2. 400016 重庆, 重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室
2. Department of Pathophysiology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一类高致死率高致残率的卒中亚型，目前对其发病机制和治疗手段的研究均十分有限[1]。近年来，针对ICH后继发性脑损伤治疗成为ICH研究的重点。研究表明免疫炎症反应在继发性脑损伤中扮演重要角色[2]。在ICH发生后，炎性细胞浸润以及小胶质细胞的活化导致大量促炎因子的释放，从而引起级联的炎症反应，导致神经细胞死亡和组织损伤[3-4]。因此，针对ICH后炎症反应的研究可能为ICH提供新的治疗靶点。
柚皮素(naringenin，NGN)属于黄酮类化合物黄烷酮类。研究证明柚皮素可以发挥多种生理学作用，包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤的作用[5-7]。多项研究表明柚皮素具有抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α、NF-κB介导的信号通路，抑制白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等促炎因子的表达，从而抑制炎症反应，参与了多项炎症疾病的病理过程[8-10]。此外柚皮素可改善大鼠缺血性脑卒中后神经功能缺损、脑水肿[11-12]。然而，柚皮素在ICH后的作用尚未见报道。
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)-δ是一种炎症调节因子。它可以调节转录因子NF-κB以及促炎基因(如IL-1β、IL-6)表达的激活、细胞因子和趋化因子的分泌，以及活性氧(ROS)的产生[13]。有研究发现在大鼠ICH后，脑组织内PKC-δ明显升高且介导了脑出血后的炎性损伤[14]。由此可见，PKC-δ可能是ICH后炎症反应的关键调节因子。本研究将探讨柚皮素对大鼠ICH后炎症损伤的作用以及其机制是否与PKC-δ的磷酸化有关。
1 材料与方法 1.1 动物及ICH模型SPF级成年雄性SD大鼠(体质量250~300 g)购自重庆医科大学实验动物中心，动物实验由重庆医科大学伦理委员会批准(2017-11-15)。将SD大鼠采用随机数表法分为假手术组(手术18只，成功18只)、ICH模型组(手术19只，成功18只)、ICH+DMSO+PEG400组(手术20只，成功18只)、ICH+NGN低剂量组(10 mg/kg)(手术14只，成功12只)、ICH+NGN中剂量组(20 mg/kg)(手术18只，成功18只)、ICH+NGN高剂量组(40 mg/kg)(手术12只，成功12只)、ICH+DMSO组(手术6只，成功6只)、ICH+PKC-δ激活剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)组(手术8只，成功6只)、ICH+PMA+NGN组(手术7只，成功6只)。
按照文献报道的ICH模型建立方法[15]，将SD大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德)，随后将从大鼠股动脉抽取的50 μL自体血缓慢注入大鼠右侧基底节(前囟后0.2 mm，旁开3.0 mm，深5.8 mm)，留针10 min防止血液流出，随后取出针头，缝合头皮，将手术后大鼠置于37 ℃恒温毯上直至苏醒，给予水和食物。假手术组按照相同方法插入针头但不注入血液。总共建立了104例大鼠ICH模型，成功96例，成功率为92.3%。
1.2 给药NGN(Sigma-Aldrich，W530098)依次溶于DMSO及PEG400(1 :4)，终浓度为3 mg/mL。于ICH术后1 h按照低剂量组(10 mg/kg)、中剂量组(20 mg/kg)、高剂量组(40 mg/kg)腹腔注射给药。NGN溶剂对照组给予相同剂量的DMSO+PEG400。PMA(MedChem-Express，HY-18739)溶于DMSO(50 mg/mL)，于ICH术前12 h侧脑室注射PMA(200 μg/kg)[16]。PMA溶剂对照组给予相同剂量的DMSO。
1.3 神经功能评分于ICH术后24 h分别对各组大鼠采用Modified Garcia评分[17]，评分越低，神经损伤越重。
1.4 脑含水量测定按照文献[4]方法，在ICH术后24 h，将大鼠在麻醉状态下断头取脑，随即称取脑组织质量得到湿质量。将得到的脑组织置于冷凝干燥箱中干燥24 h后，称取脑组织质量得到干质量。脑含水量由以下公式计算得到：脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量。
1.5 HE染色ICH术后24 h，将大鼠在麻醉状态下顺序心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛溶液，然后迅速断头取脑并在4%多聚甲醛溶液中固定。将固定后的脑组织石蜡包埋、切片并进行染色。将HE染色切片置于光学显微镜下观察并采集图像。
1.6 Westernblot ICH术后24 h，将大鼠在麻醉状态下断头取脑，血肿周围脑组织提取总蛋白。将提取的总蛋白于SDS-PAGE胶上电泳并电转到PVDF膜(Millipore)上。随后，用脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜。使用的一抗如下：抗PKC-δ(1 :1 000，# 2058S，Cell Signaling Technology)，抗Phospho-PKC-δ (Tyr311) (1 :1 000，# 2055S，Cell Signaling Technology)，抗NF-κB(1 :500，AF5006, Affinity Biosciences)，抗IL-1β(1 :500, AF4006, Affinity Biosciences)，抗IL-6(1 :500, A0286, ABClonal)，抗β-actin(1 :3 000，66009-1-Ig，Proteintech Group, lnc.)。一抗孵育结束后，洗膜并用相应的二抗室温孵育2 h，使用的二抗如下：羊抗兔IgG (1 :3 000, S0001, Affinity Biosciences)，羊抗鼠IgG (1 :3 000, S0002, Affinity Biosciences)。蛋白特异显影在Bio-Rad Gel Doc Imager(Bio-Rad)上进行。
1.7 统计学分析所有数据以x±s表示。用GraphPad Prism 7和Microsoft excel 2016软件进行统计分析。样本之间的比较采用单因素方差分析或非配对t检验。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 NGN提高了大鼠ICH后神经功能评分ICH后24 h，对各组大鼠进行Modified Garcia评分。与假手术组相比，ICH组神经功能评分明显降低，而ICH组和ICH+DMSO+PEG400组神经功能评分无统计学差异，提示溶剂对照不影响药物处理的结果。与ICH组和ICH+DMSO+PEG400组相比，ICH+NGN低剂量组神经功能评分有所提高(P < 0.05)，而ICH+NGN中剂量组、ICH+NGN高剂量组神经功能评分显著提高(P < 0.01, 图 1A)。结果提示中剂量和高剂量NGN能显著提高大鼠ICH后神经功能评分。
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| 1：假手术组；2：ICH组；3：ICH+DMSO+PEG400组；4：ICH+NGN低剂量组；5：ICH+NGN中剂量组；6：ICH+NGN高剂量组A：大鼠ICH后Modified Garcia评分；B大鼠ICH后脑含水量测定a：P < 0.05，b：P < 0.01，与ICH组比较；C：大鼠ICH后脑组织HE染色观察结果 图 1 NGN改善了大鼠ICH后的神经功能评分、脑含水量和神经元变性死亡(n=6, x±s) |
2.2 NGN降低了大鼠ICH后脑含水量
ICH后24 h，对各组大鼠脑组织进行含水量测定。与假手术组相比，ICH组脑含水量明显增加，而ICH组和ICH+DMSO+PEG400组脑水含量差异无统计学意义，提示溶剂对照不影响药物处理的结果。与ICH组和ICH+DMSO+PEG400组相比，ICH+NGN低剂量组脑含水量有所降低(P < 0.05)，而ICH+NGN中剂量组、ICH+NGN高剂量组脑含水量显著降低(P < 0.01, 图 1B)。结果提示中剂量和高剂量NGN能显著降低大鼠ICH后脑水含量。
2.3 NGN减少了大鼠ICH后神经元变性死亡ICH后24 h，对各组大鼠脑组织进行HE染色。HE染色结果显示，与假手术组相比，ICH组神经元变性死亡数量明显增多，而ICH组和ICH+DMSO+PEG400组HE染色无明显差异，提示溶剂对照不影响药物处理的结果。与ICH组和ICH+DMSO+PEG400组相比，ICH+NGN低剂量组神经元变性坏死数量有所减少，而ICH+NGN中剂量组、ICH+NGN高剂量组神经元变性坏死数量显著减少(图 1C)。结果提示中剂量和高剂量NGN能显著减少大鼠ICH后神经元变性坏死。
2.4 NGN降低了大鼠ICH后PKC-δ的相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的表达ICH后24 h，取大鼠血肿周围脑组织进行检测PKC-δ的磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6。Western blot结果显示，与假手术组相比，ICH组的PKC-δ相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平均明显升高(P < 0.01)，而ICH组和ICH+DMSO+PEG400组无统计学差异。根据2.1~2.3的结果，选用中剂量NGN作为给药组，结果显示，与ICH组和ICH+DMSO+PEG400组相比，ICH+NGN中剂量组的PKC-δ相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平均显著降低(P < 0.01, 图 2)。该结果表示NGN可降低大鼠ICH后脑组织内炎症因子表达。
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| 1：假手术组；2：ICH组；3：ICH+DMSO+PEG400组；4：ICH+NGN中剂量组A：Western blot检测大鼠ICH后PKC-δ、Phospho PKC-δ、NF-κB、IL-1β、IL-6的表达；B：PKC-δ的相对磷酸化水平；C~E：分别为NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与ICH组比较 图 2 NGN降低了大鼠ICH后PKC-δ的相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达(n=6，x±s) |
2.5 增加大鼠ICH后PKC-δ的磷酸化可升高NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达
为进一步验证PMA对PKC-δ的磷酸化激活的效果，以及PKC-δ磷酸化增加之后对大鼠ICH后下游炎症因子的影响，在ICH后24 h，取大鼠血肿周围脑组织进行检测PKC-δ的磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6。Western blot结果显示，与ICH组相比，ICH+PMA组的PKC-δ相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达均显著升高(P < 0.01, 图 3A~E)，而ICH组和ICH+DMSO组无统计学差异。该结果表示增加大鼠ICH后PKC-δ的磷酸化水平可提高大鼠ICH后脑组织内炎症因子表达。
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| 1：假手术组；2：ICH组；3：ICH+DMSO组；4：ICH+PMA组A：Western blot检测大鼠ICH后PKC-δ、Phospho PKC-δ、NF-κB、IL-1β、IL-6的表达；B：PKC-δ的相对磷酸化水平；C~E：分别为NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平；a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与ICH组比较 图 3 PMA增加了大鼠ICH后PKC-δ的相对磷酸化水平以及NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达(n=6，x±s) |
2.6 NGN降低大鼠脑出血后炎症可能与抑制PKC-δ的磷酸化水平有关
Western blot结果显示，与ICH组相比，ICH+NGN中剂量组的NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平降低(P < 0.01)，与ICH+NGN中剂量组相比，ICH+PMA+NGN组的NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平显著升高(P < 0.01, 图 4A~D)。该结果表示增加PKC-δ的磷酸化水平可逆转NGN的降低大鼠ICH后NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平的效应，提示NGN降低大鼠ICH后炎症反应可能与抑制PKC-δ的磷酸化水平有关。
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| 1：ICH组；2：ICH+NGN中剂量组；3：ICH+PMA+NGN组A: Western blot检测大鼠ICH后NF-κB、IL-1β、IL-6的表达；B~D:分别为NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达水平；a：P < 0.01，与ICH组比较；b：P < 0.01，与ICH+NGN中剂量组比较 图 4 NGN通过抑制PKC-δ的磷酸化来降低大鼠脑出血后NF-κB、IL-1β、IL-6的相对表达(n=6，x±s) |
3 讨论
中药成分在缺血性脑卒中的应用逐渐趋于成熟，然而，在ICH中的应用研究较少[18]。鉴于ICH的高致死率、高致残率，以及目前治疗手段的限制，深入探究中药成分对ICH的治疗作用及其机制十分必要。ICH后的继发性脑损伤包括炎症反应、氧化应激、血脑屏障破坏等[2, 19-20]，而NGN在与炎症相关的多种疾病中具有不同程度缓解疾病的作用，包括败血症、急性肝炎、恶性肿瘤[7-8]。研究发现，NGN可能通过抑制前列腺素E2和NO从而对内毒素引起的大鼠眼色素层炎症具有改善的作用[21]。2项在大鼠缺血性脑卒中模型中的独立研究发现NGN在缺血性脑卒中的大鼠模型中具有改善神经功能、降低脑水肿的作用[11-12]，分别从氧化应激、神经凋亡的角度解释NGN改善脑卒中后损伤的机制。本研究首次在ICH模型中探讨NGN的治疗作用，发现NGN在大鼠ICH后具有改善神经功能评分和神经元变性坏死、降低脑水肿的功能，并通过NGN对炎症反应的影响来解释了其在大鼠ICH模型中的保护机制。
PKC-δ已被证实是在炎症中具有关键作用的调节因子[13]。在中性粒细胞和内皮细胞中，PKC-δ可调节NF-κB的信号活化，促进IL-1β、IL-6等炎症因子的转录激活[22-23]。研究发现PKC-δ参与调节脓毒症、结核、败血症诱发肺损伤等疾病过程中的炎症反应[24-25]。PKC-δ在大鼠ICH中也介导了炎症反应[14]。本研究采用PKC-δ磷酸化激活剂PMA，进一步证实了PKC-δ在大鼠ICH后炎症损伤中的调节作用。此外，有文献报道，NGN在高胆固醇血症的肝细胞中通过抑制NF-κB降低TNF-α、IL-6和IL-1β[26]。我们的研究也发现NGN可降低ICH后NF-κB、IL-1β、IL-6的表达。为研究这一效应是否可通过抑制PKC-δ的磷酸化来实现，我们在大鼠ICH模型中给予NGN的基础上用PMA增加PKC-δ的磷酸化，实验结果发现PMA逆转了NGN对大鼠ICH后减少NF-κB、IL-1β、IL-6等炎症因子表达的作用，进一步证明NGN降低大鼠ICH后炎症反应可能与抑制PKC-δ的磷酸化水平有关。
总之，本研究揭示了NGN在大鼠ICH后的抗炎及神经保护功能，该作用可能是通过抑制磷酸化PKC-δ来实现的，这为寻找ICH后的治疗靶点提供了新的思路。
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