2. 404000 重庆, 重庆市三峡中心医院检验科
2. Department of Clinical Laboratory, Chongqing Three Gorges Central Hospital, Chongqing, 404000, China
新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS- CoV-2)引起的肺炎[1-3]。至2020年4月22日, 全球已累计报告COVID-19 2 475 723例, 其中死亡169 151例[4]。一般病毒在感染机体后, 免疫系统会对病毒进行免疫防御并产生特异性抗体。其中特异性免疫球蛋白M(IgM)抗体是机体感染后早期产生的抗体, 可提示现行感染或新近感染。特异性免疫球蛋白G(IgG)抗体是再次免疫应答产生的主要抗体, 提示病情进入恢复期或存在既往感染。因此, SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测不仅可以对感染性疾病进行早期诊断, 而且有助于对机体感染阶段的评估。据中华人民共和国国家卫生健康委员会于3月3日《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第7版)》, 除采用RT-PCR或/和高通量测序技术(NGS)方法在各类采样标本中检出新型冠状病毒核酸, 也提出了新型冠状病毒特异性抗体的检出有助于该疾病的诊断[5], 然而该方法学在临床的诊断价值尚未可知。本研究通过分析渝东北片区新冠肺炎集中救治中心所在地重庆三峡中心医院百安分院收治的COVID-19确诊患者和重庆医科大学附属第一医院收治的非新型冠状病毒肺炎患者及健康献血者的特异性抗体检出率来探索其临床诊治价值。
1 资料与方法 1.1 研究对象选择重庆三峡中心医院应急肺炎病区于2020年1月23日至2020年3月3日收治的203例确诊COVID-19患者; 2月7日就诊于该院发热门诊但未被确诊为COVID-19的20例患者; 2020年3月6日在重庆医科大学附属第一医院就诊的138例非COVID-19患者, 其中住院患者32例、门诊患者106例; 以及50例健康献血者, 研究对象合计411例, 将203例确诊COVID-19患者列为确诊组, 208例未被确诊为COVID-19的研究对象设为对照组。年龄(1~87)47岁。所有患者按照临床医嘱进行了SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测, 50例健康献血者血浆来源于三峡中心医院医院输血科, 同样进行了抗体检测。COVID确诊患者抗体检测时间点为发病后(13.0±6.3)d。收集患者的一般临床资料, 包括性别、年龄、临床表现以及COVID-19患者发病时间(以首次出现临床症状为发病第1天, 未出现临床症状的患者以确诊当天为发病第1天)等。本研究经重庆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准(批准文号:20200601)。由于疫情的特殊原因, 未获得患者的知情同意。
1.2 诊断及分型标准患者均按照国家卫生健康委员会颁发的《新型冠状病毒肺炎诊治方案(试行第6版)》进行确诊及分型。即在疑似的基础上经过实时荧光RT-PCR新型冠状病毒核酸检测确诊。
1.2.1 仪器与试剂新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法, 国械注准20203400182、20203400183), 化学发光免疫分析仪Axceed260均来自博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司。该试剂盒将SARS-CoV-2的核蛋白和S蛋白的一个肽段作为重组抗原, 采用间接法原理检测人血清样本中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体, 将试剂0、试剂1和样品加入到反应中, 若标本中含有新型冠状病毒IgM/IgG抗体, 则与以上试剂中的重组抗原形成复合物, 同时结合到磁性颗粒上, 洗掉游离成分, 再将试剂2加入到反应管中, 形成碱性磷酸酶标记的抗体成为二抗, 与样本中的IgM/IgG抗体结合, 并形成碱性磷酸酶标记抗体-IgM/IgG抗体-重组抗原-磁性颗粒复合物, 洗掉游离成分, 加入化学发光底物, 测定每个样本管发光值(relative light unit, RLU)。样本管的发光值与其中的IgM/IgG抗体浓度呈正相关, 从而检测人血清中的IgM/IgG抗体。
1.2.2 标本采集所有研究患者均采集空腹静脉血5 mL, 置于含分离胶的黄头真空采血管内, 待血液凝固后, 2 725×g离心5 min, 于56 ℃, 30 min进行病毒灭活后取血清备用。同样收集健康献血者50 μL血浆备用。
1.3 血清学检测血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测采用全自动化学发光免疫分析技术, 取20 μL血清加入1 mL稀释液中置于化学发光免疫分析仪Axceed260进行自动检测, 检测步骤严格参照试剂盒说明书, 测试结果以相对发光强度(RLU)表示。样本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗体的量和RLU之间呈正相关, 样本S/CO=样本发光值/cut-off, 以S/CO < 1.0, 检测结果判为阴性; 以S/CO≥1.0, 检测结果判为阳性。病毒核酸检测由经过专业培训的检验人员严格按照试剂说明书进行检测和结果报告。
1.4 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理。计数资料进行χ2检验, 计量资料选用独立样本t检验或非参数检验进行统计学分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体诊断新型冠状病毒肺炎的敏感性在203例新型冠状病毒肺炎患者中, SARS-CoV-2 IgG抗体阳性174例, 阴性29例, 临床敏感性为85.7% (174/203);SARS-CoV-2 IgM抗体阳性135例, 阴性68例, 临床敏感性为66.5%(135/203);SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测阳性182例, 阴性21例, 临床敏感性为89.6%(182/203), 见表 1、2。在轻症与危/重症组中, SARS-CoV-2 IgG抗体检测的敏感性分别为85.5%(154/180)、86.9%(20/23), 差异无统计学意义(P=1.00);SARS-CoV-2 IgM抗体检测的敏感性分别为66.6%(120/180)、65.2%(15/23), 差异无统计学意义(P=0.89), 结果见表 3, 但轻症组自发病以后的平均检测时间为13.3 d, 长于重症组的10.8 d, 差异有统计学意义(P=0.017), 说明在检出率无差异的前提下, 危/重症患者能更早地检测到IgM和IgG抗体, 结果见表 3。结果显示, SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测在新型冠状病毒肺炎中具有良好的检出性能, 能够弥补病毒核酸检测的不足, 同时危重型及重型能更早地检测到SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体。
抗体 | 确诊组 | 对照组 | 敏感性(%) | 特异性(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) | |||
阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | ||||||
IgG | 174 | 29 | 2 | 206 | 85.7(174/203) | 99.0(206/208) | 98.8(174/176) | 87.6(206/235) | |
IgM | 135 | 68 | 4 | 204 | 66.5(135/203) | 98.0(204/208) | 97.1(135/139) | 75.0(204/272) | |
IgG联合IgM | 182 | 21 | 5 | 203 | 89.6(182/203) | 97.5(203/208) | 97.3(182/187) | 90.6(203/224) |
分型 | G+M+ | G+M- | G-M+ | G-M- | 敏感性(%) | 检测时间/d | |
IgG | IgM | ||||||
重症与危重症型 | 15 | 5 | 0 | 3 | 86.9(20/23) | 65.2(15/23) | 10.8±4.1 |
普通型 | 112 | 42 | 8 | 18 | 85.5(154/180) | 66.6(120/180) | 13.3±6.4 |
2.2 SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体诊断新型冠状病毒肺炎的特异性
对照组208例研究对象中50例为健康献血者, 另外158例患者经过流行病史筛查、影像以及结合临床症状或者病毒核酸检查排除COVID-19。SARS-CoV-2 IgG抗体阳性2例, 阴性206例, 临床特异性为99.0% (206/208);SARS-CoV-2 IgM抗体阳性4例, 阴性204例, 临床特异性为98.0%(204/208);SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测阳性5例, 阴性203例, 特异性为97.5%(203/208)。见表 1、4。结果显示SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体检测的特异性均在97.0%以上, 动态监测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体可用于COVID-19的临床鉴别诊断。
2.3 SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体诊断新型冠状病毒肺炎阳性及阴性预测值
在411例研究对象中, SARS-CoV-2 IgG抗体阳性176例中有174例确诊为新型冠状病毒肺炎, 阳性预测值为98.9%(174/176), SARS-CoV-2 IgG抗体阴性235例中有206例未被确诊为新型冠状病毒肺炎, 阴性预测值为87.6%(206/235);SARS-CoV-2 IgM抗体阳性139例中有135例确诊为新型冠状病毒肺炎, 阳性预测值为97.1%(135/139), SARS-CoV-2 IgM抗体阴性272例中有204例未被确诊为新型冠状病毒肺炎, 阴性预测值为75.0%(204/272);SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测阳性187例中182例被确诊为COVID-19, 阳性预测值为97.3%(182/187), 检测阴性224例中有203例未被确诊为新型冠状病毒肺炎, 阴性预测值90.6%(203/224), 见表 1。
2.4 抗体检测的时间及淋巴细胞亚型对检测结果的影响203例确诊患者IgG阴性组的中位检测时间为发病后7.0(5.0~12.0)d, 早于IgG阳性组的13.5(10.0~ 17.0)d, 差异具有统计学意义(P=0.000 1);IgM阴性组的中位检测时间为发病后11.0(6.0~16.0)d, 早于IgM阳性组的14.0(10.0~17.0)d, 差异具有统计学意义(P=0.016), 同时我们也发现IgG阳性组和IgM阳性组的检测时间基本一致, 说明抗体结果主要受检测时间的影响, 而IgM和IgG可能同时出现, 见表 5。在发病后抗体检测时间无统计学差异的21例SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体双阴性及29例SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体双阳性患者的淋巴细胞亚型进行分析发现两者的淋巴细胞计数、总T淋巴细胞、CD4细胞、CD8细胞、总B淋巴细胞、自然杀伤细胞差异均无统计学意义, 结果见表 6。
抗体 | 检查结果 | n | 检测时间/d |
阴性 | 29 | 7.0(5.0, 12.0) | |
IgG | 阳性 | 174 | 13.5(10.0, 17.0) |
P值 | 0.000 1 | ||
阴性 | 68 | 11.0(6.0, 16.0) | |
IgM | 阳性 | 135 | 14.0(10.0, 17.0) |
P值 | 0.016 | ||
总体 | 203 | 13.0(8.5, 17.0) |
抗体分组 | 例数 | 发病后抗体检测时间/d | 淋巴细胞/个 | 总T淋巴细胞/个 | CD4细胞/个 | CD8细胞/个 | 总B淋巴细胞/个 | 自然杀伤细胞/个 |
G-M- | 21 | 7.0±4.5 | 1 210±698 | 861±557 | 475±327 | 339±224 | 192±134 | 149±94 |
G+M+ | 29 | 7.2±3.2 | 1 023±348 | 721±285 | 1 210±699 | 418±183 | 138±87 | 149±83 |
P值 | 0.329 | 0.217 | 0.253 | 0.423 | 0.281 | 0.95 | 0.991 |
3 讨论
自新型冠状病毒肺炎暴发以来, 已对我国人民群众的生命健康产生了极大的影响。根据目前研究和流行病学报道, 现有确诊依据依然为呼吸道样本中检出病毒核酸, 但是SARS-CoV-2主要存在于下呼吸道, 而鼻咽拭子因为易采集及患者的接受度高, 为目前最常用的标本[6-7]。此外由于核酸试剂盒的质量参差不齐、操作人员之间的差异等多因素影响, 容易造成漏检, 如本研究中就有1例发热门诊患者的SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体检测均为阳性, 但5次核酸检测结果均为阴性。按照2020年3月3日国家卫生健康委印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第7版)》的标准, 即血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体同时阳性, 血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高作为新型冠状病毒肺炎的确诊标准之一[5], 如果该患者有肺部影像学表现及相关流行病史再结合其发热症状, 就可以被确诊为新型冠状病毒感染。这表明SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体检测可以作为病毒核酸检测漏检的有效补充方法。
在本研究中, 就诊于发热门诊的患者中出现了2例IgM阳性, 其S/CO值分别为1.492、1.397, 仅比临界值(S/CO=1)高出不到0.5, 且经过4次冠状病毒核酸检测都为阴性, 最终未被确诊为新型冠状病毒肺炎, 此假阳性可能由于试剂本身原因造成。在其他疾病组中, 有1例76岁的老年男性出现了IgM阳性, 经过金标法检测依然为阳性, 该患者患糖尿病足、骨髓炎, 肺部仅为陈旧性病变。另有1例68岁的老年女性出现了IgG阳性, 该患者5年前患有多发性骨髓瘤且其IgAλ型M蛋白阳性, 表明伴有严重糖尿病或者浆细胞性疾病有可能导致SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体的假阳性, 因各仅1例, 还需要进一步深入研究。同时也有资料显示自身抗体、异嗜性抗体等也可能导致SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体假阳性[8]。
本研究中新型冠状病毒肺炎确诊患者共有21例患者IgM抗体和IgG抗体均为阴性, 其中轻症18例, 重症3例, 这些患者均在症状出现后的14 d内, 平均7.0 d内进行了抗体检测。且在距离发病时间平均13.7 d出现了SARS-CoV-2 IgG抗体阳性, 这与LI等[9]报道的20例SARS患者在症状出现的第1周以内特异性IgM抗体和IgG抗体均为阴性基本一致。有研究表明新型冠状病毒感染后SARS-CoV-2抗原可在1~5 d产生, 其IgM抗体在5~7 d产生, 而IgG抗体可在10~15 d产生[10]。但是本研究中发现IgG阳性和IgM阳性的中位检测时间基本一致, 表明SARS-CoV-2 IgG和IgM可能是同时产生。但由于未对抗体进行连续监测, 需要进一步的研究证实。因此SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体检测结果的解读需要结合发病时间, 在发病时间14 d内若两者均出现了阴性也不能排除该患者患有COVID-19。本研究还发现抗体检测时间距离发病时间无统计学差异时, SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体双阴性及SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体双阳性患者之间淋巴细胞计数、总T淋巴细胞、CD4细胞、CD8细胞、总B淋巴细胞、自然杀伤细胞差异并无统计学意义, 但由于病例偏少, 且不知道患者首次病毒核酸检测阳性时的病毒载量, 需要进一步研究来探索机体免疫力对抗体产生的影响。
徐万洲等[8]评价了深圳亚辉龙生物科技股份有限公司的SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体检测试剂盒(化学发光法)对武汉地区新型冠状肺炎的诊断价值, 其中SARS-CoV-2 IgM和IgG的临床敏感度分别为70.24%和96.10%;临床特异度分别为96.20%和92.41%, 且在所有SARS-CoV-2 IgM阳性病例中, 其IgG也全部阳性。本研究的SARS-CoV-2 IgG和IgM的敏感性分别为85.7%和66.5%, 特异性分别为99.0%和98.0%, 且135例IgM阳性病例中有8例IgG为阴性。由于两个研究采用了不同的试剂厂商, 且重庆市万州地区疫情较轻, 大部分患者在疾病早期就能够被确诊, 并尽快收治住院。本研究的中位检测时间为发病后13.0(8.5~17.0)d, 对患者进行抗体检测的时间早于疫情严重且医疗资源有限的武汉地区。所以本研究中SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体敏感性会偏低。同时特异性偏高除与试剂本身有关以外, 也可能与重庆地区的确诊病例偏少, 人群中无意接触到少量冠状病毒的机会少有关, 因为在50例健康献血者血浆标本中均未检出SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体。本研究中174例IgG阳性病例中有47例IgM为阴性, IgG及IgM均阳性和IgG阳性IgM阴性的检测时间差异并无统计学意义, 其平均检测时间均为13.7 d, 这除因试剂盒本身原因以外, 可能是IgM消失太快, 需要进一步的研究证明。
本研究总体病例偏少, 且临床诊断病例仅限于湖北地区, 同时未能对抗体进行动态监测, 无法探知SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测在病毒核酸检测假阴性的诊断价值以及它们的出现、消失规律。总之, 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒(磁微粒化学发光法)采用全自动化学发光仪器自动检测血清样本中的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体, 相较于病毒核酸检测, 具有操作方便、快速、生物安全高、样本均质性好等优点。其高敏感性和特异性可以弥补病毒核酸检测的不足, 同时发病后的检测时间是影响抗体产生的主要因素, 所以在解读其结果时应结合临床表现、流行病学史、影像及发病时间等综合考虑。而更早地检测到IgG和IgM抗体可能预示着疾病更加严重。如果SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体能广泛用于COVID-19的诊断、病情预测、治疗监测等方面将进一步提高COVID-19的诊治并改善其预后。
[1] |
ZHU N, ZHANG D Y, WANG W L, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019[J]. N Engl J Med, 2020, 382(8): 727-733. DOI:10.1056/NEJMoa2001017 |
[2] |
LU H Z, STRATTON C W, TANG Y W. Outbreak of pneumonia of unknown etiology in Wuhan, China: The mystery and the miracle[J]. J Med Virol, 2020, 92(4): 401-402. DOI:10.1002/jmv.25678 |
[3] |
HUANG C L, WANG Y M, LI X W, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China[J]. Lancet, 2020, 395(10223): 497-506. DOI:10.1016/S0140-6736(20)30183-5 |
[4] |
WHO. Coronavirus disease(COVID-19) pandemic[EB/OL].[2020-04-23]. |
[5] |
国家卫生健康委办公厅, 国家中医药管理局办公室.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)[EB/OL].[2020-03-04]. |
[6] |
CATHARINE I P, HILARY D M, ANTHONY S F. Coronavirus infections—more than just the common cold[J]. JAMA, 2020, 323(8): 707-708. DOI:10.1001/jama.2020.0757 |
[7] |
CHEN D B, XU W X, LEI Z Y, et al. Recurrence of positive SARS-CoV-2 RNA in COVID-19: a case report[J]. Int J Infect Dis, 2020, 93: 297-299. DOI:10.1016/j.ijid.2020.03.003 |
[8] |
徐万洲, 李娟, 何晓云, 等. 血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(3): 230-233. XU W Z, LI J, HE X Y, et al. Diagnostic value of combined detection of serum 2019 new coronavirus IgM and IgG antibodies in new coronavirus infection[J]. Chin J Lab Med, 2020, 43(3): 230-233. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2020.03.007 |
[9] |
LI G, CHEN X J, XU A L. Profile of specific antibodies to the SARS-associated coronavirus[J]. N Engl J Med, 2003, 349(5): 508-509. DOI:10.1056/NEJM200307313490520 |
[10] |
ZHOU P, YANG X L, WANG X G, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 579(7798): 270-273. DOI:10.1038/s41586-020-2012-7 |