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肠道病毒D68型感染前后转录组分析及差异表达基因的验证
唐霞, 司俊卓, 卢楠, 何永林, 徐蕾, 包嘉佳, 唐佳玲, 杨春     
400016 重庆,重庆医科大学基础医学院病原微生物学教研室
[摘要] 目的 探讨肠道病毒D68型(enterovirus D68, EV-D68)感染前后宿主细胞转录组的表达变化,寻找与EV-D68感染的相关基因及信号通路,为初步探索EV-D68的感染机制奠定基础。方法 将病毒以感染复数(multiplicity of infection,MOI)0.01接种于人横纹肌瘤(rhabdomyosarcoma, RD)细胞,24 h后提取感染组和对照组细胞总RNA进行转录组测序,筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),对其进行GO和KEGG富集分析,并用RT-qPCR验证8个主要差异表达的基因(EGR1、c-fosZNF625、ARRDC3、c-junASNSCHAC1、ADM2)。结果 从测序结果中共筛选出差异表达两倍以上的基因140个,其中上调基因71个,下调基因69个。GO功能富集分析结果主要涉及离子的调控与应答;KEGG富集分析结果主要与甲状旁腺激素的合成分泌和作用、GnRH信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路和MAPK信号通路等有关。RT-qPCR验证结果表明选取的8个基因上调或下调的差异表达倍数趋势与测序结果基本一致,c-fosc-jun的表达量随病毒MOI及感染时长的增加而增加。结论 通过对差异表达基因的功能和信号通路富集分析及验证,EV-D68加重哮喘的机制可能与c-fos上调有关;而MAPK信号通路可能在EV-D68感染期间发挥促炎作用和抗病毒作用。
[关键词] EV-D68    转录组测序    差异表达基因    
Transcriptome analysis and verification of differentially expressed genes before and after enterovirus D68 infection
TANG Xia, SI Junzhuo, LU Nan, HE Yonglin, XU Lei, BAO Jiajia, TANG Jialing, YANG Chun     
Department of Microbiology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
[Abstract] Objective To detect the alterations of the transcriptome in host cells infected by enterovirus D68 (EV-D68) and look for the genes involved in its infection so as to lay a foundation for the preliminary exploration of the infection mechanism. Methods The virus was inoculated into human rhabdomyosarcoma (RD) cells at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01. After 24 h, RNA was extracted from the infected RD cells and control cells for transcriptome sequencing. Differentially expressed genes (DEGs) were screened and analyzed by using Gene Ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis. Eight DEGs, EGR1, c-fos, ZNF625, ARRDC3, c-jun, ASNS, CHAC1 and ADM2 were validated by RT-qPCR. Results A total of 140 genes with at least 2-fold changes at expression level were identified from the sequencing results, of which 71 were up-regulated and 69 were down-regulated. The results of GO functional enrichment analysis mainly involved the regulation and response to ions while the results of KEGG enrichment analysis mainly related to parathyroid hormone synthesis, secretion and action, IL-17 and GnRH signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, and MAPK signaling pathway and so on. The RT-qPCR results showed that the trend of fold change of expression in the selected 8 genes was basically consistent with the sequencing results, and the expression levels of c-fos and c-jun were increased with the increase of virus MOI and infection duration. Conclusion By validating and using the functional and enrichment analysis, we infer that the mechanism of EV-D68 exacerbating asthma may be related to the up-regulation of c-fos, and MAPK signaling pathway may play a pro-inflammatory and antiviral role during EV-D68 infection.
[Key words] EV-D68    transcriptome sequencing    differentially expressed genes    

肠道病毒D68型(enterovirus D68, EV-D68)是一种小RNA病毒,原名为鼻病毒87型,后归于肠道病毒属D组,多感染儿童,最早于1962年在美国加利福尼亚地区的4名呼吸道感染患儿呼吸道标本中被分离出[1]。在被发现之后的几十年里EV-D68感染病例散发且鲜有报道,一直被认为是一种边缘性病原体而不受关注。2014年美国出现了一次EV-D68的大流行,共有1 153人被感染并多伴有严重的呼吸道症状[2],后来的许多回顾性研究表明,在同一时期欧洲也存在很高的EV-D68感染率[3],此后EV-D68才逐渐被引起重视。

目前关于EV-D68的研究多集中在流行病学,其生物学特征及其致病机理尚不完全清楚,与其他肠道病毒不同,EV-D68主要引起呼吸系统疾病,严重者可出现呼吸困难、血氧不足等情况[4]。有研究表明EV-D68的感染与哮喘发病率有密切联系[5]。此外EV-D68也会导致中枢神经系统疾病急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎(acute flaccid myelitis,AFM)的发生,严重危害公众健康[6]。但目前还没有针对EV-D68的有效抗病毒药物和疫苗。本研究通过对感染EV-D68前后的宿主细胞进行转录组测序,分析验证转录组表达谱差异,寻找参与感染发生的相关基因及其信号通路的作用等,为进一步探讨其致病机制打下基础。

1 材料与方法 1.1 细胞培养与病毒感染

人横纹肌瘤(rhahdomyoma, RD)细胞购于北纳生物;EV-D68选用原始Fermon毒株, 由本实验室保存。将RD细胞培养在含10%胎牛血清(Hyclone)和1%青-链霉素(碧云天)的DMEM细胞培养基(Hyclone)中。在37 ℃和5% CO2的条件下培养至细胞融合度达80%~90%时,再将培养基更换为含2%血清的培养基。然后将病毒接种到RD细胞中,感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.01,对照组不加病毒,每组3个生物重复,24 h后收获细胞。

1.2 RNA抽提

根据说明书,使用TRIzol试剂(Invitrogen)从每组细胞中提取总RNA,去除基因组DNA,在测序之前,使用1%琼脂糖凝胶电泳、2100 Bioanalyser (Agilent)及ND-2000 (NanoDrop Technologies)检测RNA的浓度和完整性。D(260)/D(280)=1.8~2.2,D(260)/D(230)≥2.0,RIN≥7,28S:18S≥1.0,总量>2 μg为合格样本。

1.3 文库构建及测序

按照说明书使用TruSeqTM RNA(Illumina, San Diego, CA)试剂盒,加入1 μg总RNA进行文库构建。首先,通过带有oligo(dT)的磁珠从总RNA中富集带有poly-A尾的mRNA,然后通过片段化缓冲液进行片段化,再使用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen, CA)试剂盒和随机引物(Illumina)合成双链cDNA。随后根据Illumina的文库构建方案对合成的cDNA进行末端修复,并在3′末端加上一个A碱基。使用Phusion DNA聚合酶(NEB)进行PCR扩增15个PCR循环后筛选出大小为200~300 bp的条带,用TBS380定量后,使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000测序仪(2×150 bp读取长度)进行测序。

1.4 测序数据的处理与分析

1.4.1 原始数据质控及序列比对分析

使用软件SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)对原始测序数据进行质控(quality control, QC),QC包括去除reads中的接头序列和没有插入片段的reads;去除3′端质量值< 20和剩余序列中质量值< 10的碱基;去除含模块碱基的reads以及舍弃去adapter及质量修剪后长度 < 30 bp的序列。质控完成后再使用HISAT2软件,将质控后的原始数据与人类参考基因组GRCh38进行比对,获得用于后续转录本组装、表达量计算等的mapped reads,比对完成后对该次转录组测序的比对结果进行质量评估。

1.4.2 表达量差异分析及GO、KEGG富集分析

使用表达定量软件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)对基因的表达水平进行定量分析,并采用对基因长度和测序深度进行了均一化的TPM(Transcripts Per Million reads)作为定量指标,使得不同样本中的总表达量一致,可更直观地比较基因间表达量。使用基于负二项分布的DESeq2软件对标准化后的数据进行分析,以P<0.05且|log2FC| ≥1为标准筛选出差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。

筛选完成后再对DEGs进行GO和KEGG途径富集分析。GO分析主要涵盖生物过程(biological process, BP),分子功能(molecular function, MF)和细胞成分(cellular component, CC)三个部分。KEGG可将差异表达基因按照参与的通路或行使的功能分类并统计。以P<0.05为标准进行功能富集分析。

1.5 RT-qPCR验证

从测序结果中随机选取8个TPM>5的差异表达基因进行RT-qPCR验证。其中上调基因包括EGR1、c-fosZNF625、ARRDC3、c-jun;下调基因包括ASNSCHAC1、ADM2。用RNA快速提取试剂盒(上海奕杉生物)分别提取对照组和EV-D68感染组细胞的总RNA,再使用反转录试剂盒(TaKaRa)将RNA反转录成cDNA。随后以此为模板根据SYBR Green PCR Master Mix(Bimake)试剂盒说明书进行RT-qPCR实验,每组3个生物重复。使用Oligo7软件根据选定基因的序列设计特异性引物并用NCBI Primer-BLAST和融解曲线对引物特异性进行评价,挑选出合格的引物进行实验(表 1)。实验采用β-actin为内参,使用2-ΔΔCt法对RT-qPCR结果进行分析,并与转录组测序结果相关基因表达量进行比较。

表 1 RT-qPCR引物序列
基因名称 引物序列(5′→ 3′) 扩增区域 产物大小/bp
EGR1 上游:AAGAAAAGCCAAGCAAACCAA 2430-3450 128
下游:AACGGAACAACACTCTGACAC 2557-2537
c-fos 上游:CCGGGGATAGCCTCTCTTACT 223-243 93
下游:CCAGGTCCGTGCAGAAGTC 315-297
ZNF625 上游:AGATTCCTAGAAGCCACCGAA 1304-1324 171
下游:CCCCAGCTAAACTACTCCCAA 1474-1454
ARRDC3 上游:AGCAGCATTTTGTTACTGACT 2266-2286 174
下游:ACTTTTGTGTATGTCCCGTTT 2439-2419
c-jun 上游:TCCAAGTGCCGAAAAAGGAAG 1776-1796 78
下游:CGAGTTCTGAGCTTTCAAGGT 1853-1833
ASNS 上游:GGAAGACAGCCCCGATTTACT 1265-1285 154
下游:AGCACGAACTGTTGTAATGTCA 1418-1397
CHAC1 上游:CCCAGCCATCCATAGCCCTG 1030-1049 78
下游:TCCTCATGCCCTACTATCCCT 1107-1087
ADM2 上游:CTGAGCCCCATCTGAAGCC 818-836 112
下游:CAGCACTGCGTGTAGACCAG 929-910
β-actin 上游:CATTGCCGACAGGATGCAG 1008-1026 92
下游:CGGAGTACTTGCGCTCAGGA 1099-1080

1.6 统计学分析

实验数据使用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析,计量资料用x±s表示。

2 结果 2.1 转录组测序数据统计

各样本测序获得总读数(raw reads)有44 509 264~65 693 118个,经过质控后剩余的读数(clean reads)有4 316 446~64 996 826个;clean reads中Q30碱基百分比均≥91.15%,测序错误率控制在0.03%以内;所有样本碱基的质量得分均为37,且GC碱基所占比例均≥48.13%.质控完成后将clean reads与人类参考基因组GRCh38进行序列比对(表 2),比对结果显示,各样本的reads与参考基因组的比对率在91.99%~96.66%。

表 2 测序样本与指定参考基因组的序列比对结果[序列数(%)]
样本名称(Sample) 总序列数(Raw reads) 质控后读数(Clean reads) 定位到基因组上的总序列数(Total mapped) 多个比对位置的序列数(Multiple mapped) 比对位置唯一的序列数(Uniquely mapped)
Infected1 44509264 43616446 40121712(91.99) 1285393(2.95) 38836319(89.04)
Infected2 57732532 57096208 53031046(92.88) 1770370(3.1) 51260676(89.78)
Infected3 56803892 56181770 52129282(92.79) 1724017(3.07) 50405265(89.72)
control1 55696854 55026242 52980860(96.28) 1811150(3.29) 51169710(92.99)
control2 62909056 62185334 59964147(96.43) 2088945(3.36) 57875202(93.07)
control3 65693118 64996826 62822701(96.66) 2127168(3.27) 60695533(93.38)

对比完成后,将比对到基因组上的reads分布情况进行统计(表 3),定位区域共有5个,分别为编码区(CDS)、内含子(intron)、基因间区(intergenic)和5′和3′非翻译区(UTR)。在人类参考基因组中,大部分的reads通常比对到CDS区,来源于pre-mRNA的残留或由可变剪切过程中发生的内含子保留事件导致的reads则会比对到intron区,而转录自新基因或新的非编码RNA的reads则会比对到intergenic区。

表 3 不同区域Reads的分布情况[序列数(%)]
样本名称 内含子区 3′非编码区 编码区 5′非编码区 基因间区
Infected1 3280097(5.54) 9170563(15.5) 43201662(73.02) 3106239(5.25) 405048(0.68)
Infected2 4304885(5.47) 11830199(15.04) 57858611(73.58) 4102487(5.22) 537301(0.68)
Infected3 4347575(5.63) 11643390(15.08) 56715571(73.46) 3956795(5.12) 547953(0.71)
control1 4510531(5.78) 11891302(15.23) 57023558(73.01) 4116075(5.27) 557367(0.71)
control2 5117151(5.77) 13141050(14.81) 65146309(73.4) 4709327(5.31) 641421(0.72)
control3 4893303(5.23) 13626435(14.55) 69606105(74.34) 4889271(5.22) 614510(0.66)

2.2 RT-qPCR验证

为了确定转录组测序结果的可靠性,本研究选取了8个基因进行RT-qPCR验证(EGR1、c-fosZNF625、ARRDC3、c-junASNSCHAC1、ADM2),并与转录组测序结果进行比较。RT-qPCR实验结果表明(图 12),选取的8个基因中上调或下调的差异表达倍数趋势与测序结果基本一致,说明测序结果是可信的。

a:P<0.01,b:P<0.001,与control比较A:上调基因验证结果;B:下调基因验证结果 图 1 RT-qPCR验证转录组结果(n=6, x±s)

A:上调基因比较结果;B:下调基因比较结果 图 2 RT-qPCR验证结果与转录组测序结果比较

2.3 差异表达基因统计及GO、KEGG富集分析

数据经过定量且标准化处理后筛选出|log2FC| ≥1的DEGs共140个,其中上调基因71个,下调基因69个(图 3)。为进一步研究这些DEGs的生物学功能,对其分别进行GO与KEGG富集分析。在GO富集分析中,显著富集到420个GO terms,其中311个涉及BP,28个涉及CC,89个涉及MF。显著富集的前20位中,18项属于BP类,其中9个与离子的调控和应答有关,其次主要富集在血管生成负调控、细胞对ATP的应答、骨骼肌分化、内动力蛋白臂组装等方面。其余2项属于MF类,分别是R-SMAD结合及氨酰基-tRNA编辑活性(图 4)。

图 3 差异表达基因火山图

图 4 差异基因的GO富集分析

KEGG富集分析结果共富集到115条,包括代谢(metabolize, M)、遗传信息处理(genetic Information processing, GIP)、环境信息处理(environmental information processing, EIP)、细胞过程(cellular processes, CP),生物体系统(biological system, OS)、人类疾病(human diseases, HD)等6大类。其中26条显著富集,包括甲状旁腺激素的合成分泌和作用、黑色素生成、松弛素信号通路、催乳素信号通路、矿物质吸收、GnRH信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、内分泌抵抗、MAPK信号通路等(图 56)。

红色框为上调基因,黑色框为下调基因 图 5 差异基因的KEGG富集分析

图 6 MAPK信号通路中差异表达的基因

2.4 病毒感染对宿主细胞c-fosc-jun表达的影响

为寻找参与病毒感染的基因与信号通路,我们分别以MOI=0、MOI=0.01、MOI=0.1和MOI=1等4个病毒量梯度感染细胞24 h,再用RT-qPCR检测MAPK信号通路相关基因c-fosc-jun mRNA水平表达变化,结果发现c-fosc-jun的表达量随病毒量的增加而增加(图 7)。同时为了验证c-fosc-jun基因与病毒感染时间的相关性,我们以MOI=2感染细胞,并在0、6、12、18 h收获细胞提取RNA进行RT-qPCR实验,结果表明EV-D68感染细胞后,c-fosc-jun mRNA的表达量随时间的延长而增加(图 8)。为进一步验证这种上调趋势是否只存在于RD细胞中,我们以MOI=0、MOI=1、MOI=2的感染量作用于另一种EV-D68的易感细胞Hela细胞,检测c-fosc-jun mRNA表达水平,得到了相似的结果(图 9),说明EV-D68感染细胞后c-fosc-jun的调节作用在Hela细胞中同样存在。

a: P<0.01, b: P<0.001, 与control比较 图 7 不同MOI处理RD细胞后c-fos和c-jun mRNA表达情况(n=3, x±s)

a: P<0.01, b: P<0.001, 与control比较 图 8 病毒感染不同时间c-fos和c-jun mRNA表达情况(n=3, x±s)

b: P<0.001, 与control比较 图 9 不同MOI处理Hela细胞后c-fos和c-jun mRNA表达情况(n=3, x±s)

3 讨论

虽然EV-D68在1962年就被发现,但直到2014年才被重视。有不少研究证明,EV-D68的流行呈季节性且两年一爆发[7-11]。在我国EV-D68没有被纳入常规检测,临床上多数为对症治疗。有研究报道在我国北京、重庆、台湾等地,人群中均有较高滴度的中和抗体存在,且抗体阳性率随年龄的增长而升高[12-14]。EV-D68易感人群为儿童,感染后轻者与感冒无异,但重者需要重症监护治疗。

哮喘是一种常见的多发性的气道慢性变态反应性炎症。越来越多的研究证明因EV-D68感染而需住院的患者中很大一部分有哮喘病史,且入院原因也是哮喘加重。WANG等[15]通过统计分析发现,2018年美国俄亥俄州哥伦布市国家儿童医院总共有277例因EV-D68感染住院的患者,其中有146名(53%)曾患有哮喘史;DREWS等[16]和MERTZ等[17]研究报告中指出住院的EV-D68感染儿童中有31%~70%有哮喘病史,而在我国台湾也有类似的报道[18];还有文献称在74.3%的哮喘发作患者的鼻咽样本中检测到EV-D68[19]。EV-D68能加重哮喘或使有哮喘病史的患者复发,其机制尚不完全清楚。

目前还未见有EV-D68感染宿主细胞后转录组表达谱差异分析的报道。RD细胞是EV-D68、EV71等新型肠道病毒感染的高效细胞[20-21],也是研究EV-D68、EV71等新型肠道病毒常用的经典细胞。在本研究中,通过对EV-D68感染前后的RD细胞进行转录组测序,筛选差异表达基因并对其进行GO和KEGG富集分析。在对测序结果的分析中,我们注意到一个特殊的基因c-fos,它在EV-D68感染后是显著上调的,通过查阅文献我们发现它与哮喘有密切联系。c-fos

一种原癌基因,与细胞的生长、增殖活化有关,在正常人类细胞中可检测到极低水平的表达。DEMOLY等[22]在1992年第一次指出c-fos在哮喘患者支气管活检气道上皮中表达升高,在随后的研究中又发现c-fos的阳性反应程度与上皮细胞脱落程度成正比;LIU[23]等研究发现在大鼠肺中,c-fos蛋白的光密度与支气管肺泡灌洗液中P物质的浓度呈正相关,与血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)的浓度呈负相关,说明c-fos蛋白表达和神经肽含量与哮喘发作有关。而c-fos在哮喘患者中表达升高不止体现在呼吸系统的组织中,也有研究表明,当哮喘模型动物被致敏,中枢系统的多个区域c-fos的表达增加[24-26]。而在我们的研究中,通过RT-qPCR证实c-fos在EV-D68感染后表达上调,且表达量随病毒MOI的增加和感染时间的延长而增加。结合测序结果和RT-qPCR验证结果我们猜想EV-D68加重哮喘的机制有可能和上调c-fos有关,在接下来的实验中,我们将进一步进行探索。

除此之外,在KEGG富集分析结果中,我们重点关注到MAPK信号通路,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它在真核生物中广泛存在,MAPK信号通路是细胞增殖、应激、炎症、分化、功能同步化、转化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一,与病毒感染相关的MAPK信号通路主要有3种,包括ERK、p38和JNK。MAPK信号通路的激活在肠道病毒71型、单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒B3等都有报道[27-29]。此外,许多MAPK调节的促炎或抗病毒细胞因子(如IL-2,IL-6,IFN-β和TNF-α)的转录取决于转录因子NF-κB,c-fos和c-jun[30-32]。而在我们的结果中,富集到的MAPK通路中有6个基因有显著差异,包括c-fosc-junGFCADD45、MEK1、pp5(图 6)。除c-fos外,c-jun的表达量也随病毒MOI的增加和感染时间的延长而增加,所以我们推断,MAPK通路有可能在EV-D68感染期间发挥促炎作用和抗病毒作用,在后续实验中我们也将进一步对其进行验证。

虽然现在EV-D68逐渐引起重视,但关于其致病机制的研究却比较少,而且目前也没有预防和治疗EV-D68感染的特效药物和疫苗。本研究通过对EV-D68感染前后的宿主细胞进行转录组测序,一共发现了140个差异表达基因,并对其进行GO和KEGG富集分析,重点关注到可能参与哮喘发病机制的c-fos基因,及可能在EV-D68感染期间发挥促炎作用和抗病毒作用的MAPK信号通路,在后期实验中,我们将对以上重点关注基因的功能进行深入的探讨,为EV-D68的感染机制研究奠定实验基础。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.202009104
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

唐霞, 司俊卓, 卢楠, 何永林, 徐蕾, 包嘉佳, 唐佳玲, 杨春
TANG Xia, SI Junzhuo, LU Nan, HE Yonglin, XU Lei, BAO Jiajia, TANG Jialing, YANG Chun
肠道病毒D68型感染前后转录组分析及差异表达基因的验证
Transcriptome analysis and verification of differentially expressed genes before and after enterovirus D68 infection
第三军医大学学报, 2021, 43(4): 275-282
Journal of Third Military Medical University, 2021, 43(4): 275-282
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.202009104

文章历史

收稿: 2020-09-13
修回: 2020-11-25

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