表1(Table 1)
BCAR1是目前肿瘤研究的热点，其相对分子质量为130×103，是细胞外基质与胞内信号传导的桥梁分子：细胞与胞外基质接触后激活整合素→FAK激活并结合到BCAR1氨基端→磷酸化BCAR1羟基端→BCAR1与Src激酶结合→BCAR1活化→形成BCAR1/Crk复合体→Crk通路被激活[1-2]。
研究表明，BCAR1高表达与多种癌症的细胞侵袭和转移相关：在前列腺癌中，BCAR1的高表达与肿瘤早期复发密切相关[3]。在子宫内膜腺癌中，BCAR1参与肿瘤细胞的生长和转移[4]。在口腔鳞癌中，BCAR1通过调节上皮-间质转化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)和细胞增殖促进骨侵袭和转移[5]。我们前期研究发现：BCAR1在肺癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达[6-7]；开展的多中心临床研究证实肺癌BCAR1-mRNA及蛋白表达水平越高，患者预后越差[7]。而且，BCAR1高表达可诱导肺腺癌细胞发生EMT促进肺腺癌细胞迁移和侵袭[8-9]。所以，BCAR1有望成为肺癌精准治疗的分子靶点[10]。
目前BCAR1研究多局限于肿瘤侵袭转移，较少聚焦细胞增殖和克隆形成。鉴于BCAR1基因促癌效应复杂，其相互作用蛋白研究较少，相关通路和网络尚不明确。本研究拟通过下调及上调BCAR1的表达及免疫共沉淀质谱分析，旨在深入探索上述问题。
1 材料与方法 1.1 材料GV371载体，Cas9载体，CV146载体，GV141载体(均来自吉凯基因)，H1975、H1299、A549、293T(ATCC)，胎牛血清(Gibco, 10099141)，胰酶(Gibco, 25200-056)，BCAR1(CST，#13846)，GAPDH(CST，#2118s)，MLST8(CST，#3227)，Rabbit IgG(Santa Cruz，sc-2004)，嘌呤霉素(Clontech，631305)，MTT(Solarbio，M8180)，dsDNA oligo(吉凯基因，P212-03)，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme，M0318S)，TOP10感受态(吉凯基因，R0539L)，BbsI(sigma，D0281-59)，T7 DNA Ligase(sigma，D4041)，ATP(10 μmol/L)(Takara，DP11)，Yeast Extract(OXOID)，Agar Powder(OXOID，A-2180)，Trizol试剂盒(上海普飞)，1 kp DNA ladder Marker(Fermentas，#SM0311)，250 bp DNA ladder Marker(捷瑞，DL250+, 100T)，In-FusionTM PCR Cloning Kit(clontech，639626)，Taq polymerase(SinoBio，E001-02B)，dNTP(Takara，D4030A)，Primer(捷瑞生物)，限制性内切酶(NEB)，Plasmid抽提Kit(Promega，A1460)，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，06336236001)等。
1.2 病例来源该研究方案经陆军军医大学大坪医院[TMMU-DPH]的研究伦理委员会审查和批准(2019-183)，获得患者同意并签署知情同意书。收集胸外科2016年9月至2019年4月影像学诊断并经病理证实的早期肺腺癌患者54例，排除接受过治疗、患有重大基础疾病或其他恶性肿瘤患者，基线特征见表 1。获取54例蜡块癌组织，15对新鲜癌组织及远癌组织进行后续试验。
| 病例参数 | 统计量 |
| 男:女/例 | 24:30 |
| 年龄/岁 | 60.4±9.1 |
| 肿瘤大小/cm | 2.3±0.7 |
| 分期(1a:1b)/例 | 46:8 |
| 生存时间/d | 582.5±385.9 |
1.3 方法 1.3.1 western blot实验
研磨裂解组织细胞或提取细胞蛋白后BCA法测蛋白浓度，电泳，转膜，相应一抗1 :1 000稀释，孵二抗，ECL显影曝光，Image J软件(1.52a version.USA)进行蛋白条带半定量分析。
1.3.2 组织芯片制作及IHC实验步骤详见文献[8]。将前述54例肺癌样本制作组织芯片，进行BCAR1(1 :50)及MLST8(1 :50)染色。Image J软件计算染色芯片平均光密度，进行相关性分析。
1.3.3 构建人肺腺癌细胞H1975、H1299 BCAR-KO稳定株CRISPR/Cas9实验方案参见文献[11]，简述如下：首先将CAS9载体(图 1A)转染H1975及H1299细胞，并通过2 μg/mL嘌呤霉素成功筛选H1975-CAS9及H1299-CAS9稳定株。依据GenBank ID(NM_001170714)的BCAR1序列设计BCAR1-sgRNA及阴性对照CON244-sgRNA干扰靶点序列(表 2)，引物退火形成双链DNA，连入sgRNA载体GV371(图 1A)，TOP10感受态转化，菌落PCR得到阳性克隆后测序鉴定。再将sgRNA慢病毒质粒转染H1975-CAS9、H1299-CAS9稳定细胞株，通过荧光鉴定构建的BCAR1-KO稳定细胞株后western blot验证BCAR1敲除效果。
|
| A:载图谱体; B：早期肺腺癌及癌旁组织BCAR1表达，a: P < 0.05, 与癌旁组织比较；C：IHC示BCAR1表达；D：GEPIA数据库肺腺癌患者BCAR1生存分析；E：western blot验证肺腺癌细胞株BCAR1敲除与过表达，a: P < 0.05；b: P < 0.01，与NC组比较 图 1 肺腺癌患者BCAR1表达、预后分析及人肺腺癌细胞系BCAR1敲除与过表达构建 |
| 序号 | 序列5′-3′ |
| BCAR1-sgRNA-a | CACCgCAGCAACGGGTCTCGGCCAT |
| BCAR1-sgRNA-b | aaac ATGGCCGAGACCCGTTGCTGc |
1.3.4 构建人肺腺癌细胞A549 BCAR1-OE稳定株
根据GenBank ID(NM_001170714)的BCAR1基因序列设计引物如表 3，进行PCR扩增目的基因片段，PCR产物插入酶切载体CV146(图 1A)后进行转化，PCR法鉴定菌落并扩增抽提质粒。转染细胞后嘌呤霉素2 μg/mL药筛阳性细胞并扩增，western blot验证BCAR1过表达效果。
| 引物序号 | 序列 |
| BCAR1(45429-1)-P1 | AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGCCTGCCAAGCCCTTCCTCTCTTCTG |
| BCAR1(45429-1)-P2 | CACAGGCTAGCTCAACCGGTTCAGGCGGCTGCCAGCTGGCCTAGGACGCGG |
1.3.5 MTT实验
0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，按分组5 000/孔于96孔板接种，接种后0、24、48、72 h每孔加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL)，培养4 h，加入150 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪490 nm测各孔吸光度值。
1.3.6 细胞平板克隆形成实验0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，按分组1 000/皿(10 cm)铺板，37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至肉眼可见明显的细胞克隆形成，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.25%结晶紫染色细胞15 min，晾干，拍照，Image J软件分析。
1.3.7 IP-MS实验依据BCAR1基因序列设计引物(表 4)钓取BCAR1，PCR扩增目的基因片段，产物与酶切载体GV141连接反应(图 1A)，构建BCAR1过表达质粒并鉴定，质粒抽提，X-tremeGENE与过表达质粒以1 :1比例混合，转染293T细胞，24 h后换液，加入200 μg/mL G418进行药筛5 d获得293T细胞BCAR1过表达细胞株。提取细胞蛋白，BCA法测浓度，Shotgun法进行质谱分析，主要步骤如下：FASP酶解，QExactive质谱仪进行质谱分析，质谱文件转换获得数据。步骤详见文献[12]，将获得的BCAR1-NC组蛋白与BCAR1-OE组蛋白进行比对分析。
| 引物序号 | 序列 |
| BCAR1(55742-1)-P1 | ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGCCTGCCAAGCCCTTCCTCTCTTC |
| BCAR1(55742-1)-P2 | AGTCACTTAAGCTTGGTACCGAGGCGGCTGCCAGCTGGCCTAGGAC |
1.3.8 生物信息学分析
TCGA数据库(https://www.cancer.gov/)查询与BCAR1表达显著正相关的基因。搜索限制条件：癌症类型：肺腺癌；位置：支气管、肺；分期：Stage ia，Stage ib；数据库选择：TCGA-LUAD；数据类型：Gene Expression Quantification；方法：RNA-Seq。选取FDR值< 10-6的BCAR1正相关基因与IP-MS结果比对分析，获取BCAR1互作蛋白。
将获得的基因输入PPI String数据库(https://string-db.org/)进行BCAR1信号通路分析，生成拥有多个节点的基因BCAR1信号通路图。
利用GEPIA在线工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)对肺癌患者BCAR1基因进行生存分析，验证BCAR1与预后的关系；并获取的基因进行基因差异表达筛选，选取癌组织较癌旁组织显著高表达的基因研究。
1.4 统计学方法采用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行数据分析，统计数据以x±s形式表示，计量资料两样本比较使用独立t检验，相关性分析采用两变量相关分析，生存分析采用单因素cox回归模型，P < 0.05(双侧)具有统计学意义。
2 结果 2.1 肺腺癌组织中, BCAR1高表达预后不良如图 1B，western blot示相比癌旁组织，肺腺癌组织中BCAR1显著高表达(P < 0.05)；如图 1C, IHC示BCAR1在肺癌细胞质及细胞核中均有表达，BCAR1高表达患者预后差(HR=5.026，P=0.001, 95%CI: 1.948~12.963)，如图 1D示，TCGA数据库生存分析亦验证了肺癌患者BCAR1高表达其预后差(HR=1.5，P=0.008 7)。
2.2 人肺腺癌细胞H1975、H1299 BCAR1-KO以及A549BCAR1-OE稳定细胞株成功构建如图 1E，在H1975细胞株及H299中，BCAR1蛋白相对表达水平KO组细胞较NC组分别降低43.43% (P < 0.01)与33.57%(P < 0.05)；在A549细胞株中，BCAR1蛋白相对表达OE组较NC组增加1.55倍(P < 0.05)。
2.3 肺癌细胞增殖能力BCAR1-KO后降低，而BCAR1-OE后升高如图 2，在H1975细胞株中，在24、72 h，KO组细胞增殖较NC组均显著降低(P < 0.000 1，P < 0.000 1)；在H1299细胞株中，72 h KO组细胞增殖较NC组显著降低(P < 0.000 1)；在A549细胞株中，在24、48、72 h，OE组细胞增殖较NC组均显著增加(P < 0.000 1，P < 0.001，P < 0.000 1)。
|
| A：H1975；B：H1299；C：A549，a: P < 0.01；b: P < 0.001，与NC组比较 图 2 肺腺癌细胞系BCAR1敲除或过表达对细胞增殖的影响 |
2.4 细胞克隆形成率BCAR1-KO后降低，而BCAR1-OE后升高
如图 3，在H1975细胞株中，细胞克隆形成率KO组细胞较NC组显著降低(P < 0.000 1)；但在H1299细胞株中，趋势尚不明显(P>0.05)；在A549细胞株中，细胞克隆形成率OE组细胞较NC组细胞显著增加(P < 0.000 1)。
|
| A:细胞克隆形成结晶紫染色结果；B：细胞克隆形成率的比较, a: P < 0.001，与NC组比较；C：293T细胞BCAR1表达western blot验证, a: P < 0.001, 与NC组比较；D：免疫共沉淀质谱分析揭示419个潜在BCAR1作用蛋白; E：TCGA数据库揭示68个潜在BCAR1相互作用蛋白; F：PPI String数据库BCAR1互作蛋白网络分析 图 3 肺腺癌细胞系BCAR1敲除或过表达对克隆形成的影响及BCAR1的互作蛋白网络研究 |
2.5 IP-MS联合生信分析发现MSLT8为BCAR1的关键互作用蛋白
成功构建293T BCAR1过表达细胞株，BCAR1蛋白相对表达水平OE组细胞较NC组显著高表达(P < 0.001，图 3)；并且IP-MS实验在293T细胞BCAR1-NC组获得2 813个蛋白(与标签蛋白互相作用)，在BCAR1-OE组获得2 713个蛋白(与标签蛋白及BCAR1互相作用，表 5)。比对分析后得到419个蛋白(图 3)仅表达于BCAR1-OE组的潜在BCAR1互作蛋白通过TCGA数据库，得到2 479个与BCAR1表达显著正相关的基因比对分析后获得68个可能与BCAR1相互作用的基因(图 3)。
| 数据库 | 样品 类型 |
总肽段 数目 |
匹配到肽段的 质谱图谱总数 |
肽段数 | 蛋白 数目 |
| 人 | 293T-NC | 29 387 | 17 587 | 13 604 | 2 813 |
| 人 | 293T-OE | 28 021 | 15 823 | 12 884 | 2 713 |
通过PPI String数据库，从68个基因中获得18个拥有多节点的基因，获得信号通路图(图 3)。
GEPIA数据库的差异基因筛选显示，MSLT8，TAF7，GNB1L，PTGES2，DHX37这5个基因在癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(图 4A)。图 3显示MLST8与BCAR1共同连接MAPK3。而我们的前期研究证实，BCAR1是参与MAPK信号通路的衔接蛋白[8]，因此以MSLT8为重点进行后续验证。
|
| A: GEPIA数据库差异基因表达筛选；B：western blot证实MLST8在肺腺癌组织显著高表达于癌旁正常组织, a: P < 0.05，与癌旁组织比较; C：IHC分析MLST8在肺腺癌组织中的表达情况; D：IHC检验BCAR1与MLST8的相关性; E：BCAR1敲除或过表达前后肺腺癌细胞株验证MLST8的表达情况，a: P < 0.01；b: P < 0.001, 与NC组比较 图 4 临床样本组织和细胞水平验证BCAR1与MLST8的表达关系 |
2.6 在肺癌细胞及组织中MLST8与BCAR1表达密切相关
如图 4B，在肺腺癌组织中，MLST8表达癌组织较癌旁组织显著高表达(P < 0.000 1)；如图 4C，IHC示MLST8主要表达于细胞质；如图 4D，BCAR1与MLST8相关性分析显示BCAR1与MLST8具有显著正相关性(R=0.422 1，P=0.001 5)。
2.7 细胞水平western blot验证BCAR1与MLST8表达关系如图 4E，在H1975, H1299人肺腺癌细胞株中，BCAR1-KO后MLST8蛋白表达显著降低(P < 0.001，P < 0.01)，在A549细胞株中，BCAR1-OE后MLST8蛋白表达显著增高(P < 0.01)。
3 讨论本研究发现，BCAR1在早期肺癌中亦高表达，且与预后不良密切相关，此结论与乳腺癌的研究结论类似[13]。研究揭示，BCAR1高表达与多种癌症的细胞增殖、存活密切相关[14]，特别在乳腺癌中报道较多，而对肺癌细胞增殖及细胞克隆形成的影响却鲜有关注。我们研究发现，在肺癌细胞株中敲除或过表达BCAR1，细胞增殖及克隆形成能力显著降低或增高。在H1299细胞株中，虽然BCAR1敲除未影响克隆形成，考虑与BCAR1在H1299中敲除效果稍差所致，亦有可能在不同细胞背景下，BCAR1生物学功能有所差异。结合A549细胞中BCAR1过表达后，细胞增殖与克隆形成显著增加，我们认为，BCAR1在肺癌的细胞增殖、存活与克隆形成上发挥着重要的作用。
通过IP-MS结合生信分析，我们找到了几个潜在BCAR1互作蛋白，MSLT8、TAF7、GNB1L、PTGES2、DHX37。这些基因在癌组织中表达显著高于正常组织。前期研究显示，磷酸化BCAR1羟基端使得BCAR1与Src激酶结合[15-16]，增强Src介导的p130cas和PI3K-AKT-mTOR信号级联反应，MMPs表达增加，促进肿瘤转移[17-18]。MLST8作为一类激酶，在基因注释上与BCAR1功能有很多相似之处。MLST8是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的结合蛋白，为激酶激活必不可少的一部分，由它们构成的复合物结构显示：MLST8可以稳定mTOR的活性位点，其表达水平上调激活mTORC1和mTORC2通路而促进肿瘤进展[19-20]。体外研究表明：PSMA与phospho-p130cas、phospho-c-Src中的FLNa结合，激活AKT/mTOR/BAD和MAPK途径，维持细胞的增殖和抗凋亡作用[21]。而我们从PPI String获得的信号通路中显示，BCAR1与MLST8紧邻着MAPK3相连接，而我们课题组前期研究证实BCAR1是参与MAPK信号通路的衔接蛋白[8]，故MLST8被作为BCAR1的关键互作蛋白进行研究。
本研究通过临床与细胞水平证实，BCAR1与MLST8显著相关，MLST8随着BCAR1的变化在细胞水平出现相应的趋势变化，在BCAR1敲除后低表达，在BCAR1过表达后高表达，揭示MLST8可能为BCAR1互作的下游调节蛋白。但是，BCAR1与MLST8发生作用的具体机制仍不清楚。下一步，我们将通过免疫共沉淀或Duolink PLA实验研究BCAR1与MLST8相互关系，以及调控MLST8对于BCAR1功能的影响。总之，BCAR1及MLST8有望成为肺癌治疗的新靶点。
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