2. 410005 长沙,长沙市疾病预防控制中心
2. Changsha Center for Disease Control and Prevention, Changsha, Hunan Province, 410005, China
疟疾(malaria)是由疟原虫(Plasmodium)感染引起的一种在热带和亚热带国家严重流行的主要虫媒传染病,尤其是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, P.f)对人类健康危害最大。近20年来,因有效抗疟药物的广泛应用,全球疟疾控制取得了卓越成效。但是,抗疟药物的抗性虫株播散已成为全球终止疟疾行动的绊脚石,成为人类对抗疟疾行动的重要挑战[1-2]。疟原虫的遗传因素,如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和拷贝数变异(copy number variations,CNVs)已显示在抗疟药物抗性形成中发挥了作用[3]。为适应生存环境的变化,真核细胞基因删减或重复某基因成为CNVs产生的机会,而且是SNPs发生概率的数千倍[4]。恶性疟原虫血浆蛋白酶基因2(plasmodium falciparum plasmepsin 2,pfpm2)拷贝数增加是P.f基因CNVs的一种,并与P.f对哌喹敏感性降低和对双氢青蒿素哌喹失效密切相关。WHO也推荐使用pfpm2基因CNVs作为跟踪P.f对哌喹或双氢青蒿素哌喹药物抗性发生和播散的风险评估指标[3, 5]。本研究旨在检测和分析长沙市2016-2019年输入性P.f患者的临床种株pfpm2基因CNVs情况,用以评估输入性抗药虫株可能存在的风险。
1 材料与方法 1.1 标本来源2016年1月5日至2019年12月30日,收集在长沙市输入性疟疾定点医疗机构收治的输入性恶性疟疾患者外周静脉抗凝全血122份,并将收集的全血标本于48 h内制作滤纸血膜标本待干备检。每份收集的标本在进行pfpm2基因CNVs检测前均经荧光实时定量PCR鉴定为P.f单一虫种感染,且采集该样本的患者在采集前未服用任何抗疟药物。标本来源患者的基本情况见表 1。本研究经长沙市疾病预防控制中心伦理委员会审查通过(2019年7月),患者在标本采集前均签署了知情同意书。
患者的类型、来源、流行病学史及既往史 | 例数 | 构成比(%) |
性别 | ||
男性 | 119 | 97.5 |
女性 | 3 | 2.5 |
国籍 | ||
中国国籍 | 116 | 95.1 |
非中国国籍 | 6 | 4.9 |
发病前1个月内是否有境外居留史 | ||
是 | 110 | 90.2 |
否 | 9 | 7.4 |
不详 | 3 | 2.5 |
发病前3个月内是否有境外居留史 | ||
是 | 117 | 95.9 |
否 | 2 | 1.6 |
不详 | 3 | 2.5 |
既往治疗疟疾用药情况 | ||
青蒿素类复方片剂 | 65 | 53.3 |
青蒿素类注射剂 | 11 | 9.0 |
氯喹和伯氨喹 | 9 | 7.4 |
其他 | 18 | 14.8 |
无治疗史 | 19 | 15.5 |
1.2 标本收集及处理
所收集的血样本,均经静脉采血于抗凝管后滴在蛋白保存卡(GE Whatman 903)上制作干血斑,常温保存备检。干血斑的核酸提取采用QIAamp DNA Microbiome Kit(货号:1080890)试剂盒与其提供的全血标本处理程序处理。疟原虫检测及虫种分型采用的试剂为江苏硕世生物科技有限公司生产的疟原虫核酸检测试剂盒及疟原虫分型试剂盒。平行对照检测的恶性疟原虫标准株(3D7株,原虫密度为10 000 parasites/μL)由中国CDC寄生虫病预防控制所赠送,该虫株为抗疟药物敏感虫株且为pfpm2单拷贝虫株。
1.3 检测方法及质量控制检测pfpm2基因拷贝数的方法参考柬埔寨巴斯德研究所提供的检测程序文件[6],pfpm2基因扩增引物为pfpm2-正向引物: 5′-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3′和pfpm2-反向引物:5′-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3′;参照基因扩增引物为pftub-正向引物: 5′-TGATGTGCGCAAGTGATCC-3′和pftub-反向引物: 5′-TCCTTTGTGGACATTCTTCCTC-3′。2对引物的扩增产物大小均为79 bp。扩增体系使用Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green预混液(货号A25780)。仪器选用ABI7500Fast System检测系统。pfpm2基因CNVs值通过荧光实时定量PCR系统基于2-ΔΔCt构建的基因CNVs分析程序对检测数据进行分析获得。
标准株3D7株每次检测复测6孔,每个患者样本复测3孔。当pfpm2基因扩增Ct值≥33或者所有检测样本pfpm2基因CNVs估算值小于0.5时,则该检测无效,另外,pfpm2和参照基因pftub热溶解曲线峰值温度在对应的温度时检测结果方可使用。以检测程序文件提供的划分依据[6-7],设pfpm2基因CNVs的截断值为1.5。当某临床虫株pfpm2基因检测的CNVs>1.5时被推断为具抗药性风险。当某一输出国的临床虫株pfpm2基因CNVs均值显著高于所有临床虫株pfpm2基因CNVs总体均值时,被推测为该国输出的虫株可能出现了抗药性风险。
1.4 统计学分析从检测设备分析软件导出检测数据的Excel文件后,再导入SPSS 18.0统计软件,计数资料采用构成比进行统计描述,计量资料采用x±s进行统计描述。组间比较先行方差齐性检验,若方差齐则采用一般t检验,若方差不齐则采用Cochran and Cox近似t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 2016-2019年长沙市输入性恶性疟原虫pfpm2基因CNVs情况表 2显示:122个临床标本的pfpm2基因CNVs均值显著高于标准虫株CNVs(P < 0.001);在122个临床标本中,检测的pfpm2基因CNVs≤1.5的临床虫株99个,占总样本数的81.1%;检测pfpm2基因CNVs>1.5的临床虫株23个,占总样本数的18.9%。对各年度输入样本检测结果分析(表 3)显示:2016-2019年的pfpm2基因CNVs值分别为1.061±0.323、1.184±0.247、1.292±0.571和1.414±0.360。经t检验,2017年比2016年(P=0.004)、2018年比2016年(P < 0.001)、2019年比2017年(P < 0.001)、2019年比2016年(P < 0.001)的pfpm2基因CNVs均值增加,且差异具有统计学意义。但2018年与2017年比较,以及2019年与2018年比较,pfpm2基因CNVs值差异均无统计学意义。
分类 | 样本数 | pfpm2基因CNVs值(x±s) | pfpm2基因CNVs区间值 |
标准株 | 5 | 1.007±0.023 | 0.969~1.045 |
CNVs≤1.5 | 99 | 1.070±0.157b | 0.757~1.476 |
CNVs >1.5 | 23 | 1.876±0.562 | 1.505~3.954 |
合计 | 122 | 1.222±0.422a | 0.757~3.954 |
a:P < 0.001,与标准株比较;b:P < 0.001,与CNVs>1.5比较 |
年份 | CNVs值≤1.5 | CNVs值>1.5 | 检测样本 | pfpm2基因CNVs值(x±s) | |||
患者数 | 构成比(%) | 患者数 | 构成比(%) | ||||
2016 | 33 | 86.8 | 5 | 13.2 | 38 | 1.061±0.323 | |
2017 | 21 | 84.0 | 4 | 16.0 | 25 | 1.184±0.247ac | |
2018 | 27 | 77.1 | 8 | 22.9 | 35 | 1.292±0.571b | |
2019 | 18 | 75.0 | 6 | 25.0 | 24 | 1.414±0.360b | |
合计 | 99 | 81.1 | 23 | 18.9 | 122 | 1.222±0.422 | |
a:P=0.004,b:P < 0.001,与2016年比较;c:P < 0.001,与2019年比较 |
2.2 各输出国虫株CNVs检测结果与总体均值的比较
长沙市输入性P.f虫株来源于25个国家,各国输出虫株pfpm2基因CNVs检测结果(表 4)显示:pfpm2基因CNVs值>1.5的虫株来源于尼日利亚、科特迪瓦、安哥拉、刚果民主共和国、贝宁、几内亚、坦桑尼亚、布隆迪等12个非洲国家输出的部分样本中。经t检验或Cochran and Cox近似t检验,尼日利亚、科特迪瓦、坦桑尼亚和布隆迪4个国家来源的虫株pfpm2基因CNVs均值均显著高于总体样本检测的均值。
患者输出国 | CNVs≤1.5 | CNVs>1.5 | pfpm2基因CNVs | 与总体值比较 | |||||||
患者数 | 构成比(%) | 患者数 | 构成比(%) | 患者数 | x±s | t值 | P值 | ||||
尼日利亚 | 9 | 60.0 | 6 | 40.0 | 15 | 1.429±0.656* | 2.065 | 0.044▲ | |||
科特迪瓦 | 3 | 60.0 | 2 | 40.0 | 5 | 1.521±0.777* | 2.578 | 0.010▲ | |||
加纳 | 8 | 88.9 | 1 | 11.1 | 9 | 1.085±0.246* | 2.623 | 0.012● | |||
马里 | 4 | 80.0 | 1 | 20.0 | 5 | 1.107±0.292 | 1.045 | 0.297 | |||
安哥拉 | 5 | 83.3 | 1 | 16.7 | 6 | 1.231±0.215* | 0.163 | 0.872 | |||
刚果民主共和国 | 13 | 72.2 | 5 | 27.8 | 18 | 1.253±0.353 | 0.514 | 0.608 | |||
刚果共和国 | 13 | 92.9 | 1 | 7.1 | 14 | 1.198±0.497 | 0.375 | 0.708 | |||
塞拉利昂 | 6 | 75.0 | 2 | 25.0 | 8 | 1.137±0.305 | 0.968 | 0.333 | |||
喀麦隆 | 7 | 87.5 | 1 | 12.5 | 8 | 1.175±0.314 | 0.536 | 0.593 | |||
贝宁 | 1 | 50.0 | 1 | 50.0 | 2 | 1.371±0.553 | 0.854 | 0.394 | |||
几内亚 | 1 | 50.0 | 1 | 50.0 | 2 | 1.497±0.362 | 1.586 | 0.114 | |||
坦桑尼亚 | 0 | 0 | 1 | 100.0 | 1 | 1.510±0.043* | 8.672 | 0.001▲ | |||
埃塞俄比亚 | 4 | 100.0 | 0 | 0 | 4 | 1.101±0.199* | 3.889 | 0.001● | |||
巴基斯坦 | 2 | 100.0 | 0 | 0 | 2 | 1.101±0.076* | 3.602 | 0.001● | |||
巴布亚新几内亚 | 1 | 100.0 | 0 | 0 | 1 | 0.824±0.013* | 17.081 | 0.001● | |||
马维拉 | 1 | 100.0 | 0 | 0 | 1 | 0.801±0.039* | 18.069 | 0.001● | |||
加蓬 | 3 | 100.0 | 0 | 0 | 3 | 1.124±0.049* | 3.571 | 0.001● | |||
肯尼亚 | 1 | 100.0 | 0 | 0 | 1 | 1.073±0.044* | 4.429 | 0.004● | |||
莫桑比克 | 2 | 100.0 | 0 | 0 | 2 | 1.103±0.015* | 5.198 | 0.001● | |||
利比里亚 | 2 | 100.0 | 0 | 0 | 2 | 1.029±0.084* | 4.733 | 0.001● | |||
赤道几内亚 | 5 | 100.0 | 0 | 0 | 5 | 1.192±0.125* | 0.767 | 0.449 | |||
乌干达 | 4 | 100.0 | 0 | 0 | 4 | 1.170±0.108* | 1.362 | 0.186 | |||
马达加斯加 | 2 | 100.0 | 0 | 0 | 2 | 1.129±0.243 | 0.538 | 0.591 | |||
布隆迪 | 1 | 100.0 | 0 | 0 | 1 | 1.329±0.033* | 3.671 | 0.004▲ | |||
布基纳法索 | 1 | 100.0 | 0 | 0 | 1 | 1.091±0.023 | 5.088 | 0.001● | |||
①表中各国样本检测的pfpm2基因CNVs值的统计包含了对每个样本平行检测3孔的数据,因此对检测1~2个样本的国家也出现了±s被纳入统计学分析;②各输出国虫株pfpm2基因CNVs值与总体值(1.222±0.422)进行比较,*为方差不齐采用Cochran and Cox近似t检验,反之采用一般t检验;③▲为该国来源的虫株pfpm2基因CNVs值比总体值明显增高;●为该国临床虫株pfpm2基因CNVs值比总体值明显下降 |
3 讨论
疟原虫基因拷贝数CNVs增加是疟原虫虫株发生抗药性的重要分子机制之一。有研究显示:约6%的P.f抗药性出现与其相关基因CNVs变化相关[7]。WITKOWSKI等[6]在柬埔寨做了一项研究,采用Illumina Pair-Read测序法检测基因变异,结果发现用pfpm2基因CNVs的增加来预测哌喹或双氢青蒿素哌喹清除P.f失败或清除时间延迟的敏感性为0.94(95% CI: 0.88~0.98),特异性为0.77(95%CI: 0.74~0.81),由此认为pfpm2基因CNVs增加可以作为P.f对哌喹或双氢青蒿素哌喹药物抗性的分子标记。另外,BOPP等[5]体外培养P.f耐受哌喹或双氢青蒿素哌喹种株的全基因组测序结果也支持pfpm2基因CNVs的增加作为该类药物抗性分子标记的观点。但是,在非洲采用pfpm2基因CNVs增加作为P.f对哌喹或双氢青蒿素哌喹抗性分子标记的研究却不完全支持上述研究结论。有研究认为pfpm2基因CNVs的增加不能作为独立因子来评价P.f对哌喹或双氢青蒿素哌喹的抗性,但可推测该P.f虫株对该类药物抗性有一定相关性[8-9]。
本研究收集了长沙市2016-2019年输入的122例P.f患者治疗前的全血标本,通过对其作pfpm2基因CNVs的检测结果分析发现:pfpm2基因CNVs >1.5的临床种株占18.9%(23/122);从2016年的13.2%(5/38)到2017年的16.0%(4/25),再从2018年的22.9%(8/35)上升到2019年的25.0%(6/24),并且各年度pfpm2基因CNVs均值也呈现出逐年上升的趋势。经t检验,本研究分析的输入病例中,次年输入病例pfpm2基因CNVs均值普遍高于前1年输入病例,但只有2019和2018年比较差异具有统计学意义。如果间隔1年以上进行均值比较,如2018与2016年相比、2019与2017年相比、2019与2016年相比,差异都具有统计学意义。
为探讨pfpm2基因CNVs值在提示药物治疗输入性恶性疟敏感性的作用,本研究回顾了23例pfpm2基因CNVs>1.5患者和其余患者的既往疟疾病史和用药情况、当次患病的治疗情况。上述23例恶性疟患者中,有21例(91.3%, 21/23)患者自述具有抗疟治疗史,有16例(69.6%, 16/23)患者服用过自行购买或由其雇主提供的药名不祥的抗疟药物,有9例(39.1%, 9/23)患者曾服用青蒿素类复方片剂进行抗疟治疗。在99例pfpm2基因CNVs≤1.5的患者中,有82例(82.8%, 82/99)患者自述具有抗疟治疗史,仅有2例(2.0%, 2/99)患者曾服用过药名不祥的抗疟药物,有56例(56.6%, 56/99)患者曾服用过青蒿素类复方片剂进行抗疟治疗。国内极少使用哌喹或双氢青蒿素哌喹对恶性疟患者进行治疗,因此无法通过观测患者体内原虫清除时间来直接评价pfpm2基因CNVs值变异与哌喹或双氢青蒿素哌喹药物抗性的关系,但本研究还是统计了122例患者的用药时间,希望从侧面反映原虫的抗药性。pfpm2基因CNVs≤1.5的99例患者用药天数为(3.46±1.14)d,CNVs>1.5患者的用药天数为(4.26±1.39)d。从上述既往史和治疗时间延长来看,pfpm2基因CNVs增加虫株具备恶性疟原虫药物抗性虫株的理论基础和治疗表现。
有研究者认为:无意义的基因CNVs增加对于细胞自身的复制来说会造成因酶表达水平变化而引起的代谢增加,也会因此很难适应环境,使之在长期传代过程中逐渐消失[7]。发生在P.f群体的pfpm2基因CNVs增加的种株比例逐年提高的趋势,虽不能作为P.f虫株对哌喹或双氢青蒿素哌喹抗性蔓延或传播的直接证据,但可以作为一个与P.f对上述药物抗性的分子变异相关的标志物,对定点医疗机构的患者治疗和防控机构的防控具有警示意义。另外,从生物进化的角度看,pfpm2基因CNVs增加对于P.f来说不是负担而是有益的基因变异。如果该变化与恶性疟对哌喹或双氢青蒿素哌喹抗性相关,那么pfpm2基因CNVs增加的P.f临床虫株比例的逐年提升是否意味着P.f对该类药物抗性的传播,值得进一步证实。
本研究122例恶性疟患者主要来自非洲,少数来自亚洲和大洋洲,涉及25个输出国家。经对患者标本pfpm2基因CNVs检测发现,在非洲大陆12个国家出现了pfpm2基因CNVs增加的临床虫株。依据地理位置主要集中在西非南部沿海区域和非洲中部区域,而非洲北部、南部及东部(坦桑尼亚除外)无分布。将各输出国虫株pfpm2基因CNVs与总体均值进行比较发现:长沙市输入性恶性疟原虫CNVs增加主要来自于尼日利亚、科特迪瓦、坦桑尼亚和布隆迪等国家。LEROY等[10]在对P.f抗药性分子标记检测过程中发现,在非洲地区经常观察到pfpm2基因CNVs增加的现象,尤其是在布基纳法索和乌干达pfpm2基因CNVs增加种株比例高达30%以上。2019年,AMAMBUA-NGWA等[11]研究15个非洲国家共24个疟疾流行区的2 263个恶性疟临床种株基因SNPs,发现P.f基因出现SNPs的区域集中在西非南部、中非和东部部分国家。这些恶性疟原虫SNPs分布的区域与本研究pfpm2基因CNVs区域分布极为相似,说明pfpm2基因CNVs的播散路径与P.f基因SNPs播散模式相似。
综上所述,长沙市输入性P.f临床虫株pfpm2基因CNVs有逐年增加现象,其增加的临床种株主要来源于尼日利亚、科特迪瓦、坦桑尼亚和布隆迪等非洲国家,此结果与非洲主要输出国P.f临床虫株的SNPs播散状况极为相似。提示尼日利亚、科特迪瓦、坦桑尼亚和布隆迪等国家输入的P.f患者存在与抗药性相关的临床种株,并呈逐年增高趋势。可能存在因药物抗性造成的原虫清除失败或清除时间延迟,原虫可在患者体内发育成具有传播能力的有性阶段而加大输入再传播风险,值得疟疾防治机构关注。
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