2. 134003 吉林 通化,通化金马药业集团股份有限公司研发部
2. Department of R&D, Tonghua Jinma Pharmaceutical Group Co., Ltd. Tonghua, Jilin Province, 134003, China
便秘主要表现为持续排便困难、排便不尽感或排便次数减少,同时病程较长[1],其发生与患者的饮食结构、运动、年龄因素和药物滥用等有一定的关系[2-3],长期的便秘易引起患者的焦虑、抑郁情绪,并导致肠壁的损伤,进一步诱发肠道疾病,影响患者生活质量[4]。目前临床常用药物如蒽醌类、5-HT受体激动剂等药物具有一定的副作用,长期使用效果不佳[5]。研究显示便秘患者或动物的肠道菌群具有明显的改变,通过使用益生菌制剂,可对便秘产生一定的治疗作用,同时对肠道菌群具有调节作用[6-7]。
复方嗜酸乳杆菌片是一种用于治疗便秘的复合益生菌制剂,由中国株嗜酸乳杆菌、日本株嗜酸乳杆菌、粪链球菌和枯草杆菌4种菌粉组成复方片剂,目前尚缺乏对该复方药物治疗作用的深入实验研究数据。本研究通过给予便秘小鼠复方嗜酸乳杆菌片,同时设置酚酞阳性对照,观察益生菌制剂和传统治疗便秘药物之间的差异,探讨复方嗜酸乳杆菌片对便秘的改善作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级8~12周龄昆明种小鼠60只,体质量22~25 g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供,许可证号:SCXK(辽)2015-0001。饲养于长春中医药大学SPF级动物房中,自由摄入食物和水。
1.2 药物、试剂及仪器复方地芬诺酯片(产品批号1810020)购自常州康普药业有限公司;复方嗜酸乳杆菌片(产品批号20190512)购自通化金马药业集团股份有限公司;酚酞片(产品批号180610)购自山西亨瑞达制药有限公司;HE染色试剂盒(产品批号:171431)购于北京索宝来科技有限公司;石蜡切片机(LEICA, RM2235);正置荧光显微镜(OLYMPUS, BX53);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,DHG-9240A)。
1.3 方法 1.3.1 实验给药实验中治疗给药组均以临床等效剂量进行给药,复方嗜酸乳杆菌片每日人用剂量3 g,酚酞片每日人用剂量150 mg,根据人鼠药物剂量换算关系表换算,20 g小鼠剂量=人用剂量×0.002 6,再经换算得每只鼠每日给药量为复方嗜酸乳杆菌片0.39 g/kg,酚酞19.5 mg/kg。
1.3.2 小肠运动实验40只昆明种小鼠,分为正常组(Nor)、模型组(Mod)、菌片组(YJK)和阳性组(PT),每组10只,雌雄各半。采用一次性便秘造模的方法进行实验[8],菌片组灌胃复方嗜酸乳杆菌片,阳性组灌胃酚酞片,正常组和模型组灌胃蒸馏水,灌胃14 d,第15天给予地芬诺酯5 mg/kg,给药30 min后,各组小鼠采用0.4 mL/只进行碳墨灌胃,25 min后处死动物,解剖分离肠系膜,剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管,轻拉成直线测量小肠碳墨推进率。
1.3.3 粪便含水量检测20只昆明种雄性小鼠分为正常组(Nor)、模型组(Mod)、菌片组(YJK)、阳性组(PT),每组5只,以复方地芬诺酯10 mg/kg造便秘模型[9],正常组灌胃蒸馏水,模型组灌胃复方地芬诺酯混悬液,菌片组灌胃复方地芬诺酯+复方嗜酸乳杆菌混悬液,阳性组灌胃复方地芬诺酯+酚酞混悬液,连续给药21 d。给药第14~15天,分别收集每只小鼠新鲜粪便,称量粪便质量,放置60 ℃烘箱,4 h后再次称量,测定粪便含水量。粪便含水量(%)=(粪便湿质量-粪便干质量)/粪便湿质量。
1.3.4 肠道病理切片HE染色如1.3.3所述动物给药结束,处死后取结肠部位,于4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、制备5 μm切片、摊片,60 ℃烤片4 h,按照HE染色试剂盒进行染色,于200倍显微镜下观察结肠病理变化。
1.3.5 16S rRNA测序如1.3.3所述动物给药结束,处死后收集结肠粪便,存放于液氮中,样品交由上海美吉生物医药科技有限公司完成基因测序,测得的结果通过美吉生物云平台进行分析。
1.4 统计学分析使用SPSS 21.0统计软件,计量资料用x±s表示,两组间比较采用配对t检验,多组间比较采用协方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 动物行为状态在给药期间,正常组动物被毛光洁,反应机敏,活动自如,粪便光亮,排便正常。模型组动物行动较为迟缓,粪便干燥粗糙,排便困难。
2.2 小肠碳墨推进情况相较于正常组,模型组碳墨推进率明显下降(P < 0.01),表明小鼠肠道蠕动减慢,在复方嗜酸乳杆菌和酚酞片的干预下,碳墨推进率均有明显提高(P < 0.01),表明复方嗜酸乳杆菌具有促进肠道蠕动,提高胃肠动力的效果(表 1)。
组别 | 推进长度/cm | 小肠总长/cm | 推进率(%) |
正常组 | 33.80±3.06 | 46.05±3.61 | 73.46±4.39 |
模型组 | 19.43±1.81 | 46.53±1.63 | 41.89±5.10a |
菌片组 | 22.54±1.16 | 46.25±1.19 | 48.74±3.28b |
阳性组 | 25.15±3.47 | 45.73±2.66 | 54.99±9.60b |
a: P < 0.01,与正常组比较;b: P < 0.01,与模型组比较 |
2.3 小鼠粪便含水量变化
与模型组相比,正常组小鼠粪便含水量较高(P < 0.01),而菌片组和阳性组粪便含水量均有所提高(P < 0.05,表 2)。
组别 | 含水量(%) |
正常组 | 52.74±6.28 |
模型组 | 35.87±5.44a |
菌片组 | 42.83±4.76b |
阳性组 | 41.22±5.89b |
a: P < 0.01,与正常组比较;b: P < 0.05,与模型组比较 |
2.4 肠道病理切片观察
正常组小鼠结肠杯状细胞完整,而模型组结肠杯状细胞大量破裂,肠道损伤严重,菌片组和阳性组与模型组相比有所改善,结肠杯状细胞损伤较小(图 1箭头示)。
2.5 肠道菌群16S rRNA检测 2.5.1 样本稀释曲线及Venn图
在可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)水平中,样本稀释曲线都趋于平缓且分布较为集中,说明测序数据量足够大,可以反映样本中绝大多数的微生物信息(图 2),Venn图(图 3)显示:各组间肠道菌群的组成具有一定的差异。
2.5.2 肠道菌群多样性分析
对菌群进行α多样性分析,Shannon指数表示物种丰富度和物种的均匀度,是对群落结构的更综合性的反应,Shannon值越大,群落的多样性越高。相对于正常组,模型组的菌群多样性有显著性升高(P < 0.01),阳性组同样升高(P < 0.01),而给予复方嗜酸乳杆菌的菌片组,相对于模型组和阳性组,菌群多样性有所下降(P < 0.01),恢复至正常组水平(图 4A)。
基于β多样性的PCA分析,不同颜色或形状的点代表不同分组的样本,通过点之间的距离体现不同样本间的差异程度。可见正常组与模型组具有较大差异,菌片组更接近正常组的肠道菌群组成,而酚酞组与正常组差异较大,与便秘模型组较为接近(图 4B)。
2.5.3 肠道菌群门水平变化在门水平进行分析,共得到9个门,其中拟杆菌门和厚壁菌门占据主导地位,结果显示:便秘对这两个菌门会造成较大的影响,模型组厚壁菌门较正常组相对丰度显著下降(P < 0.05),拟杆菌门相对丰度增加(P < 0.05),阳性组的肠道菌群组成与模型组类似,而使用复方嗜酸乳杆菌的菌片组对菌群具有调节作用,使菌群组成在门水平上与正常组相似(P < 0.01;图 5,表 3)。
组别 | 拟杆菌门 | 厚壁菌门 |
正常组 | 17.16±9.43 | 75.85±9.26 |
模型组 | 42.39±15.26a | 49.12±17.99a |
菌片组 | 8.96±3.63b | 84.06±8.28b |
阳性组 | 32.16±12.61 | 49.39±10.68 |
a: P < 0.05,与正常组比较;b: P < 0.01,与模型组比较 |
2.5.4 肠道菌群属水平变化
属水平上分析,相对于正常组,模型组Lactobacillus、Ruminococcaceae、Candidatus相对丰度下降(P < 0.05,P < 0.01),Muribaculaceae、Parabacteroides、Intestinimonas、Tyzzerella相对丰度上升(P < 0.05,P < 0.01),在给予复方嗜酸乳杆菌干预后,以上几种菌属向正常组有着不同程度的回调(P < 0.05,P < 0.01;图 6,表 4)。
组别 | Lactobacillus | Muribaculaceae | Ruminococcaceae | Parabacteroides | Intestinimonas | Candidatus | Tyzzerella |
正常组 | 64.00±12.27 | 8.33±7.78 | 1.31±0.11 | 0.10±0.12 | 0.01±0.01 | 0.045 4±0.038 1 | 0.002 6±0.002 0 |
模型组 | 18.89±25.71a | 31.75±10.53a | 0.48±0.13a | 0.34±0.17c | 0.13±0.09c | 0.004 3±0.004 3c | 0.012 9±0.005 2a |
菌片组 | 48.03±21.14b | 5.01±1.33d | 1.11±0.10d | 0.15±0.15 | 0.02±0.01b | 0.119 2±0.015 4b | 0.006 8±0.008 4 |
阳性组 | 6.61±3.66 | 26.37±11.34b | 0.75±0.22b | 0.12±0.09 | 0.04±0.05 | 0.094 3±0.128 6 | 0.006 0±0.007 2 |
a: P < 0.01,c: P < 0.05,与正常组比较;b: P < 0.05,d: P < 0.01,与模型组比较 |
3 讨论
便秘在临床发病率高,治疗该疾病的药物种类也较为繁多。随着对肠道菌群在人类疾病中重要性认识的不断深入,越来越多的研究者开始尝试采用益生菌治疗肠道疾病[10]。目前临床上已有较多案例使用益生菌制剂治疗便秘,取得了较好的疗效。有研究对患者肠道菌群进行前后自身对照研究,发现其肠道菌群紊乱改善,菌群结构组成向健康人群靠拢[11-12]。复方嗜酸乳杆菌片的临床治疗结果显示:患者的排便情况有明显的好转,治疗有效率较高[13]。本课题组前期在对便秘小鼠进行粪便菌群选择性培养中发现,不同组动物之间菌群含量具有差异,复方嗜酸乳杆菌片可提高肠道菌群中益生菌的含量[14]。本研究对小鼠使用复方地芬诺酯进行便秘造模,给予复方嗜酸乳杆菌片治疗,实验结果显示:复方嗜酸乳杆菌片对便秘具有较好的治疗效果,可以提高小肠的运动能力,使小肠推进率显著加快,增加粪便含水量,减轻了结肠组织中的病理损伤。
本研究通过16S rRNA对小鼠结肠粪便进行高通量测序,发现便秘模型与正常动物肠道菌群结构具有明显的差异,便秘动物的微生物丰富度和多样性较正常组显著上升,在门水平上,便秘模型组厚壁菌门较正常组相对丰度显著下降,拟杆菌门相对丰度增加,这与临床便秘患者肠道菌群研究结果相一致[15-16];通过益生菌的治疗,便秘小鼠肠道菌群结构在门水平上恢复到与对照组相似的水平。肠道菌群和代谢产物的变化可能是便秘病理生理改变的重要原因,研究显示产丙酸菌主要为拟杆菌门细菌,丁酸水平与厚壁菌门的相对丰度呈正相关,而粪便中的丁酸与缓解便秘症状有一定的关系[17]。在属水平上,相对于正常组,便秘模型组有7个属发生了显著性变化,其中Lactobacillus(乳杆菌属)、Muribaculaceae和Ruminococcaceae(瘤胃菌属)占比较大,模型组中Lactobacillus(乳杆菌属)含量显著性降低,这与其他研究者得到的结果相一致[18-19]。在动物肠道内,该类菌属可利用糖类物质,生成酸性代谢物,降低肠道pH,改善肠道微生物环境,调节宿主免疫系统[20-21]。在便秘模型中,Muribaculaceae含量显著性升高,该菌属为新确立的菌属名,曾被称为S24-7家族,在小鼠肠道中含量较高,属于拟杆菌门,Muribaculaceae的变化主要与各种饮食治疗、宿主条件或啮齿动物定殖过程有关[22-24],但该菌属的具体功能目前缺乏深入的研究。Ruminococcaceae主要发酵代谢产物为乙酸和甲酸,该菌属的丰度已被证明与肠道的运动能力呈正相关,在便秘人群中其丰度受到抑制[25-26]。
本研究给予便秘小鼠复方嗜酸乳杆菌片进行治疗,相较于模型组,菌片组的菌群丰度与正常组具有更高的相似性,提示复方嗜酸乳杆菌片具有改善肠道菌群结构的作用。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属,是动物肠道菌群中的重要微生物,对肠道中的微生态平衡具有调节作用[27]。粪链球菌与枯草杆菌可促进肠道微生物的纤维素代谢、碳水化合物代谢以及氨基酸代谢,对动物肠道发育以及物质的消化吸收具有调节作用[28]。这几种益生菌均可产生短链脂肪酸,参与机体氧化功能、调节肠道平衡并改善肠道功能[29]。
本研究同时设立酚酞片作为阳性对照组,结果显示:酚酞片对于便秘模型小鼠的排便具有良好的促进作用,但对肠道菌群的结构影响不大,便秘患者若长期服用刺激性泻药,部分患者可能会出现药物依赖、电解质紊乱等药物副作用。因此,在临床治疗便秘中,可以根据患者自身情况,选用益生菌制剂,通过调节肠道菌群的微生态平衡,或结合适当的化学药物进行治疗,改善患者临床症状。
利益冲突 声明在课题研究和文章撰写过程,没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道,不存在利益冲突
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