肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生存和健康[1]。根据2018年全球癌症统计[2]，每年约84万人患肝癌, 死亡人数高达78万人，其中男性多见，约为女性患者的2~3倍。肝癌的治疗主要分为手术治疗、化疗、介入治疗等。由于大多数肝癌发病隐匿，通常出现临床症状时已达中晚期，发生转移从而失去了手术治疗的最佳时期。因此，化疗成为中晚期肝癌主要的治疗方式之一[3-4]。索拉非尼(Sorafenib)是一种多激酶抑制剂，同时也是一种新型多分子靶点化疗药，临床上多用于晚期恶性肿瘤，特别是肝癌的治疗。索拉非尼能平均延长肝癌晚期患者3个月生存期，但由于患者先天或获得性的耐药，通常用药不超过6个月即产生索拉非尼耐药[5]。因此，探讨肝癌细胞对索拉非尼的耐药机制以及增强索拉非尼对肝癌细胞的杀伤是提高肝癌患者生存期、降低肝癌患者病死率的关键。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性单链的非编码RNA小分子, 长度约为22 nt。miRNA可以与靶mRNA的3’UTR发生特异性的碱基互补配对，抑制靶基因的表达，从而在转录后水平发挥基因调控功能[6]。研究表明，miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要的调控作用，同时miRNA也参与肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗的过程[7-9]。miR-101-3p在多种癌症中呈现低表达水平，如肝癌[10]、胃癌[11]、鼻咽癌[12]、膀胱癌[13]、乳腺癌[14]等，并且miR-101-3p可通过调控下游靶mRNA的表达水平而促进肿瘤细胞的增殖迁移。但miR-101-3p是否参与肝癌对索拉非尼的耐药机制尚不明确。因此，本研究着重探讨miR-101-3p在HepG2细胞抵抗索拉非尼中发挥的作用及可能机制，并探讨相关增敏措施，旨在为提升索拉非尼的临床疗效提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌HepG2细胞株由本实验室保存。高糖DMEM培养基、胎牛血清和0.25%胰酶均购自Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、CCK-8试剂购自江苏碧云天公司；索拉非尼购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine3000购自Invitrogen公司；miR-101-3p模拟物(mimics)及其对照物(mimics NC)购自上海吉荧公司；EZH2 3’UTR双荧光素酶报告基因野生型和突变型质粒构建于上海吉玛公司；miR-101-3p、U6、EZH2以及GAPDH基因引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；总RNA提取试剂盒购自杭州博日公司；miRNA反转录试剂盒(Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit)购自美国Clontech公司；mRNA反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)和荧光定量PCR试剂盒[TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)]均购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Daul-Luciferase® Reporter Assay System)购自Promega公司；EZH2抗体购自Proteintech公司；GAPDH抗体、山羊抗兔二抗购自Bioworld technology公司；PVDF膜、ECL发光液、电泳凝胶试剂盒购自Bio-Rad公司；EZH2抑制剂(EPZ-6438)购自MedChemExpress公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中静置培养。每日对细胞进行换液，换液时用PBS缓冲液轻微冲洗3次，加入0.25%胰酶静置数分钟消化细胞，而后加入适量新鲜的10%胎牛血清培养基重悬细胞使其重新贴壁生长。待细胞进入对数生长期时便可进行加药或转染处理。
1.2.2 RNA提取及Real-time PCR检测基因表达水平HepG2细胞经索拉非尼处理24 h后弃去含药培养基，用PBS缓冲液冲洗3次。加入0.25%胰酶将细胞消化下来，再次加入含血清培养基中和胰酶并收集细胞悬液，离心收集细胞后按总RNA提取试剂盒步骤提取肝癌细胞的总RNA。采用Clontech公司miRNA反转试剂盒Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit将miRNA反转录为cDNA，作为Real-time PCR检测miR-101-3p表达水平的模板；采用mRNA反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser将mRNA反转录为cDNA，作为Real-time PCR检测EZH2 mRNA表达水平的模板。Real-time PCR检测试剂盒为TaKaRa公司生产的TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)，检测结果采用2-ΔΔCt法分析后作图。
1.2.3 双荧光素酶报告基因实验使用microRNA的靶标预测网站Starbase2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn)预测miR-101-3p的靶标基因及其结合位点。为验证miR-101-3p是否与EZH2的3’UTR区存在直接结合，进行双荧光素酶报告基因实验。EZH2野生型(WT)报告基因质粒中包含miR-101-3p的结合位点，而突变型(MUT)报告基因质粒中包含突变的miR-101-3p的结合位点。将HepG2细胞以1×104/孔接种于48孔板中，分别设置3个对照组以及1个实验组，每组设置3个复孔。对照组一转染0.2 μg野生型报告基因质粒和0.2 μg microRNA模拟对照物(NC mimics)；对照组二转染0.2 μg突变型报告基因质粒和0.2 μg microRNA模拟对照物(NC mimics)；对照组三转染0.2 μg突变型报告基因质粒和0.2 μg miR-101-3p模拟物(miR-101-3p mimics)；实验组转染0.2 μg野生型报告基因质粒和0.2 μg miR-101-3p模拟物(miR-101-3p mimics)。转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行测定。通过Fluc/Rluc比值反应miR-101-3p与EZH2的3’UTR区结合情况。
1.2.4 总蛋白提取及含量测定HepG2细胞以5×104/孔接种于6孔板中，分别设置对照组(NC mimics)和实验组(miR-101-3p mimics)。待细胞生长达到50%时，分别向对照组中转染模拟对照物(NC mimics)，实验组中转染miR-101-3p模拟物(miR-101-3p mimics)。处理24 h，弃去培养基，用PBS清洗细胞3次。每孔加入100 μL含1 mmol/L的RIPA裂解液，用细胞刮反复刮取贴壁细胞并置于冰上作用20 min。将裂解液移入1.5 mL EP管中，4 ℃、14 000×g离心5 min，收集上清于新的EP管中。使用BCA法对蛋白浓度进行测定并标定为统一浓度。
1.2.5 Western blot实验将定量变性后的蛋白质以每孔40 μg上样，在电泳凝胶中进行电泳分离。将分离后的目的蛋白转移到PVDF膜上，用含脱脂奶粉的PBST溶液封闭1 h。用PBST清洗3次，每次10 min，然后将膜分别放置于含对应抗体溶液中4 ℃隔夜孵育。一抗的稀释浓度为1 :1 000。将膜用PBST清洗3次后再用含山羊抗兔二抗的PBST溶液室温孵育1 h。PBST洗膜后，使用化学发光法在化学发光仪中显影曝光。
1.2.6 CCK-8检测细胞生存率 1.2.6.1 索拉非尼单用及联合miR-101-3p模拟物(mimics)检测HepG2细胞以5×103/孔接种于96孔板中，分别设置对照组、索拉非尼组、索拉非尼与miR-101-3p联用组，每组设置3个复孔。待细胞生长融合至50%时，分别向对照组中转染模拟对照物(NC mimics)，向索拉非尼与miR-101-3p联用组中转染miR-101-3p模拟物(mimics)。转染用量按照上海吉荧公司推荐使用。转染24 h后索拉非尼组和索拉非尼与miR-101-3p联用组均加入索拉非尼浓度为10 μmol/mL的培养基。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂于37 ℃恒温箱中避光孵育20 min，使用全波长酶标仪于450 nm波长下测定每孔的光密度值[D(450)]，计算每组的细胞存活率。
1.2.6.2 索拉非尼联合EZH2抑制剂(EPZ-6438)检测HepG2细胞以5×103/孔接种于96孔板中，分别设置对照组、索拉非尼组(10 μmol/mL)、EPZ-6438组(5 μmol/mL)、索拉非尼(10 μmol/mL)与EPZ-6438(5 μmol/mL)联合组，每组分别设置3个复孔。HepG2细胞分别接种于96孔板中，将细胞培养板置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜，后弃去原培养基，加入含索拉非尼和EPZ-6438的新鲜培养基。处理24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂于37 ℃恒温箱中避光孵育20 min，使用全波长酶标仪于450 nm波长下测定每孔的光密度值[D(450)]，计算每组的细胞存活率。
1.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 索拉非尼下调HepG2细胞中miR-101-3p的表达为明确索拉非尼处理对miR-101-3p表达的影响，采用Real-time PCR检测HepG2细胞经索拉非尼处理前后miR-101-3p的表达变化。10 μmol/mL索拉非尼处理24 h后，HepG2细胞中miR-101-3p基因表达量显著下调(0.645±0.081 vs. 1.000±0.031，P < 0.05)
2.2 过表达miR-101-3p增加HepG2细胞对索拉非尼的敏感性为明确miR-101-3p表达下调在HepG2细胞耐受索拉非尼中的意义，在HepG2细胞中过表达miR-101-3p后使用索拉非尼处理24 h，CCK-8实验结果表明，过表达miR-101-3p可显著增强HepG2对索拉非尼的敏感性(P < 0.05，图 1)
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| 1：对照组；2：索拉非尼组；3：miR-101-3p组；4：索拉非尼与miR-101-3p联用组a：P < 0.05，与索拉非尼组比较 图 1 上调miR-101-3p增加索拉非尼对HepG2细胞杀伤效果(n=3，x±s) |
2.3 miR-101-3p靶向抑制EZH2的表达
利用生物信息学网站Starbase 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测miR-101-3p结合的靶基因，根据结合评分及靶基因的生物学功能，选定EZH2为miR-101-3p的候选靶基因(图 2)。为验证miR-101-3p对EZH2的调控作用，在HepG2细胞中过表达miR-101-3p后，Western blot检测发现EZH2的蛋白表达显著下调(图 3A)，Real-time PCR检测证实EZH2的mRNA水平也显著下调(P < 0.05，图 3B)。
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| 图 2 生物信息学预测发现miR-101-3p与EZH2的3’UTR区存在结合位点 |
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| A：Western blot检测过表达miR-101-3p后EZH2蛋白表达变化；B: Real-time PCR检测过表达miR-101-3p后EZH2 mRNA表达变化(n=3，x±s) a：P < 0.05，与对照组比较 图 3 miR-101-3p靶向抑制EZH2的表达 |
2.4 miR-101-3p与EZH2的3’UTR存在直接结合
为了验证miR-101-3p是否与EZH2的3’UTR区存在直接结合，先构建含有EZH2 3’UTR区野生型(EZH2 wt-3’UTR)与突变miR-101-3p结合位点的突变型(EZH2 mut-3’UTR)报告基因质粒(图 4A)；通过双荧光素酶报告基因检测发现，过表达miR-101-3p可抑制野生型报告基因活性，而对突变型报告基因无抑制作用(图 4B)，说明miR-101-3p与EZH2的3’UTR区存在直接结合，可通过促进EZH2 mRNA的降解而抑制EZH2的表达。
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| A：miR-101-3p、EZH2 wt-3’UTR和EZH2 mut-3’UTR的序列对比；B:双荧光素酶报告基因验证miR-101-3p与EZH2 3’UTR存在直接结合(n=3，x±s) 1：对照组一；2：实验组；3：对照组二；4：对照组三a: P < 0.05，与对照组一比较 图 4 miR-101-3p与EZH2的3’UTR存在直接结合 |
2.5 索拉非尼处理上调HepG2细胞中EZH2基因表达
HepG2细胞经索拉非尼处理24 h后，Western blot检测EZH2的蛋白表达显著上调(图 5)，Real-time PCR检测证实EZH2的mRNA表达水平也明显上调(1.906±0.105 vs. 1.000±0.096, P < 0.05)。
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| 图 5 Western blot检测索拉非尼处理后EZH2的蛋白表达变化 |
2.6 EZH2抑制剂EPZ-6438可增加HepG2细胞对索拉非尼的敏感性
结果显示，使用EZH2抑制剂EPZ-6438(5 μmol/mL)联合索拉非尼处理HepG2细胞后，可显著增加索拉非尼对HepG2细胞的杀伤效果(P < 0.05，图 6)。
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| 1：对照组；2：索拉非尼组；3：EPZ-6438组；4：索拉非尼与EZP-6438联合组a:P < 0.05，与索拉非尼组比较 图 6 各组处理后HepG2细胞的存活率比较(n=3，x±s) |
3 讨论
近年来，全球肝癌的发病率持续增长，尤其在发展中国家肝癌依旧是高发病率及高病死率的恶性肿瘤之一[15]。索拉非尼是晚期肝癌最常用的分子靶向治疗药物，肝癌对索拉非尼的耐药严重影响着肝癌患者的生存和预后[16-18]，探索肝癌细胞对索拉非尼耐药的机制以及提高索拉非尼的敏感性成为临床上急需解决的问题之一。
miRNA在肿瘤发生、发展及治疗的各个方面起到调控作用，包括肿瘤对化疗药物的耐药过程[19-21]。目前研究表明多种microRNA参与了索拉非尼耐药。miR-21在索拉非尼处理后呈上调趋势，通过Akt/PTEN途径抑制自噬，参与索拉非尼获得性耐药[22]。miR-122在索拉非尼耐药的肝癌细胞中呈现低表达水平，并且可以通过抑制胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)从而参与索拉非尼的耐药过程[23]。miR-34a在肝癌组织和细胞系中呈现低表达水平，通过对Bcl-2的调控作用参与索拉非尼的耐药[24]。miR-27b通过激活p53依赖性的细胞凋亡和降低CYP1B1介导的药物解毒作用来增强索拉非尼对肝癌的杀伤作用[25]。以上研究提示，microRNA参与肝癌中索拉非尼耐药机制，microRNA在耐药中发挥的作用也被广泛关注有望成为新的化疗靶点。
miR-101-3p调控着肿瘤细胞的增殖和生长能力，迁移、侵袭能力，包括自噬水平等，在多种肿瘤细胞中呈现低表达水平。miR-101-3p在子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)组织中的表达水平明显低于正常组织，并且miR-101-3p还通过抑制EZH2的表达促进EC细胞自噬[26]。在胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)细胞系中miR-101-3p呈低表达水平，miR-101-3p通过直接靶向TRIM44的3’UTR来减弱TRIM44诱导的上皮间充质转化(EMT)，从而调节GBM细胞的增殖和迁移[27]。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中，miR-101-3p通过靶向MALAT-1来阻断PI3K/AKT信号通路，从而抑制NSCLC的生长和转移[28]。本研究结果表明，索拉非尼处理可显著下调HepG2细胞中的miR-101-3p水平，且过表达miR-101-3p则可显著增强索拉非尼对肝癌细胞的杀伤效果，说明miR-101-3p的表达下调可能是肝癌细胞耐受索拉非尼的重要原因。
为探究miR-101-3p参与耐药的相关机制，通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验、Western blot及Real-time PCR实验确定了EZH2为miR-101-3p作用的靶基因。即miR-101-3p下调后可导致EZH2表达上调而引起耐药；而EZH2的抑制剂(EPZ-6438)可以显著增敏索拉非尼的杀伤效果，从而进一步证实miR-101-3p/EZH2参与了肝癌细胞对索拉非尼的耐药。研究表明[29-32]，EZH2是一种赖氨酸特异性的甲基转移酶，能使组蛋白H3上的赖氨酸27(k27)发生甲基化。EZH2在多种肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，调控肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和细胞周期等，该基因表达升高往往预示不良预后。在肝癌细胞中，EZH2的高表达与索拉非尼耐药相关。有研究报道[33]，EZH2可通过转录抑制miRNA-139、miRNA-125b、miRANG-122等一组miRNA的表达，降低该组miRNA对IGF1R的靶向抑制作用，使得IGRF1R表达升高，从而参与肝癌细胞的索拉非尼耐药。说明miR-101-3p表达降低导致的EZH2表达升高可能通过多种途径引起肝癌细胞对索拉非尼耐药。
综上所述，本研究阐明miR-101-3p/EZH2信号通路参与了肝癌对索拉非尼的耐药过程。索拉非尼抑制miR-101-3p/EZH2信号通路，通过上调miR-101-3p的表达，可以显著增敏索拉非尼，促进细胞死亡。本研究还发现EPZ-6438联合索拉非尼用药能显著增加肝癌对索拉非尼的敏感性，提高索拉非尼对肝癌的杀伤力，促进细胞死亡。miR-101-3p是否还能通过靶向其他基因参与索拉非尼耐药？miR-101-3p是否还能参与其他化疗药物的耐药过程？是否存在其他miRNA靶向EZH2参与索拉非尼耐药？将成为我们下一步探索的目标。这些结果的完善，可能为设计完善针对肝癌的索拉非尼化疗新方案提供思路。
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