2. 830000 乌鲁木齐,新疆医科大学:第四附属医院干部二科;
3. 830000 乌鲁木齐,新疆医科大学:基础医学院生理学教研室;
4. 830000 乌鲁木齐,新疆医科大学:中医学院
2. Second Department of Cadre Ward, the Fourth Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region, 830000, China;
3. Department of Physiology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region, 830000, China;
4. College of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region, 830000, China
非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种进行性肝脏疾病,与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和高脂血症等代谢紊乱关系密切,是诱发肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭、肝癌和死亡的主要原因[1]。国内外关于NAFLD的临床治疗方法不尽人意,且FDA(Food and Drug Administration)和EMA(European Medicines Agency)尚无批准任何治疗药物。近几年研究发现,从天然产物中分离的单体或其提取物能够改善NAFLD脂代谢紊乱,由于低毒性、多靶点、多功能等优势,引起学者的关注。例如白藜芦醇(RSV)可通过PKA/AMPK/PPARα信号通路改善NAFLD脂质代谢,缓解氧化应激,起到肝脏保护作用[2]。高燕翔等[3]发现白藜芦醇可预防大鼠非酒精性脂肪肝的发生。
两色金鸡菊为菊科属一年生草本植物,具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效[4],主产地在中国新疆,当地维吾尔族人将其作为花茶食用[5];其主要成分有黄酮类、挥发油类、有机酸类、多酚类等[6]。本课题组前期研究表明两色金鸡菊具有降血脂、降血糖、降血压、抗炎抗氧化、减少胰岛素抵抗等活性[7-10],其主要单体化合物黄诺玛苷(flavanomarein)也具有抗糖尿病肾病、抗氧化、降血脂等药理作用[11-12]。然而,目前关于黄诺玛苷对肝脏脂肪代谢的研究鲜有报道,黄诺玛苷对NAFLD作用的具体机制尚不明确。本研究运用网络药理学对黄诺玛苷作用NAFLD可能靶点进行预测,并进一步利用动物、细胞模型进行验证,以期初步阐明黄诺玛苷抗NAFLD的作用。
1 材料与方法 1.1 材料黄诺玛苷由本课题组制备[13](纯度>99%);甘油三酯(TG)测试盒(批号:A110-1-1)来自南京建成生物工程研究所;还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione, oxidized, GSSG)测试盒购自北京索莱宝科技有限公司,批号分别为BC1175、BC1185;基因引物序列由上海生工生物合成;兔抗FASN抗体(批号:3180)购自美国Cell Signaling Technology公司;兔抗SREBP、PPARγ、PPARα抗体(批号分别为:AF6283、AF6284、AF5301)购自Affinity生物科学公司;胎牛血清FBS购自美国Gibco公司,DMEM培养基购自美国Hyclone公司,噻唑蓝MTT、油红O染液购自德国Sigma公司。
1.2 方法 1.2.1 化合物和疾病作用靶点获取利用Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch)数据库[14]对黄诺玛苷进行靶点分析。黄诺玛苷的SMILES格式可在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库[15]中获取。启动DiS GeNET(http://www.disgenet.org)数据库[16],检索“Non-alcoholic Fatty Liver Disease”关键词,收集并整理NAFLD相关靶点基因。
1.2.2 黄诺玛苷治疗NAFLD的潜在靶点预测及蛋白互作网络(PPI)构建将黄诺玛苷作用靶点与NAFLD靶点进行Venn分析,得到黄诺玛苷干预NAFLD的预测靶点。利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库[17]将黄诺玛苷与NAFLD的靶点基因进行统一转化,再导入Biso Genet 3.0.0(http://apps.cytoscape.org/download/stats/bisogenet/)数据库[18]进行蛋白-蛋白相互作用分析,得到疾病与化合物的蛋白-蛋白互作网络图。
1.2.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析利用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)数据库[19]的富集功能,得到核心靶点的分子功能(molecular functions,MF)、生物过程(biological processes, BP)、细胞组分(cellular components, CC)及KEGG信号通路,整理后导入Cytoscape3.8.0(https://cytoscape.org/)软件[20],获取黄诺玛苷治疗NAFLD的“核心靶点-通路”网络图。
1.2.4 动物分组及给药选取5周龄SPF级健康雄性db/db小鼠30只,购自南京大学模式动物研究所,动物许可证号:SCXK(苏)2018-0008。适应性饲养2周后,按随机数字表法分为3组:db/m组(正常)、db/db模型组、db/db+黄诺玛苷组(db/db+F),每组各10只,以基础饲料喂养,每日灌胃。3组均为正常。
1.2.5 小鼠肝脏病理切片观察与生化指标检测小鼠给药12周后,颈椎脱臼处死小鼠,迅速摘取肝脏新鲜组织,根据TG、GSH、GSSG试剂盒说明书进行操作。一部分肝脏固定于4%多聚甲醛溶液中,制备石蜡切片;另一部分甲醛固定24 h,30%蔗糖脱水,OCT胶包埋,制备冰冻切片供后续病理学观察。
1.2.6 检测小鼠肝脏mRNA和蛋白水平采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法检测肝组织PPARα、PPARγ、PGC-1α、CPT1α、SCD-1、FASN、ACC1、ACOX-1 mRNA的表达,以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。提取小鼠肝脏总蛋白,检测FASN、SREBP、PPARα、PPARγ的蛋白表达,Image Lab软件分析条带的灰度值。
1.2.7 HepG2细胞培养及分组HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中,于37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养。采用噻唑蓝MTT法筛选出游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)、黄诺玛苷的作用浓度及时间,分为正常组、FFAs(500 μmol/L)组、FFAs+黄诺玛苷(25、50、100 μmol/L)组。
1.2.8 HepG2细胞油红O染色及甘油三酯(TG)含量测定HepG2细胞接种于24孔板,生长至80%~90%时,分为正常组、FFAs(500 μmol/L)组、FFAs+黄诺玛苷(25、50、100 μmol/L)组。干预24 h后,4%多聚甲醛,37 ℃固定30 min。油红O工作液,室温染色15 min后于倒置显微镜下观察。吸去蒸馏水,加入异丙醇溶液,37 ℃,30 min,提取TG。酶标仪于波长510 nm处测定光密度值[D(510)]。
1.2.9 检测HepG2细胞mRNA和蛋白水平采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法检测HepG2细胞SREBP、SCD1、ACC1、CPT1α、ACOX-1 mRNA的表达,以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。提取细胞总蛋白,检测蛋白指标SREBP、FASN的表达情况,Image Lab软件分析条带的灰度值。
1.3 统计学分析应用SPSS 25.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基于网络药理学的黄诺玛苷治疗NAFLD的作用靶点预测 2.1.1 黄诺玛苷与NAFLD共有靶点的获取通过检索Swiss Target Prediction和DiS GeNET数据库,获得黄诺玛苷作用靶点104个,NAFLD疾病靶点963个,利用OmicShare Tools(http://omicshare.com/tools/)平台对二者的靶点进行Venn分析,获得核心作用靶点29个,见表 1。
序号 | 靶基因 | 基因描述 | Uniprot ID |
1 | PPARG | Peroxisome proliferator-activated receptor gamma | P37231 |
2 | ALOX15 | Polyunsaturated fatty acid lipoxygenase ALOX15 | P16050 |
3 | ALOX12 | Polyunsaturated fatty acid lipoxygenase ALOX12 | P18054 |
4 | MET | Hepatocyte growth factor receptor | P08581 |
5 | VEGFA | Vascular endothelial growth factor A | P15692 |
6 | HIF1A | Hypoxia-inducible factor 1-alpha | Q16665 |
7 | BCL2 | Apoptosis regulator Bcl-2 | P10415 |
8 | NR1H4 | Bile acid receptor | Q96RI1 |
9 | MMP2 | 72 kDa type Ⅳ collagenase | P08253 |
10 | MMP13 | Collagenase 3 | P45452 |
11 | PTPN1 | Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1 | P18031 |
12 | CES2 | Cocaine esterase | O00748 |
13 | SHBG | Sex hormone-binding globulin | P04278 |
14 | BCHE | Cholinesterase | P06276 |
15 | AKR1B1 | Aldo-keto reductase family 1 member B1 | P15121 |
16 | MMP9 | Matrix metallo proteinase9 | P14780 |
17 | CBR1 | Carbonyl reductase1 | P16152 |
18 | APP | Amyloid-beta precursor protein | P05067 |
19 | STAT1 | Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta | P42224 |
20 | CES1 | Liver carboxylesterase 1 | P23141 |
21 | SLC10A2 | Ileal sodium/bile acid cotransporter | Q12908 |
22 | PTGS1 | Prostaglandin G/H synthase 1 | P23219 |
23 | ESR1 | Estrogen receptor | P03372 |
24 | SLC5A2 | Sodium/glucose cotransporter 2 | P31639 |
25 | SQLE | Squalene monooxygenase | Q14534 |
26 | MAPK14 | Mitogen-activated protein kinase 14 | Q16539 |
27 | CYP19A1 | Aromatase | P11511 |
28 | SERPINE1 | Plasminogen activator inhibitor 1 | P05121 |
29 | TERT | Telomerase reverse transcriptase | O14746 |
2.1.2 黄诺玛苷与NAFLD的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图
用Biso Genet软件将黄诺玛苷与NAFLD分别作PPI分析,然后取交集得到4 380个节点(nodes),90 568条边(edges),计算网络中所有节点Degree值的2倍中位数,提取Degree大于2倍中位数的Hithubs网络。对Hithubs网络中的数据进行CytoNCA分析,取度中心性(degree centrality,DC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、介度中心性(between centrality,BC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、网络中心性(network centrality,NC)及局部边连通性(local average connectivity,LAC)的中位数进行筛选,得到53 nodes和427 edges(图 1)。
2.1.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析
对GO分析结果进行汇总整理,发现有6个分子功能、20个生物过程、5个细胞组分(图 2)。将富集到的通路信息与核心靶点绘制出化合物与疾病的“核心靶点-通路”网络图(图 3)。图中共有69个节点,每条边代表核心靶点与通路间的相互作用。其中黄色节点代表 29个核心靶点,绿色节点代表 40条通路。其形状面积越大,占比越大,表示发挥的作用越大。因此,可以看出PPARG、HIF1A、VEGFA是黄诺玛苷作用NAFLD的关键靶点。
2.2 黄诺玛苷抗非酒精性脂肪肝病机制研究 2.2.1 小鼠肝脏病理学观察
新鲜肝脏组织的肉眼观察(图 4)可见:db/m组小鼠肝脏颜色红润,呈红褐色,外观饱满有光泽,体积适中,组织弹性较好。db/db模型组小鼠肝脏颜色暗黄,无光泽,组织肿大,相对正常组弹性较差,压迫时出现凹陷,切面有油腻感。db/db+黄诺玛苷组小鼠肝脏与db/db模型组相比,肝脏颜色有所好转,表面也比较光滑,触之有弹性。
各组肝脏切片染色后光镜观察见图 4。HE染色结果显示,db/m组小鼠肝脏切片光镜下可见细胞形态规则,细胞质均匀,细胞核清晰。db/db模型组肝细胞排列不规则,细胞膨胀,出现空泡气球样变。与db/db模型组相比,db/db+黄诺玛苷组细胞质、核清晰可见,未见空泡样变性、细胞坏死,肝细胞受损情况明显好转。油红O染色结果显示,db/m组与db/db+黄诺玛苷组小鼠肝脏组织结构完整,排列整齐,肝细胞大小正常,细胞核居中,小部分有轻微脂肪浸润,大部分正常,无脂肪浸润等异常改变;db/db模型组有重度脂滴出现,肝细胞肿胀,体积增大,细胞核被推向周边。
2.2.2 小鼠肝脏生化指标检测由试剂盒检测结果得知,db/db模型组的TG水平高于db/m组(P < 0.05),db/db+黄诺玛苷组的TG水平较db/db模型组显著降低(P < 0.05,图 5)。
与db/m组相比,db/db+黄诺玛苷组的还原型谷胱甘肽GSH水平升高(P < 0.05);db/db模型组氧化型谷胱甘肽GSSG水平高于db/m组和db/db+黄诺玛苷组(P < 0.05);db/db+黄诺玛苷组GSH/GSSG比值远高于db/db模型组(P < 0.05,图 6),提示黄诺玛苷有一定的抗氧化作用。
2.2.3 黄诺玛苷对小鼠肝脏脂代谢相关基因表达的影响
结果见图 7。与db/m组和db/db模型组相比,db/db+黄诺玛苷组小鼠肝脏PPARα、ACOX-1、CPT1α mRNA表达显著升高(P < 0.05)。与db/m组比较,db/db模型组小鼠ACC1的表达显著升高(P < 0.05);与db/db模型组比较,db/db+黄诺玛苷组小鼠ACC1、SCD1和FASN mRNA水平显著降低(P < 0.05)。
2.2.4 黄诺玛苷对小鼠肝脏蛋白水平的影响
与db/m组相比,db/db模型组小鼠肝脏SREBP蛋白表达显著升高(P < 0.05), 黄诺玛苷干预后显著降低(P < 0.05);与db/db模型组比较,db/db+黄诺玛苷组FASN表达下降(P < 0.05),PPARα、PPARγ表达显著上调(P < 0.05,图 8)。
2.3 黄诺玛苷对FFAs诱导的HepG2细胞脂代谢的机制研究 2.3.1 黄诺玛苷对FFAs干预HepG2细胞存活率的影响 2.3.1.1 不同浓度及时间FFAs对肝癌HepG2细胞存活率的影响
随着FFAs浓度增大及作用时间延长,HepG2细胞的存活率逐渐降低。在500 μmol/L时存活率达到峰值,以后FFAs的抑制作用开始增加,且有时间依赖性(图 9)。
2.3.1.2 不同浓度及时间黄诺玛苷对肝癌细胞HepG2存活率的影响
细胞的存活率随黄诺玛苷的作用时间增长而下降,浓度在25、50、100 μmol/L,干预24 h时存活率没有受到明显抑制(图 10)。
2.3.1.3 不同浓度及时间黄诺玛苷对FFAs诱导的肝癌细胞HepG2存活率的影响
细胞的存活率在黄诺玛苷给药25、50、100 μmol/L时没有受到明显抑制(图 11)。
2.3.2 黄诺玛苷对FFAs诱导细胞内的脂质影响
与正常组相比,FFAs组细胞内脂滴明显增多,黄诺玛苷给药组较模型组脂滴减少,甘油三酯含量有同样变化,差异均有统计学意义(P < 0.05,图 12、13)。表明黄诺玛苷可降低HepG2细胞内脂质含量。
2.3.3 HepG2细胞内mRNA水平
与正常组和FFAs组相比,黄诺玛苷给药组脂质合成相关基因SREBP、SCD1、ACC1表达显著下降(P < 0.05),而β-氧化基因CPT1α、ACOX-1水平显著升高(P < 0.05,图 14)。
2.3.4 HepG2细胞蛋白水平
与正常组相比,FFAs组FASN、SREBP蛋白表达升高(P < 0.05), 黄诺玛苷干预后均显著降低(P < 0.05,图 15)。
3 讨论
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)代表一系列疾病,从单纯性脂肪变性或非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌[21]。在过去几十年间,NAFLD的患病率呈上升趋势,患病人群开始向儿童和青少年倾斜,成为全球慢性肝病的最常见原因[22-23]。NAFLD常伴随动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾脏疾病发生,对全球医疗保健造成极大的经济负担[24]。因此,积极探索防治NAFLD的安全有效措施十分迫切。
NAFLD发病机制十分复杂,目前尚未完全清楚。早期理论采用“两次击打学说”来描述,“初次击打”以肝脏脂肪增加为特征,主要是甘油三酯积累和胰岛素抵抗。随后,出现了“第二击”,以炎症因子、脂肪因子、线粒体功能障碍和氧化应激对肝脏的再次损伤,造成坏死性炎症和纤维化,最终导致肝硬化。然而,随着新技术发展和进一步研究,这种观点似乎过于简单,无法概括人类NAFLD的复杂性。现在,被广泛接受的理论是“多次击打模型”,由于遗传和环境因素的相互作用以及不同器官和组织(包括脂肪组织、胰腺、肠、肝)之间的串扰变化,涉及更广泛的代谢功能障碍。但是,由肥胖和胰岛素抵抗引起的肝脂肪蓄积似乎仍然代表着至关重要的“第一击”[25]。肝脏脂质代谢紊乱与脂质蓄积是NAFLD关键的发病诱因,在NAFLD病程中起着重要作用。黄诺玛苷是两色金鸡菊的主要单体化合物,具有多重药理作用。课题组前期研究发现黄诺玛苷经Syk /TGF-β1/ Smad信号通路促进了高糖刺激的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)的增殖并抑制了上皮-间质转化,发挥抗糖尿病肾病的肾脏保护作用[11]。MENDEL等[26]研究发现黄诺玛苷具有胃肠道保护、抗炎、抗溃疡和免疫调节作用。本研究利用网络药理学工具发现黄诺玛苷可对某分子进行调节,有研究提示这些分子是治疗NAFLD的靶点,这些靶点被富集到NAFLD发生、发展的信号通路中[27-28]。
本研究筛选得出黄诺玛苷活性靶点104个,抗NAFLD潜在靶标29个;GO功能和KEGG通路富集到20个生物过程,40个信号通路。依据log10P值越小,信号通路相关性越大,挑选出了AMPK调控的脂代谢通路,即最有可能阐述黄诺玛苷治疗NAFLD的分子机制。根据“核心靶点-通路”网络图,节点形状越大,占比面积越大,发挥作用越大。黄诺玛苷对接NAFLD的核心靶点中过氧化物酶体增殖物激活受体家族蛋白(PPARγ)的占比最大,所以本研究以PPARγ为主要靶点对黄诺玛苷抗NAFLD进行机制研究。黄旦等[29] 研究发现PPARγ可活化AMPK/FOXO3a信号通路,抑制免疫炎症反应,改善动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS) 患者氧化应激。本研究结果显示:在黄诺玛苷干预后,小鼠肝脏PPARγ蛋白、GSH的含量显著上升,表明黄诺玛苷在肝脏中发挥了一定的抗氧化作用。激活PPARγ后还可启动下游LXRα基因的转录与翻译[30]。LXRα是一种细胞核受体,参与甘油三酯和胆固醇的合成与分解过程,促进胆固醇向胆汁酸转化,最终以胆汁形式排出体外,在维持胆固醇稳定过程中起关键作用。LXRα可通过调控SREBP的转录参与下游多种脂肪合成酶的合成。SREBP是固醇调节元件结合蛋白家族的成员之一,是肝脏调节脂质合成的主要转录因子[31]。其过表达后可异常激活下游参与脂质合成的脂肪酸合成酶(FASN)和乙酶辅酶A羟化酶(ACC),进而导致肝脏内脂质的过度沉积,引起脂代谢的紊乱[32]。本研究显示,模型组小鼠肝脏病理学表现为肝细胞膨胀,出现空泡气球样变化和脂滴堆积;且模型组的TG水平较正常组显著升高。在黄诺玛苷干预后,HE和油红O染色显示肝细胞大小恢复正常,气球样变减少,仅有小部分轻微脂肪浸润,TG含量与正常组无明显差异。与模型组相比,黄诺玛苷干预组中脂质合成相关的基因FASN、SCD1、ACC1 mRNA水平及蛋白SREBP、FASN表达水平显著降低,而β-氧化相关基因ACOX-1、CPT1α表达升高,差异均有统计学意义。表明黄诺玛苷可减少高脂喂养小鼠肝脏中TG的异位沉积,降低脂质合成基因的表达,上调β-氧化相关基因,对小鼠的NAFLD脂代谢紊乱有改善作用。以上研究结果表明,黄诺玛苷对NAFLD小鼠的防治发挥了重要作用。
为提供更多实验证据,本研究通过构建HepG2肝癌细胞脂肪变性模型,模拟NAFLD发生时脂质蓄积对其的损伤作用,探究黄诺玛苷对非酒精性脂肪肝体外模型的改善作用。首先,油红O染色结果观察到黄诺玛苷可以减少HepG2细胞内脂质蓄积,定量结果也发现黄诺玛苷干预后细胞内TG含量显著降低。qRT-PCR检测相关基因显示:黄诺玛苷能降低脂质合成基因SREBP、SCD1、ACC1的表达,提高CPT1α、ACOX-1 mRNA水平。Western blot检测蛋白表达显示: 黄诺玛苷能降低FASN及SREBP蛋白表达水平。表明黄诺玛苷可通过抑制FASN、SREBP的基因和蛋白表达来调控TG的合成,提高CPT1α、ACOX-1表达来增加脂肪酸的β-氧化,与动物体内研究结果相一致。
综上所述,本研究结果表明两色金鸡菊单体化合物黄诺玛苷可能通过调控PPARγ/SREBP/FASN改善肝脏氧化应激,增加脂肪酸β-氧化,减少脂质合成,从而对NAFLD发挥治疗作用。本研究为两色金鸡菊治疗NAFLD提供了理论依据,然而其具体作用机制仍需进一步研究。
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