放射性肠病(radiation enteritis，RE)是指位于腹腔、盆腔等部位的恶性肿瘤经放疗后，对肠道产生一定损害所引起的疾病，主要表现为腹痛、腹泻和血便，少部分病情较重者甚至可能造成肠管狭窄、肠梗阻或肠瘘等[1]，主要病理改变是组织结构被破坏、产生隐窝细胞坏死和黏膜上皮细胞脱落等。迄今为止，临床上治疗RE多采用细胞因子、激素类药物和巯基类化合物等辐射防护剂，但却有副作用多、价格高昂和毒性较大等使用条件限制[2]。
枸杞是被中医使用数千年的传统中草药，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)是枸杞的主要活性成分之一[3]。研究认为枸杞多糖具有多种生物学效应[4-8]，特别是在消化系统，LBP能够调节肠道菌群、维持肠道微生态系统健康[9]和提高肠道细胞抗氧化能力[10]。在调控细胞凋亡方面，LBP可以通过上调Bcl-2、下调Bax表达来抑制人晶状体上皮细胞及大鼠角膜上皮细胞凋亡[11-12]。
本研究通过建立小鼠放射性肠损伤模型，初步探讨LBP抑制X射线所致小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)凋亡中关键分子Bcl-2和Bax的作用，探究LBP对放射损伤小鼠小肠上皮的保护机制，为将来临床中进一步研究LBP防治电离辐射损伤提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物昆明小鼠36只(SPF级)，雌雄各半，6~8周龄，体质量(20±2)g，由重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2 试剂与仪器枸杞多糖(纯度＞950 mg/g)购自上海康舟真菌多糖有限公司(批号KZ20160812)；Percoll细胞分离液购自重庆蒙博生物科技有限公司(批号17-0891-09)；CCK-8溶液购自上海东仁化学科技有限公司(批号KL700)；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒及细胞裂解液均购自上海碧云天生物技术公司(批号分别为C1062S、S1010、S0131、P0012AC、P0010S、P0013)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自联科生物技术公司(批号81701014)；PVDF膜购自美国Bio-Rad公司(批号1620177)；化学发光液购自赛默飞世尔科技公司(批号SC249361)；Bcl-2抗体和Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司(批号分别为3498S、2772T)；β-actin抗体购自三箭生物有限公司(批号KM9001)。
主要仪器：直线加速器(Varian公司，型号2300CD)，超净台(美国Baker公司)，恒温摇床(上海智诚分析仪器有限公司)，电子天平(美国Mettler Toledo集团)，全自动酶标仪(基因有限公司，型号Symergy HT)，流式细胞仪(Becton-Dickinson公司，型号CytoFLEX)，Chemi-Touch化学发光仪(成都百乐科技有限公司)，离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.3 方法 1.3.1 小鼠放射性肠损伤模型的建立参考文献[13-14]，使用昆明小鼠行一次性腹部6 MV X线照射，上界为剑突以下，下界为耻骨联合以上(其他部位用铅砖屏蔽)，吸收剂量率为300 cGy/min，皮源距100 cm，照射野25 cm×25 cm，照射时间2 min，剂量为6 Gy，以观察到小鼠明显的RE症状及小肠病理切片中典型的RE表现为实验模型建立成功的标志。
1.3.2 实验分组及给药按随机数字表法将小鼠分为6组，每组6只，分别为正常组、辐射组、低剂量LBP(200 mg/kg)+辐射组、中剂量LBP(400 mg/kg)+辐射组、高剂量LBP(800 mg/kg)+辐射组和LBP组(800 mg/kg)，正常组和LBP组不照射，其余各组行X线照射建立小鼠放射性肠损伤模型，2 h后灌胃给药，辐射组给予等量生理盐水，每天1次，每次0.5 mL，连续7 d。
1.3.3 小鼠大体情况与小肠组织病理观察观察各组小鼠的一般情况，1周后，在无菌条件下采用水合氯醛麻醉加高浓度二氧化碳窒息后处死小鼠，取近十二指肠肠段用10%甲醛溶液冲洗并浸泡，常规病理固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察IECs数量与分布、隐窝细胞形态及数量、小肠绒毛长度和密度。
1.3.4 小鼠IECs的分离处死小鼠后，无菌条件下取出回盲部至幽门的全部小肠，用4 ℃预冷的Hanks液(含有双抗：青霉素100 U/mL，链霉素0.1 mg/mL)冲洗小肠，翻转肠黏膜，置于预热的30 mL消化液中(含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT的Hanks液)37 ℃水浴箱中孵育20 min，然后放入恒温振荡箱中，37 ℃，120 r/min，振荡40 min。然后经200目细胞筛过滤，收集的细胞重悬于30% Percoll分离液，1 350 r/min(离心半径13.5 cm)，离心20 min。沿着试管壁边缘小心吸取白膜层IECs细胞，移入另一个清洁的离心管中，清洗液洗3次备用。
1.3.5 CCK-8法检测小鼠IECs活力，流式细胞仪检测IECs凋亡率加细胞悬液100 μL (约1×106个细胞)到96孔板(边缘孔用PBS填充)。每组设定3个复孔。置于37 ℃、5% CO2孵箱过夜，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，测定波长450 nm处各孔的光密度值[D(450)]，以样品光密度与空白对照光密度差值代表IECs细胞活性。使用预冷的PBS冲洗IECs 2次并计数，离心后弃去上清，取1×105个细胞加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻混匀，随后依次加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温下(25 ℃)避光孵育10 min，使用双参数分析法在流式细胞仪上计算凋亡率。
1.3.6 IECs中SOD活性及MDA含量检测取适量IECs悬液加入细胞裂解液500 μL，于冰上裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min(离心半径6.5 cm)，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度，并根据SOD、MDA检测试剂盒说明书测定。
1.3.7 Western blot检测Bcl-2与Bax的表达取适量细胞，用4 ℃预冷的PBS冲洗2次，加入适量含有PMSF的细胞裂解液(按每1毫升细胞裂解液混合10 μL PMSF)混匀，置于冰上裂解30 min，每隔5 min摇匀1次，随后将样品放入4 ℃预冷的高速离心机中(离心半径为6.5 cm)，12 000 r/min，离心5 min，取上清，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度后，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃，煮沸10 min，每孔加入15 μg蛋白，以5%的浓缩胶、12%的分离胶电泳，PVDF膜湿法电转膜。转膜结束后将条带放入TBST稀释的5%脱脂奶粉中摇床封闭3 h，洗膜4次，每次8 min，加入Bax、Bcl-2及β-actin一抗(均1 :1 000稀释)4 ℃孵育过夜，洗膜4次，每次8 min，二抗在室温条件下孵育60 min，洗膜4次，每次8 min，加入显影液进行曝光，β-actin为内参，各灰度值与其比值为Bax及Bcl-2蛋白相对表达量。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件，数据以x±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 小鼠大体情况与小肠组织病理观察经照射后的各组小鼠，出现了反应迟钝、活动减少、毛发脏乱、缺少光泽的表现，排便为黄色稀便，体质量减轻不明显。给予LBP干预后，小鼠一般状况逐渐恢复，而辐射对照组小鼠精神状态极差，长时间呈蜷缩状，毛发竖立，体质量减轻。使用显微镜观察小鼠受照射后7 d各组肠绒毛和肠隐窝形态改变。与正常对照组相比，辐射组肠绒毛呈现出稀疏缺损、固有层隐窝稍减少、炎症细胞浸润，表明成功构建小鼠放射性肠损伤模型。低剂量LBP+辐射组肠绒毛短而稀少，却能发现隐窝结构增多。当LBP到达400 mg/kg时，虽然肠绒毛较为短小且排列不够整齐，但隐窝腔内细胞增多。高剂量LBP+辐射组肠绒毛长而整齐，腺体结构完整。LBP组与正常组相比肠绒毛无明显差异(图 1)。
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| A:正常组；B:辐射组；C:低剂量LBP+辐射组；D:中剂量LBP+辐射组；E:高剂量LBP+辐射组；F: LBP组 图 1 各组小鼠照射后7 d肠绒毛和肠隐窝形态改变(HE ×100) |
2.2 LBP对辐射损伤后小鼠IECs细胞活力及细胞凋亡的影响
X线照射小鼠后7 d，采用CCK-8检测IECs细胞活力(图 2A)。与辐射组相比，正常组和低剂量LBP+辐射组、中剂量LBP+辐射组、高剂量LBP+辐射组细胞活力均较高(P < 0.01)，表明LBP能够提高辐射损伤IECs细胞活力。此外，LBP组细胞活力稍高于正常组(P < 0.05)，说明在正常情况下LBP也能增强IECs细胞活力。随着LBP剂量增加，细胞活力呈上升趋势。
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| 1:正常组；2:辐射组；3:低剂量LBP+辐射组；4:中剂量LBP+辐射组；5:高剂量LBP+辐射组；6: LBP组；a：P < 0.05, 与正常组比较；b: P < 0.05, 与辐射组比较；c: P < 0.05, 与低剂量LBP+辐射组比较 图 2 LBP对辐射损伤后小鼠IECs活力(A)及IECs凋亡率(B)的影响(n=6) |
采用流式细胞仪检测IECs细胞凋亡情况，将细胞早期凋亡率和细胞晚期凋亡率的总和作为IECs细胞凋亡率进行评估(图 2B)。与辐射组相比，低剂量LBP+辐射组、中剂量LBP+辐射组、高剂量LBP+辐射组细胞凋亡率均下降(P < 0.01)，随着枸杞多糖剂量增加，凋亡率出现逐渐降低趋势，表明LBP有效减弱了辐射所致的IECs细胞凋亡。
2.3 LBP对辐射损伤后小鼠IECs细胞SOD活性及MDA含量的影响辐射后7 d，测定IECs细胞中MDA含量和抗氧化酶SOD活性。结果显示：辐射组MDA含量显著升高，但经过LBP处理的各组MDA含量上升受到了一定程度的抑制。与辐射组相比，正常组和中剂量LBP+辐射组、高剂量LBP+辐射组SOD活性均较高，与正常组相比，LBP组(仅给予800 mg/kg LBP，不进行X线照射) SOD活性也较高(P < 0.05)。与辐射组相比，低剂量LBP+辐射组、中剂量LBP+辐射组、高剂量LBP+辐射组MDA含量呈逐渐下降趋势。表明LBP可能通过提高SOD活性、降低MDA含量来增强小鼠IECs细胞抗氧化能力(图 3)。
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| 1:正常组；2:辐射组；3:低剂量LBP+辐射组；4:中剂量LBP+辐射组；5:高剂量LBP+辐射组；6:LBP组；a：P < 0.05, 与正常组比较；b: P < 0.05, 与辐射组比较；c: P < 0.05, 与低剂量LBP+辐射组比较；d：P < 0.05, 与中剂量LBP+辐射组比较 图 3 LBP对辐射损伤后小鼠IECs细胞SOD活性(A)和MDA含量(B)的影响(n=6) |
2.4 LBP对辐射损伤后小鼠IECs细胞Bcl-2与Bax表达的影响
与辐射组相比，低剂量LBP+辐射组、中剂量LBP+辐射组、高剂量LBP+辐射组Bcl-2表达量明显增加(P < 0.05，P < 0.01)，Bax表达量降低(P < 0.05，P < 0.01)，与正常组相比，LBP组Bax表达量降低(P < 0.05，图 4)。这些结果进一步表明：LBP对辐射诱导的IECs细胞凋亡的保护作用涉及线粒体途径。
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1:正常组；2:辐射组；3:低剂量LBP+辐射组；4:中剂量LBP+辐射组；5:高剂量LBP+辐射组；6:LBP组 A：Western blot检测；B：半定量分析 a：P < 0.05, 与辐射组比较；b：P < 0.05, 与正常组比较 图 4 Western blot检测各组小鼠IECs细胞辐射损伤凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达(n=6) |
3 讨论
根据既往研究报道，选择6 Gy和10 Gy剂量照射小鼠腹部[13-14]，从症状体征和病理表现都能观察到放射性肠炎改变，但10 Gy剂量会造成小鼠骨髓抑制、肝功损害且死亡过多，不能成为理想的实验模型，所以本研究使用6MV X线一次性照射6 Gy剂量建立小鼠放射性肠损伤模型，并参考既往报道，扩大LBP剂量范围，设立不同剂量LBP干预组[15-16]，观察小鼠小肠病理切片，检测了IECs细胞活力、凋亡率、抗氧化能力及凋亡相关蛋白的表达。本研究发现：首先，放射性肠损伤小鼠IECs细胞活力降低、凋亡率显著增加，经枸杞多糖干预后，与辐射组相比，小肠上皮黏膜损伤减轻，细胞凋亡率均有所减低，表明枸杞多糖能够有效减轻辐射所致的细胞凋亡；其次，辐射后小鼠IECs细胞SOD活性明显下降，MDA含量显著上升，给予LBP的各组小鼠IECs细胞SOD活性均上升，MDA含量均下降，表明LBP能起到抗氧化的作用；最后，LBP干预各组Bcl-2蛋白表达明显高于辐射组，促凋亡基因Bax表达随LBP剂量增加而逐渐减少, 表明枸杞多糖可能通过作用于线粒体通路上调Bcl-2和下调Bax的表达来抑制辐射损伤细胞的凋亡。
本研究结果显示：辐照后给予LBP干预的各组小鼠小肠组织较辐射组有一定恢复，但并不能因此而忽略机体随着时间的延长同样可以自行修复6 Gy辐照剂量所致的放射性肠炎，使用LBP虽然加快了机体本身的修复，但这只是在单一剂量和单一时相点下的观察结果，有待于设立更多的检测时间点，以及在更大范围内运用不同剂量的LBP处理，进行动态观察，来证实LBP的疗效。
本研究通过测定IECs细胞SOD活性和多不饱和脂肪酸作用所产生的终产物MDA的含量，发现各LBP干预组小鼠IECs细胞SOD活性均上升，MDA含量均下降，而辐射组小鼠IECs细胞SOD活性下降，MDA含量显著上升。其原因可能是由于电离辐射通过诱导机体氧自由基的产量增加，高浓度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起细胞氧化应激，导致细胞凋亡，使生物大分子遭到破坏，并引发严重的脂质过氧化反应。这些结果最后均会导致组织的损伤[5]。而LBP可以通过增强抗氧化酶SOD活性来加快过量自由基及ROS的清除，减少MDA产生来保护细胞。还有研究表明：LBP可通过清除自由基和抑制含半胱氨酸的Caspase-3的激活来降低ROS水平，从而防止ROS诱导细胞凋亡[16-17]。迄今为止，在人体中也发现LBP具有抗氧化活性，连续摄入LBP 1个月可提高机体抗氧化功效[18]。综上所述，LBP可以增加放射性肠损伤小鼠IECs细胞抗氧化酶的活性并降低MDA的蓄积，从而减弱ROS和自由基引起的氧化应激反应，提高机体的抗氧化能力，但其具体调控方式还有待进一步研究。
接受辐射处理后，小鼠IECs细胞凋亡率都有不同程度的升高，但使用LBP干预的各组较辐射对照组凋亡率明显减低。目前，已经发现多种分子对细胞凋亡具有抑制作用，包括P53基因、细胞因子反应调节剂A(CrmA)、FLICE抑制蛋白(FLIP)和Bcl-2家族等。辐射及其产生的ROS诱导DNA链断裂可以促进P53的激活[19]，这会使细胞更为敏感，即使少量的DNA损伤也会促使凋亡的发生。P53激活后能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，使凋亡效应因子Bax或Bak被激活，导致线粒体外膜损伤和细胞凋亡。已有研究表明：LBP可通过调节Bcl-2/ Bax比值[17, 20]、线粒体膜电位[21]及Caspase表达[20-22]来减少细胞凋亡。本研究使用Western blot检测了IECs辐射损伤凋亡相关蛋白的表达，结果发现LBP各干预组Bcl-2蛋白表达明显高于辐射组，促凋亡基因Bax表达随LBP剂量增加而逐渐减少，这表明减弱放射性肠损伤所致的DNA损伤及抑制线粒体凋亡途径可能是LBP发挥抗辐射作用的重要机制之一。
本研究还存在以下几点不足。首先，只设立了7 d一个时间观察点，正常情况下，肠干细胞可以通过增殖分化使小肠上皮细胞得到补充更新，在小鼠体内的转化周期约为3~5 d[23]，小肠黏膜的完整性依赖于对IECs细胞的不断更新，这是一个变化的过程。经过辐射后，机体能够通过自行修复的方式使肠道组织得到恢复，然而仅选取7 d一个时间点，观察到的结果是有限的，选取多时相进行动态监测将更能证实其疗效。我们选择7 d作为一个实验周期，是考虑到IECs增殖分化以及LBP发挥作用所需时间，但设立不同时间点的确会使研究更加客观全面。其次，设立一个临床上常用并与LBP作用机制相似的抗辐射药物组，对其疗效进行比较，也是十分有意义的。我们纳入了未受辐射只接受LBP处理的LBP组，在一定程度上增加了LBP效果的可靠性。最后，LBP对IECs细胞凋亡的抑制作用除通过作用于线粒体通路发挥效应外，是否还有其他信号通路联合发挥抗辐射功能，其具体方式、作用靶点、有效部位尚不明确，但我们选择线粒体凋亡途径是结合现有研究，LBP最有可能发挥其抗凋亡作用的方式。
LBP作为传统中药枸杞的重要活性成分，可以通过辅酶、微波及超声波提取法获得，具有价廉、广效、无明显毒副作用等优点，在辐射防护领域有广大应用前景。已有研究发现LBP可以提高肠道抗氧化酶水平，减弱大鼠肠道缺血再灌注损伤[24]，LBP能够保护人视网膜色素上皮细胞抑制氧化应激诱导的凋亡作用[17]，经过LBP预处理可有效减少小鼠脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡[25]，LBP还对辐射引起的造血系统损伤有一定保护作用[26]。本研究结果表明：LBP对辐射损伤小鼠IECs具有抗氧化、增强细胞活力及抑制细胞凋亡的特点，它能够促进自由基代谢产物的清除、增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达及抑制促凋亡蛋白Bax的表达，LBP在未来或可成为治疗小肠辐射损伤的新型防护剂。但在将来的研究中，要最终确定其疗效，还需选择一些临床上常用并且与LBP抗辐射作用机制相近的药物进行多方面比较，以进一步证实LBP的功效。
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