哮喘是一种常见、复杂的慢性呼吸系统疾病,会引起可逆性气道阻塞、过度的黏液生成等病理改变[1]。哮喘的具体发病机制目前尚未完全明确。但在哮喘发病机制中,病理变化的基础是气道炎症。因此,抑制气道炎症反应、明确哮喘发病机制中参与炎症反应的基因以及分子机制具有重要意义。驱动蛋白家族成员3A(kinesin family member 3A,KIF3A)是调控微管功能和运输的异三聚体驱动蛋白2的亚基[2-4],其基因位点被多次证明与哮喘和湿疹易感相关[5-8]。有研究证实[9-11],KIF3A在哮喘患者中异常表达,并将其鉴定为新的哮喘标志物候选基因。因此,我们推测KIF3A可能在哮喘的发病中起重要作用。然而,目前有关KIF3A在哮喘气道炎症方面的报道不多,尤其是KIF3A在气道上皮细胞炎症中的作用研究。
Wnt/β-catenin通路可通过促进细胞因子和炎症介质的表达而调控哮喘气道炎症[12-14],被认为是哮喘治疗的可能分子靶标之一[15]。研究发现,β-arrestin是一种多功能支架蛋白,同时也是Wnt通路中的关键蛋白[16-17]。最近的研究表明,KIF3A能够抑制Wnt/β-catenin通路的活化[18]。还有研究报道:气道上皮除了作为保护性物理屏障之外,还发挥着有效的免疫反应功能,在哮喘的气道炎症中起重要作用[19]。在人支气管上皮细胞中,KIF3A调控Wnt/β-catenin通路活性的可能机制目前尚少见报道。因此,本研究拟通过动物和细胞实验来初步探讨KIF3A是否通过Wnt/β-catenin通路中的β-arrestin参与哮喘气道炎症的调控。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂人支气管上皮细胞16HBE来自于本课题组液氮冻存细胞库;DMEM高糖培养基、胰酶(Gibco);胚胎血清(以色列BI);一抗KIF3A、β-arrestin(Abcam);一抗β-catenin(Cell Signaling);山羊抗兔IgG、封闭用山羊血清、兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒(中杉金桥);ECL发光试剂盒、PVDF膜(Millipore);全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(凯基);5×SDS-PAGE上样缓冲液、SDS-PAGE配胶试剂盒、Protein A+G Agarose、兔IgG(碧云天);屋尘螨(Greerlabs);敲低的慢病毒载体(LV-KIF3A-RNAi-81183-1,含有KIF3A RNAi序列TCAGTCTTTGATGAAACTA)及阴性对照载体(LV-KIF3A-Control,含有阴性对照序列TTCTCCGAACGTGTCACGT),过表达的慢病毒载体(LV-KIF3A-45894-J2)及阴性对照载体(LV-KIF3A-Control),分别由上海吉凯基因技术公司基于GV493载体(元件顺序:hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)和GV492载体(元件顺序:Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)构建、筛选并鉴定。总RNA提取试剂盒(百泰克);RNA反转录试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa);PCR引物由华大科技合成。
1.2 实验方法 1.2.1 建立哮喘小鼠模型20只6~8周约20 g的C57BL/6雌性小鼠购于重庆医科大学实验动物中心,饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心SPF级环境中(室温24 ℃,湿度55%~60%,12 h/12 h黑暗/光照循环)。所有的动物实验根据动物实验管理委员会制定的指南进行的,且获得重庆医科大学伦理委员会批准。小鼠按随机数字表法随机分成对照组和哮喘组,每组10只。哮喘组分别在第0、14 d,用20 μg/30 μL屋尘螨(house dust mite, HDM)工作液(由高温高压灭菌生理盐水配置)滴鼻致敏,在第21、23、25、27、29天予以20 μg/30 μL HDM工作液滴鼻激发哮喘。对照组在相同时间接受相同剂量的生理盐水致敏和激发。在最后一次激发后24 h内处死小鼠。
1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)灌取及细胞计数末次HDM激发后24 h内,10%水合氯醛麻醉小鼠,眼球取血后脱颈处死并固定,暴露气管和胸腔,止血钳夹闭左肺门,留置针从气管上端插入并固定,用预冷的无菌PBS灌洗3次,每次0.5 mL,2 500 r/min、4 ℃、离心5 min,收集上清-80 ℃保存。余细胞沉淀中加人1 mL无菌PBS混匀后取20 μL行细胞总计数,剩余细胞悬液按同样方法离心后取细胞沉淀涂片,待干后行瑞氏-吉姆萨染色,油镜下不同视野分类计数200个细胞。
1.2.3 有创肺功能检测末次HDM激发后24 h内,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后行气管插管,连接有创肺功能仪检测小鼠的基础肺功能值,待数据稳定后,用0.9%NaCl测基础值,后依次雾化吸入3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL的乙酰甲胆碱(Mech),每次雾化1 min,记录5 min,取后3 min肺阻力(lung resistance, LR)用做分析小鼠气道高反应性(airway hyperresponsiveness, AHR)的依据。
1.2.4 组织学和免疫组化4%甲醛溶液固定肺组织,经乙醇梯度脱水,石蜡包埋,制成4 μm切片,HE染色,评估肺部炎症细胞浸润情况。上述制备的石蜡切片经脱蜡和再水化后,5%胎牛血清室温封闭30 min,一抗4 ℃孵育过夜,滴加二抗和辣根酶标记链霉素工作液,显微镜下DAB显色,苏木精染色,经脱水后封片。
1.2.5 细胞培养和处理16HBE培养于含10%胎牛血清的DMEM中,培养条件为37℃,5%CO2。待细胞融合达95%~98%,按104~105/cm2接种在培养板中。16HBE根据慢病毒过表达/敲低产品说明书进行感染,获得GFP阳性细胞后,传代培养并用于其后实验。通过RT-PCR和Western blot检测转染细胞KIF3A的表达。获得的各组细胞,以105/cm2接种在培养板中过夜,50 μg/mL HDM处理细胞24 h后,提取细胞蛋白和RNA用于之后的实验。
1.2.6 Western blot检测全蛋白试剂提取盒提取小鼠肺组织和细胞的总蛋白,BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳后,凝胶上的蛋白湿转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭后,与一抗4 ℃孵育过夜,1×TBST漂洗后,分别加入HRP标记的抗兔/鼠IgG二抗,室温孵育1.5 h,1×TBST洗涤后,ECL发光剂显影,Image J软件分析条带。
1.2.7 RT-PCR检测RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA,根据产品说明书,把RNA反转录成cDNA,-20 ℃保存;使用10 μL RT-PCR反应体系,并利用2-ΔΔCt法检测各样本目的基因mRNA的相对表达量。KIF3A正向引物:5′-GTTTGGACTATGCTGATGGCTGC-3′,反向引物:5′-GTTGCCGAATGTTCTCCAGTAGG-3′;β-catenin正向引物:5′-CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG-3′,反向引物:5′-GATTCCTGAGAGTCCAAAGACAG-3′;CCL-17正向引物:5′-CCAGGGATGCCATCGTTTTTG-3′,反向引物:5′- TAGTCCCGGGAGACAGTCAG-3′;CCL-26正向引物:5′- TTGAGGCTGAGCCAAAGACC-3′,反向引物:5′-TGGTAGTGAATATCACAGCCCG-3′;GAPDH正向引物:5′-CAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3′,反向引物:5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTTGCT-3′
1.2.8 免疫共沉淀取蛋白样品,加入IgG作为阴性对照和充分重悬的Protein A+G Agarose,4 ℃缓慢摇动2 h。2 500 r/min离心5 min,取上清,加入用于免疫沉淀的一抗后,4 ℃缓慢摇动过夜。加入充分重悬的Protein A+GAgarose,4 ℃缓慢摇动3 h。2 500 r/min离心5 min,吸除上清,PBS洗涤沉淀5次后,去除上清,1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,沸水浴处理5 min,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳。
1.3 统计学分析采用SPSS18.0和GraphPad Prism 7.0软件进行分析,各组数据比较时,计量资料用t检验,计数资料用χ2检验。
2 结果 2.1 KIF3A在哮喘小鼠中表达降低 2.1.1 C57BL/6小鼠哮喘模型验证小鼠哮喘模型构建如图 1所示。BALF细胞和嗜酸性粒细胞计数发现,哮喘组BALF细胞总数[(15.96±6.67)×105]和嗜酸性粒细胞计数[(11.20±1.48)×105]均较对照组[(6.97±0.71)×105,P < 0.05;(0.40±0.55)×105,P < 0.001]明显增多。HE染色结果显示,与对照组比较,哮喘组小鼠支气管周围大量炎症细胞浸润(图 2)。有创肺功能检测仪检测小鼠AHR的结果见图 3,Mech激发后,哮喘组肺通气阻力较对照组明显增高(P < 0.001)。以上结果说明小鼠哮喘模型构建成功。
2.1.2 KIF3A在哮喘小鼠支气管肺组织中的表达
小鼠哮喘模型构建成功后,免疫组化和Western blot检测KIF3A的表达,结果见图 2、4,哮喘组KIF3A表达水平较对照组显著降低。说明KIF3A的差异表达与哮喘有着一定的相关性。
2.2 KIF3A在HDM干预的人支气管上皮细胞16HBE中的表达进一步用HDM干预人支气管上皮细胞16HBE,Western blot和RT-PCR检测KIF3A的表达水平,结果见图 5,与对照组比较,HDM干预组的KIF3A蛋白和mRNA表达水平[(1.859±1.118)vs(0.610±0.123)]呈下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。
2.3 16HBE过表达/敲低KIF3A的鉴定
慢病毒感染16HBE细胞,约72 h后均可见明亮绿色荧光,细胞形态正常(图 6)。RT-PCR检测发现,过表达组(LV-KIF3A)较对照组(Ctrl)KIF3A mRNA水平显著增多[(0.391±0.104)vs(2.798±1.189),P < 0.05],敲低组(RNAi)较对照组(NC)则明显下降[(3.915±2.005)vs(0.391±0.386),P < 0.05,图 7]。Western blot检测KIF3A蛋白表达亦呈相似改变(图 7),提示成功构建过表达和敲低KIF3A的16HBE模型。
2.4 KIF3A通过与Wnt/β-catenin通路中β-arrestin结合进而影响相关炎症介质的表达
免疫共沉淀结果见图 8,可观察到KIF3A与β-arrestin相结合;Western blot检测结果如图 9所示,过表达/敲低KIF3A的16HBE中,β-catenin的蛋白总量无明显差异,RT-qPCR检测发现,敲低KIF3A的16HBE中β-catenin的mRNA表达量显著降低[(2.134±0.052) vs (0.469±0.018),P < 0.000 1],而过表达组差异无统计学意义[(1.103±0.288)vs(0.942±0.197),P>0.05]。
用RT-PCR检测过表达/敲低KIF3A的16HBE中胸腺活化调节趋化因子(CCL-17)和嗜酸性粒细胞趋化因子3(CCL-26) mRNA的表达水平。如图 10所示,敲低KIF3A的16HBE中,CCL-17(P < 0.001)和CCL-26(P < 0.001)的mRNA表达增多,过表达组则与之相反。
3 讨论
HDM是最常见的空气过敏原之一,临床上高达85%的哮喘患者对HDM过敏[20]。与经典的卵清蛋白(OVA)/氢氧化铝[Al(OH)3]建模相比,本研究采用HDM建立哮喘模型,以局部滴鼻的方式使致敏起始部位发生在肺内黏膜,引起Th2型炎症和AHR反应。因此,HDM诱导建立的哮喘模型与临床实际结合更加紧密,更能说明KIF3A与哮喘的相关性。在体外实验中,我们用HDM干预16HBE,结果发现KIF3A的表达量在统计学上无明显差异,考虑到体内实验涉及多种因素和分子机制的互联交叉复杂调控,因此与细胞实验结果不完全一致,但KIF3A的表达量均呈下降趋势,这些结果都说明KIF3A与哮喘发病密切相关,但其调控哮喘病理进程的可能机制仍需进一步探讨。
本研究在体外过表达KIF3A的16HBE中,通过免疫共沉淀,证实KIF3A通过与β-arrestin结合,参与Wnt/β-catenin通路的调节。此外,RT-PCR结果显示,仅敲低KIF3A的16HBE中β-catenin的mRNA表达下调且有统计学差异,而在过表达/敲低KIF3A的16HBE中,β-catenin总蛋白水平无差异。这说明就生物学相关性而言,某个基因和/或蛋白质的改变可能对通路整体效应的影响更大,而不是通路中某个具体的分子。其次,有时蛋白质的绝对量在生物学上可能不像其所经历的修饰(磷酸化、乙酰化等)那样具有相关性,并且由于转录后mRNA剪接修饰、密码子偏差、核糖体密度和其他调控机制等,基因表达和蛋白质表达之间的相关性可能较低。有研究也证明,β-catenin可以结合结肠腺瘤样息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)[21-22]和/或独立地在细胞核与细胞质之间穿梭[23],β-catenin的穿梭暗示着一个更复杂的由Wnt信号启动的反馈调节回路。因此,KIF3A通过与β-arrestin结合影响β-catenin的表达及在细胞内的动态转运,进而影响整个Wnt通路的深层分子机制,仍待进一步的研究。
Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,可促进细胞因子和炎症介质的表达和释放[15]。细胞趋化因子是一种小分子分泌蛋白,可在多种细胞中表达,促进相关细胞迁移至相应区域发挥作用[24]。CCL-17与特异性受体CCR-4结合,可促进T细胞的活化、炎症介质及相关细胞因子的产生。有研究报道,CCL-17在哮喘小鼠模型中表达上调,哮喘患者外周血中CCL-17较健康对照组也是增高的[25]。CCL-26通过与CCR-3的信号识别,对嗜酸性粒细胞进行选择,趋化嗜酸性粒细胞迁移至相应区域释放炎症介质和相关蛋白[26]。因此,CCL-17和CCL-26可以作为反映哮喘气道炎症的一个相对客观的指标。本研究结果表明,KIF3A低表达时,炎症相关因子CCL-17和CCL-26表达水平增高,过表达KIF3A时则下降,说明KIF3A在过表达时可以在一定程度上缓解气道炎症反应。
本研究发现,HDM诱导的哮喘小鼠模型中KIF3A表达下调,且在体外HDM干预的16HBE细胞株中发现KIF3A的表达也呈下降趋势,由此可证实KIF3A与哮喘存在一定的联系。同时证实KIF3A与β-arrestin结合通过对Wnt/β-catenin信号通路的调控参与哮喘气道上皮细胞的炎症。因此,KIF3A可作为哮喘新的生物标志物以及哮喘治疗的潜在靶标。本研究还存在一定的局限性,首先,在体外过表达KIF3A的16HBE中证明KIF3A与β-arrestin结合,但二者间是直接结合还是间接结合,具体通过何种方式调控Wnt/β-catenin信号通路尚不明确;其次,本研究只在体外细胞模型上验证KIF3A通过与β-arrestin结合参与Wnt/β-catenin信号通路,进而参与气道上皮炎症的调控,而过表达KIF3A在体内哮喘模型中对气道炎症的调控作用,需要在以后的研究中逐渐完善并更深入探讨KIF3A在哮喘发病机制中的具体作用。
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