骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一组起源于造血干细胞的髓系克隆性疾病，具有较大的异质性，其临床表现及疾病预后存在明显差异。BCL2L10(B-cell lymphoma 2 like 10)基因属于Bcl-2家族成员，通过与Apaf-1结合阻断其与Bcl-XL形成复合物，从而引起细胞凋亡[1-2]。但也有研究认为BCL2L10为抗凋亡蛋白, 可以阻断由减少IL-3或Bax诱导的细胞凋亡。研究发现，BCL2L10表达受甲基化调控，其异常表达与血液系统恶性肿瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生、转移、耐药及预后密切相关[7]研究发现，在MDS和急性非淋巴细胞白血病中，BCL2L10表达升高与去甲基化药物抵抗相关。BCL2L10基因过表达可抑制急性髓系白血病细胞株HL-60增殖并促进细胞凋亡[8]。BCL2L10表达水平与MDS患者预后分层是否具有相关性尚不明确。本研究旨在探讨不同危险度分层的MDS患者骨髓细胞中BCL2L10表达水平及其启动子甲基化状态与疾病预后的关系。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2011年2月至2017年10月空军军医大学唐都医院收治的原发未治MDS患者56例(MDS组)，均符合维也纳诊断标准[9-10]，其中男性31例，女性25例，年龄20～89岁，中位年龄69岁，检测标本为科室液氮冻存的骨髓标本。患者进行MICM分类诊断，并按照2016年WHO修订的分型标准进行分型。另收集同期非白血病标本30例(非白血病对照组)，其中初诊未治缺铁性贫血18例(男性6例，女性12例，中位年龄54岁)，营养性贫血12例(男性7例，女性5例，中位年龄66岁)，检测标本为新鲜采集的骨髓标本。入组患者均按照MDS修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分系统)[11-12]对56例MDS患者进行评分，IPSS-R评分≤4.5定义为低/中危MDS组(low/median risk MDS，L/MR MDS)，IPSS-R评分＞4.5定义为高危MDS组(high risk MDS，HR MDS)。
1.2 骨髓标本中BCL2L10表达量检测RNA提取采用Qiagen总RNA提取试剂盒说明进行。应用TaKaRa逆转录试剂盒说明扩增cDNA，取1 μL cDNA作为模板，于ABI 7500荧光定量PCR仪上采用SYBR Green(TaKaRa公司)法检测BCL2L10表达量，以β-actin作为内参。记录各个反应管Ct值，使用2-△△Ct对结果进行相对定量分析。
1.3 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测基因组DNA提取参照Qiagen公司DNA提取试剂说明书进行。利用UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)查询并分析BCL2L10基因序列，参考文献[13]，分别设计并合成BCL2L10基因启动子区CpG岛甲基化和非甲基化引物(表 1)。
| 基因 | 基因组位置 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度/bp |
| BCL2L10-M(正向) | -70 | AATATATCGGGGGTCGGGGGTC | 180 |
| BCL2L10-M(反向) | +110 | AACTCGATACGCTCCCGCAACG | |
| BCL2L10-U(正向) | -70 | AATATATTGGGGGTTGGGGGTT | 186 |
| BCL2L10-U(反向) | +116 | AACAACAACTCAATACACTCCCA |
基因组DNA亚硫酸氢化处理：采用CpGenomeTM DNA 修饰试剂盒(Chemicon International Inc.)，获得修饰后的DNA片段进一步采用Promega公司DNA纯化试剂盒纯化。BCL2L10基因启动子区甲基化PCR：反应在9700 PCR仪(Applied Biosystems)上进行，总反应体系25 μL，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTP，0.4 μmol/L上下游引物，GoldTM DNA Polymerase(Thermo Fisher)1 U，模板DNA 2 μL。反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃ 30 s，62 ℃(甲基化)/59 ℃(非甲基化)30 s，72 ℃ 60 s，循环40次，72 ℃延伸8 min。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察条带位置并照相。
1.4 统计学分析采用SPSS19.0统计软件，BCL2L10基因表达水平差异比较采用z检验和t检验，两组间阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义
2 结果 2.1 两组患者骨髓组织中BCL2L10基因表达差异采用real-time PCR方法对比分析了非白血病对照组患者与MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达水平，发现与30例非白血病对照组患者相比，MDS患者BCL2L10基因表达水平降低(P＜0.05，图 1)。
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| a: P<0.05，与非白血病对照组比较 图 1 非白血病对照组与MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达水平 |
2.2 BCL2L10基因表达水平与MDS患者危险度的关系
56例MDS患者按照MDS修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分系统)分为低/中危MDS组(IPSS-R评分≤4.5)33例，高危MDS组(IPSS-R评分＞4.5)23例。与非白血病对照组相比，低/中危MDS组患者骨髓标本BCL2L10基因表达水平无明显差异(P>0.05)，而高危MDS组患者骨髓标本中BCL2L10基因表达显著低于非白血病对照组和低/中危组MDS患者(P＜0.05，图 2)。
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| a: P<0.05，与非白血病对照组和低/中危MDS组比较 图 2 不同危险度分层MDS患者骨髓组织中BCL2L10基因表达 |
2.3 用甲基化特异性PCR检测MDS患者BCL2L10 基因启动子区甲基化状态
30例非白血病对照组患者骨髓标本中，11例(36.67%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图 3A)；56例MDS患者骨髓标本中，23例(41.07%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化，33例低/中危MDS组有10例(30.30%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图 3B)；而23例高危MDS组有13例(56.52%)检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(图 3C)。高危MDS组患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率显著高于非白血病对照组和低/中危MDS组(P＜0.05)。
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| a: A：非白血病对照组；B：低/中危MDS组；C：高危MDS组；U-MSP：非甲基化；MSP：甲基化 图 3 非白血病对照组患者与MDS患者BCL2L10基因启动子区甲基化状态检测 |
2.4 BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者临床特征之间的关系
如表 2所示，BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的年龄、性别均无统计学差异(P>0.05)，与MDS患者骨髓原始细胞比例具有明显的相关性(P＜0.05)，24例原始细胞比例≤5%的MDS标本中，5例检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(阳性率20.83%)，在32例原始细胞比例＞5%的MDS标本中，18例检测到BCL2L10基因启动子区甲基化(阳性率56.25%)，提示BCL2L10基因启动子区甲基化状态与骨髓组织中原始细胞比例密切相关(P＜0.05，表 2)。BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的危险度分层密切相关，高危组MDS患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率显著高于低/中危组MDS患者(χ2=3.85，P＜0.05)及非白血病对照组患者(χ2=4.91，P＜0.05)，而低/中危组MDS患者骨髓中BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率与非白血病对照＞0.05)。
| 临床特征 | 例数 | BCL2L10基因启动子甲基化+ | BCL2L10基因启动子甲基化- | χ2值 | P值 |
| 年龄/岁 | |||||
| ＜60 | 19 | 7 | 12 | 0.21 | ＞0.05 |
| ≥60 | 37 | 16 | 21 | ||
| 性别 | |||||
| 男 | 31 | 11 | 20 | 0.90 | ＞0.05 |
| 女 | 25 | 12 | 13 | ||
| 原始细胞比例 | |||||
| ≤5% | 24 | 5 | 19 | 7.11 | ＜0.05 |
| ＞5% | 32 | 18 | 14 | ||
| 危险度分层 | |||||
| 低/中危MDS组 | 33 | 10 | 23 | 3.85 | ＜0.05 |
| 高危MDS组 | 23 | 13 | 10 |
2.5 BCL2L10基因表达水平与生存期的关系
56例MDS患者中，24例未给予去甲基化药物治疗。将24例患者BCL2L10表达量的中位值作为阈值分为高表达组和低表达组，对两组患者3年总生存率(overall survival，OS)进行统计分析发现，BCL2L10高表达组3年生存率为83.3%，低表达组仅为50.0%，两组比较差异无统计学意义(P=0.072，图 4A)。同时采用GEPIA数据库对BCL2L10在急性髓系白血病中进行预后比较，同样发现低表达组的预后较高表达组差，但差异无统计学意义(P=0.084，图 4B)。
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| A：MDS患者3年生存曲线；B：GEPIA数据库中BCL2L10基因表达水平对患者生存的影响 图 4 BCL2L10基因表达水平与MDS患者总生存率的关系 |
3 讨论
BCL2L10，也称为Diva、Bcl-b或Boo，是Bcl-2蛋白质家族的成员，广泛参与调节细胞凋亡和自噬的信号通路[1-14]，但BCL2L10基因在恶性肿瘤中的功能尚不完全一致，NAUMANN等[15]发现，BCL2L10与Bcl-2家族蛋白功能类似，通过与APAF-1结合，抑制人神经胶质瘤细胞凋亡。与之相反，在胃癌、AML中，BCL2L10基因作为促凋亡基因，抑制肿瘤的进展[16]。本研究检测56例MDS患者及30例非白血病对照组患者骨髓细胞中BCL2L10基因表达及其启动子甲基化情况。发现MDS患者BCL2L10基因表达水平较非白血病对照组患者降低，在41.0%的MDS患者骨髓细胞中检测到BCL2L10启动子甲基化，并与其低表达相关，表明启动子甲基化导致的BCL2L10沉默可能参与了MDS发生发展的关键步骤。
VOSO等[17]研究发现，BCL2L10基因启动子高甲基化的MDS患者其IPSS评分多为高危组，且表现为预后差、易转向AML转化、总生存期短等特征。因此，本研究按照IPSS-R评分系统将56例MDS患者进行分组，并分别对比分析了不同危险度分层的MDS患者BCL2L10基因表达差异及其启动子甲基化状态，发现高危组MDS患者骨髓标本中BCL2L10基因表达水平显著低于非白血病对照组患者和低/中危组MDS患者，而高危组MDS患者BCL2L10基因启动子甲基化阳性率较非白血病对照组和低/中危组明显升高，提示该基因表达水平及其启动子甲基化状态可作为MDS诊断的分子标记、预后判断及治疗靶点。
2018年美国NCCN关于MDS诊疗指南中，明确将地西他滨、阿扎胞苷等去甲基化药物作为高危组MDS患者治疗的首选药物[18]。MIKATA等[16]研究发现，使用1 μmol/L地西他滨处理胃癌细胞24 h，可引起BCL2L10 基因启动子区CpG岛发生去甲基化，BCL2L10蛋白表达升高，从而引起胃癌细胞发生凋亡，因此BCL2L10 基因是地西他滨作用靶标之一。地西他滨能够逆转对阿霉素耐药的HL-60/ADR的耐药性，并提高Kasumi-1对化疗药物的敏感性，并且对于复发/难治的急性非淋巴细胞白血病患者，将地西他滨作为化疗前预处理药物，可以增强患者对化疗药物的敏感性，提高总生存，改善患者预后[19]。本研究也证实采用地西他滨治疗的MDS患者中，BCL2L10高表达组患者3年OS高于BCL2L10高表达组患者，尽管没有统计学意义，可能与纳入的患者数较少有关。BCL2L10 基因作为地西他滨作用的重要靶基因之一，其甲基化水平决定了去甲基化药物的治疗效果和临床反应，本研究为MDS临床治疗提供了重要的理论依据。
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