一步实验证实。
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