缺血再灌注(ischemic reperfusion，I/R)是导致急性肾损伤(acute kidney disease，AKI)的一个常见原因，主要受损部位为肾小管，具有较高的发病率和死亡率，AKI后慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的发生率显著升高[1]。尽管在过去10年中，AKI向CKD进展的机制已有大量研究，但有效的治疗策略仍然匮乏。
血管非炎症分子1(vascular noninflammatory molecule-1，Vanin-1)是一种糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定的泛酰巯乙胺酶，是一种重要的氧化应激感受器，高表达于肾脏、肝脏和肠道[2]。BERRUYER等[3]研究发现：Vanin-1基因敲除鼠对氧化应激引起损伤的耐受能力明显增强。而既往已有报道指出：在I/R导致的AKI肾功能恢复过程中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平持续升高，提示氧化应激损伤持续存在，与此同时，TGF-β表达水平持续升高[4]。TGF-β是公认的促进肾间质纤维化的关键因素之一，肾间质纤维化最终可导致肾功能无法恢复，是AKI走向CKD的主要的病理表现之一。那么，Vanin-1是否可调控I/R后的肾组织TGF-β的表达进而调控肾功能的恢复过程？本课题组通过建立I/R肾损伤模型，下调Vanin-1表达，评估各组小鼠肾组织Vanin-1表达水平、组织损伤严重程度及TGF-β表达水平，以探索Vanin-1在肾缺血再灌注损伤后功能恢复过程中的作用及机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物BALB/c野生型小鼠(8周龄)，由本院实验动物中心提供，动物实验方案获得本院伦理委员会批准(医研伦审2014第88号)。Vanin-1基因敲除鼠与野生型小鼠杂交，最终获得同窝出生野生型和Vanin-1基因敲除鼠[5]，用于实验。
1.2 实验分组、造模及标本采集实验分组：选取8周龄BALB/c野生型、Vanin-1基因敲除雄鼠各12只，体质量22~25 g，采用完全随机法分为假手术组、缺血再灌注组、敲除组、敲除+缺血再灌注组，每组6只。
造模方法：手术组小鼠全麻后仰卧位固定于手术台上，术区备皮，碘酒、75%酒精消毒，行腹部正中切口，暴露双侧肾蒂，血管夹夹闭肾蒂，肾脏由粉红色逐渐变为绛紫色，35 min后松开血管夹，肾脏血供恢复，关腹；敲除+缺血再灌注组处理方法同前；假手术组仅暴露双侧肾蒂；敲除组处理方法同假手术组。术后，小鼠放于保温箱内, 密切观察小鼠生命体征。
标本采集：造模后0、3、14 d，经眼球取血，收集血浆送本院检验科检测血清尿素氮、肌酐，收集尿液及肾组织标本。
1.3 PAS染色明确肾组织损伤程度石蜡标本切片，60 ℃烤片20 min，二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇依次脱蜡复水, 清水冲洗5 min, 高碘酸浸染10 min, 清水冲洗5 min，PAS滴染37 ℃ 30 min，清水冲洗5 min，苏木精浸染5 min，清水冲洗5 min，盐酸乙醇分化3 s，清水冲洗5 min，乙醇脱水20 s，二甲苯透明5 min，中性树脂封片。肾脏损伤判定方法：光镜下对皮髓交接区肾小管进行损伤评分。急性损伤评分标准[6]：根据肾小管上皮细胞坏死、刷状缘脱落、管型形成、肾小管扩张占肾小管总数百分比进行评价，0分，无损伤；1分，≤10%；2分，>10%~25%；3分，>25%~45%；4分，>45%~75%；5分，>75%。慢性损伤评分标准[7]：肾小管萎缩、纤维化所占百分比, 0分，无纤维化；1分，< 5%；2分，5%~ < 25%；3分，25%~ < 50%；4分，≥50%。每张切片观察10个连续视野，双盲条件下由实验者和病理医师观察病理变化，取平均值作为衡量肾小管损伤的指标。
1.4 免疫组化检测肾组织Vanin-1表达水平石蜡标本切片，60 ℃烤片20 min，二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇依次脱蜡复水，清水冲洗5 min，高压抗原修复，PBS浸泡5 min，山羊血清封闭30 min，PBS浸洗5 min×3次，用免疫组化笔以组织为中心画圈标记，3%过氧化氢36 ℃ 15 min，PBS浸洗5 min×3次，滴加一抗Vanin-1(浓度1∶100)，4 ℃盒过夜，次日湿盒置于室温复温30 min，PBS浸洗5 min×3次，滴加二抗，湿盒内37 ℃孵育40 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB工作液显微镜下显色，苏木精染液浸泡5 min, 蒸馏水冲洗5 min，盐酸乙醇分化3 s，蒸馏水漂洗5 min，95%~100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.5 肾小管上皮细胞的提取及培养参照文献[8]报道的方法，将2~3周龄BALB/c野生型和Vanin-1基因敲除雄性鼠断颈处死，无菌获取双肾，将肾脏皮质与髓质分离，留取肾皮质在培养皿中用组织剪充分剪碎，与低糖DMEM混合后，移入离心管中离心，去除上清，加入胶原酶后，置于37 ℃摇床消化30 min，双重过滤含DMEM溶液的肾皮质，终止液反复冲洗终止消化。将过滤液收集于大培养皿中，反复吹打后离心，去除上清，在细胞沉淀中加入原代培养基，反复吹打后接种，置入37 ℃、5%CO2培养箱孵育，12 h内不宜晃动培养瓶。48 h后首次更换培养基，此后隔天更换1次。按文献[7]报道的方法对肾小管上皮细胞进行鉴定，细胞纯度达90%以上。
1.6 缺氧-复氧细胞模型的建立原代肾小管上皮细胞传代至第2代用于实验，分别设置：对照组、对照+损伤组、敲除组、敲除+损伤组。两损伤组予以缺氧48 h(1%O2，94%N2，5%CO2)，复氧24 h(5%CO2，95%空气)后分别收上清和细胞。对照组、敲除组不予任何处理。每组实验重复3次。
1.7 Western blot检测各组肾小管上皮细胞Vanin-1表达水平制备蛋白样品，按照蛋白含量的测定试剂盒步骤检测光密度值(BCA定量)，计算蛋白含量和上样量，SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗Vanin-1(浓度1∶800，货号：21745-1-AP，Proteintech)或GAPDH一抗(浓度1∶10 000，货号：60004-1-lg)，4 ℃过夜，次日室温下TBST脱色，显影液显影。
1.8 ELISA检测各组小鼠尿液及各组肾小管上皮细胞上清TGF-β表达水平利用ELISA试剂盒标准流程(上海恒远生物科技有限公司)检测小鼠尿液和细胞培养上清TGF-β水平。不同血清样品分别加入96孔板中，37 ℃孵育30 min，洗涤液清洗5次后，加入50 μL的酶标试剂，37 ℃孵育30 min，洗涤液清洗5次，每孔加入显色液A 50 μL，再加入显色液B 50 μL，37 ℃避光显色10 min，最后加入终止液50 μL，然后于15 min内利用ELISA检测仪检测。
1.9 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以x±s表示，采用双因素或多因素方差分析，两组多重比较采用Bonferroni法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基因敲除Vanin-1可促进I/R肾损伤小鼠肾脏结构和功能恢复I/R损伤后第3天，与假手术组相比，缺血再灌注组、敲除+缺血再灌注组血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P < 0.01)，PAS染色提示可见大量肾小管上皮细胞坏死、脱落等，但缺血再灌注组、敲除+缺血再灌注组两组小鼠血清肌酐、尿素氮水平无明显差异，PAS染色提示两组肾组织损伤无明显差异。I/R后第14天，敲除+缺血再灌注组血清肌酐、尿素氮恢复速度均明显快于缺血再灌注组(P < 0.05)，PAS肾组织慢性损伤评分明显低于缺血再灌注组(P < 0.05，图 1A~D)。免疫组化结果提示：I/R肾损伤第14天，缺血再灌注组肾组织Vanin-1表达明显升高(P < 0.01，图 1E、F), 且主要表达于受损肾小管上皮细胞。
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1：缺血再灌注组；2：敲除+缺血再灌注组；a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.05，与缺血再灌注组比较；c：P < 0.01，与0 d比较 A、B：分别为各组术后不同时间血清肌酐、尿素氮水平；C：损伤后第3天急性肾脏损伤评分；D：缺血再灌注损伤后第14天慢性肾脏损伤评分；E：免疫组化检测缺血再灌注损伤后肾组织Vanin-1表达箭头示Vanin-1表达；F：缺血再灌注损伤后肾组织Vanin-1表达阳性肾小管面积 图 1 基因敲除Vanin-1可促进I/R肾损伤小鼠肾脏结构和功能恢复 |
2.2 Vanin-1可调控I/R肾损伤小鼠尿中TGF-β水平
I/R损伤后第14天，敲除+缺血再灌注组尿中TGF-β水平明显低于缺血再灌注组(P < 0.05，图 2), 提示Vanin-1可调节TGF-β分泌。
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| a：P < 0.05，与缺血再灌注组比较 图 2 Vanin-1敲除I/R肾损伤小鼠尿中TGF-β水平变化 |
2.3 Vanin-1可促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β
体内实验结果提示Vanin-1可通调控TGF-β分泌，延缓肾脏功能恢复。体外实验结果显示：对照+损伤组肾小管上皮细胞Vanin-1表达明显升高(P < 0.01)，对照+损伤组肾小管上皮细胞上清TGF-β水平明显高于敲除+损伤组(P < 0.05，图 3)，提示Vanin-1可促进TGF-β表达。
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1：对照组；2：敲除组；3：对照+损伤组；4：敲除+损伤组；a：P < 0.01，与对照组比较；b：P < 0.05，与对照+损伤组比较 A：Western blot检测各组细胞Vanin-1蛋白表达；B：各组细胞Vanin-1相对表达量；C：各组细胞上清TGF-β表达水平 图 3 Vanin-1可促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β |
3 讨论
I/R是导致AKI的常见原因，针对AKI，目前主要以对症支持治疗为主，缺乏有效的治疗手段，AKI后的肾脏修复机制是目前肾脏病学者研究的重点。本研究通过血管夹夹闭双侧肾蒂35 min，成功构建了I/R重度肾损伤模型，发现I/R损伤后第14天，小鼠肾组织Vanin-1表达水平明显升高。为进一步明确Vanin-1在I/R后肾脏恢复过程中的作用，本研究利用Vanin-1基因敲除鼠建立I/R肾损伤模型，发现在I/R损伤后第3天，缺血再灌注组与敲除+缺血再灌注组血清肌酐、尿素氮水平无明显差异，PAS染色提示两组肾脏损伤严重程度无明显差异。但到I/R损伤后第14天，敲除+缺血再灌注组血清肌酐、尿素氮水平明显低于缺血再灌注组，PAS提示肾组织慢性化改变明显轻于缺血再灌注组，证明基因敲除Vanin-1可促进I/R损伤后肾脏结构和功能恢复。
Vanin-1是一种在肾、肺、肝脏等组织广泛表达泛酰巯基乙胺酶[1-2]，在机体氧化应激反应中发挥着重要的调节作用[9]。目前已有动物实验证实：线粒体功能失调在I/R肾损伤后的9个月里持续存在，功能失调的线粒体可持续产生过量的活性氧，过量ROS产生可导致氧化应激损伤，予以线粒体保护剂可减少ROS产生，减轻氧化应激损伤，进而明显减轻AKI后的间质炎症水平、间质纤维化等[3]，提示氧化应激损伤在I/R肾脏损伤后持续存在，且促进了AKI向CKD的进展。既往研究报道Vanin-1是调节氧化应激损伤的关键分子[2]。为进一步明确Vanin-1是否可调控I/R后的肾脏结构和功能恢复，本研究利用Vanin-1基因敲除和野生型小鼠同时建立I/R肾损伤模型，于造模后第3、14天检测肾脏功能及组织损伤严重程度，发现在第3天，缺血再灌注组与敲除+缺血再灌注组肾脏功能和组织损伤严重程度无明显差异，但到第14天，Vanin-1基因敲除鼠肾脏结构和功能损伤较野生型明显降低，提示基因敲除Vanin-1可促进肾脏结构和功能恢复。
有研究报道：Vanin-1可通过减少还原性谷胱甘肽导致ROS产生增多，进而通过脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛(4-hydroxy-2, 3-nonenal，HNE)上调TGF-β的表达[10]。而I/R损伤后肾组织TGF-β表达明显上调[11]，TGF-β是导致肾小球、肾小管间质纤维化的重要致病因素[14]，进而导致正常肾组织结构消失，最终进展为终末期肾脏疾病。为了进一步明确Vanin-1是否也可以通过上调I/R损伤后TGF-β水平延缓肾脏结构和功能恢复，本研究检测各组小鼠尿液中TGF-β水平，发现Vanin-1基因敲除鼠尿中TGF-β水平明显降低，提示Vanin-1可能是通过调控TGF-β分泌调控肾脏结构和功能恢复。在此基础上，本研究细胞实验结果显示：基因敲除Vanin-1可显著降低细胞上清TGF-β表达水平，证明Vanin-1可通过促进肾脏TGF-β表达，延缓肾脏功能恢复。
综上所述，本研究结果提示Vanin-1可通过促进肾小管上皮细胞TGF-β分泌，延缓I/R后肾脏功能恢复。应用Vanin-1抑制剂有望成为预防AKI向CKD进展的有效治疗措施。
| [1] |
SATO Y, TAKAHASHI M, YANAGITA M. Pathophysiology of AKI to CKD progression[J]. Semin Nephrol, 2020, 40(2): 206-215. DOI:10.1016/j.semnephrol.2020.01.011 |
| [2] |
CHEN S Y, ZHANG W X, SUN C, et al. Systemic nanoparticle-mediated delivery of pantetheinase vanin-1 regulates lipolysis and adiposity in abdominal white adipose tissue[J]. Adv Sci, 2020, 7(14): 2000542. DOI:10.1002/advs.202000542 |
| [3] |
BERRUYER C, MARTIN F M, CASTELLANO R, et al. Vanin-1-/- mice exhibit a glutathione-mediated tissue resistance to oxidative stress[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(16): 7214-7224. DOI:10.1128/MCB.24.16.7214-7224.2004 |
| [4] |
SZETO H H, LIU S Y, SOONG Y, et al. Mitochondria protection after acute ischemia prevents prolonged upregulation of IL-1β and IL-18 and arrests CKD[J]. J Am Soc Nephrol, 2017, 28(5): 1437-1449. DOI:10.1681/asn.2016070761 |
| [5] |
CHEN K H, CHEN J, WANG L, et al. Parkin ubiquitinates GATA4 and attenuates the GATA4/GAS1 signaling and detrimental effects on diabetic nephropathy[J]. FASEB J, 2020, 34(7): 8858-8875. DOI:10.1096/fj.202000053r |
| [6] |
CHEN J C, CHEN J K, HARRIS R C. Deletion of the epidermal growth factor receptor in renal proximal tubule epithelial cells delays recovery from acute kidney injury[J]. Kidney Int, 2012, 82(1): 45-52. DOI:10.1038/ki.2012.43 |
| [7] |
GRGIC I, CAMPANHOLLE G, BIJOL V, et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis[J]. Kidney Int, 2012, 82(2): 172-183. DOI:10.1038/ki.2012.20 |
| [8] |
CHEN J, CHEN K H, FU B Q, et al. Isolation and identification of senescent renal tubular epithelial cells using immunomagnetic beads based on DcR2[J]. Exp Gerontol, 2017, 95: 116-127. DOI:10.1016/j.exger.2017.04.008 |
| [9] |
PITARI G, MALERGUE F, MARTIN F, et al. Pantetheinase activity of membrane-bound Vanin-1: lack of free cysteamine in tissues of Vanin-1 deficient mice[J]. FEBS Lett, 2000, 483(2/3): 149-154. DOI:10.1016/s0014-5793(00)02110-4 |
| [10] |
LENARDUZZI G, SCAVAZZA A, BIASI F, et al. The lipid peroxidation end product 4-hydroxy-2, 3-nonenal up-regulates transforming growth factor beta1 expression in the macrophage lineage: a link between oxidative injury and fibrosclerosis[J]. Faseb J, 1997, 11(11): 851-857. DOI:10.1111/j.1432-1033.1997.00602.x |
| [11] |
ZHOU C, LIU J, GE Y, et al. Remote ischemic preconditioning ameliorates renal fibrosis after ischemia-reperfusion injury via transforming growth factor beta1 (TGF-β1) signalling pathway in rats[J]. Med Sci Monit, 2020, 26. DOI:10.12659/MSM.919185 |