2. 473009 河南 南阳，河南省南阳市中心医院：肿瘤内科
2. Department of Oncology, Nanyang Central Hospital, Nanyang, Henan Province, 473009, China
MicroRNAs(miRNA)是一类内源性的单链非编码单链小分子RNA，其通常长度为17~24个核苷酸，其能够与靶基因的mRNA互补序列结合从而引起mRNA的降解或抑制翻译过程[1]。研究发现，miRNA在多种肿瘤中发挥至关重要的作用，广泛参与肿瘤的细胞增殖、血管形成、细胞凋亡、侵袭及转移等生物学过程[2]。miR-124在已被证实在多种肿瘤中发挥类似抑瘤基因的功能，但其在膀胱癌中的生物学功能及作用机制仍未见相关报道[3-4]。因此，本研究拟通过用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerasechain reaction, RT-qPCR)和原位杂交技术检测114例膀胱癌细胞及组织中的表达情况，探讨其表达水平与膀胱癌临床病理特征及预后的关系，分析miR-124表达改变对生物学功能的影响并探讨其相关机制，旨在为膀胱癌的治疗、诊断及预后标志物的开发提供参考来源和理论基础。
1 材料与方法 1.1 检测对象人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1及膀胱癌细胞株5637、J82、T24、TCCSUP、UMUC3均购于中国科学院细胞库。临床标本取自2013年1月至2016年1月我院114例行根治性膀胱切除术，纳入患者术前均未行放化疗及免疫治疗等治疗，均经组织病理学证实为膀胱尿路上皮癌及癌旁组织(癌旁组织选择距癌灶边缘5 cm以上)，患者住院资料均完整。其中男性74例，女性40例，年龄35~77(62.5±8.3)岁；TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者69例，Ⅲ~Ⅳ期患者45例；高、中分化患者63例，低分化患者51例。所有的组织样本采集后均立即置于液氮中保存。本研究经我院伦理委员会批准(批件号：2012-0064)。
1.2 主要试剂RPMI 1640、DMEM、F12K培养液及PBS购自美国GIBCO公司；胎牛血清购于杭四季青公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；DEPC水购自武汉塞维尔生物技术有限公司；反转录及miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)购自大连宝生物公司，miR-124原位杂交探针序列、miR-124模拟物(miR-124 mimic)、miR-124抑制剂(miR-124 inhibitor)及其阴性对照(miRNA-NC)均购自广州锐博生物公司；封闭液和预杂交液均购自福州迈新生物公司。脂质体Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司。CCK-8细胞增殖试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；兔抗人PCNA、Ki-67、AKT、p-AKT和β-actin单克隆抗体以及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国CST公司。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养SV-HUC-1细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的F12K培养基培养；J82细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养；5637、T24、TCCSUP、UMUC-3细胞于含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI 1640培养基中培养；细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。
1.3.2 实时荧光定量PCR用TRIzol® RNA提取试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，采用PTC-100/PTC-200型PCR仪按RT试剂盒说明反转录合成cDNA链；采用Applied Biosystems7500 RT-PCR system按说明进行PCR检测，设3个复孔，以看家基因GAPDH和U6作为内参，miR-124及U6引物序列为：miR-124上游引物序列为5′- ATGGCGGATGAAGTAATCGCG-3′，下游引物序列为5′-GAAACTCACAACTTGATCAGTTC-3′；U6上游引物序列为5′-ACAGCGTGCTAGATCATCAGC-3′；下游引物序列为5′-GGTCATGAGTCAGCCACGAT-3′。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 35 s，循环40次；计算各组CT值，采用定量PCR中的相对定量法及2-△△Ct计算miRNA的表达水平。
1.3.3 原位杂交将切除的新鲜标本尽快在4%多聚甲醛中固定4 h，以免mRNA降解，制作石蜡切片并切厚度为4 μm的连续切片；将石蜡切片行二甲苯脱蜡，水洗，3%H2O2室温作用10 min，水洗2次；在切片上加入1 mL 3%柠檬酸和2滴胃蛋白酶，混匀37 ℃消化20 min；PBS洗3次，每次5 min，再水洗1次；湿盒底部加20%甘油保湿，每个蜡块20 μL预杂交液，置于38 ℃恒温箱3 h；每个蜡块20 μL杂交液，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，在杂交仪中42 ℃杂交过夜；依次置于2×柠檬酸盐缓冲盐酸液(Saline sodium citrate buffer, SSC)液5 min、0.5×SSC液15 min、0.2×SSC液15 min洗涤；滴加封闭液，37 ℃恒温孵育30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃恒温孵育60 min；PBS洗4次，每次5 min；加DAB显色液，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明；最后中性树胶封片，显微镜观察。
1.3.4 原位杂交结果分析根据组织阳性着色程度评分：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分；根据组织中的阳性细胞数计分：0%~10%为1分；>10%~50%为2分；>50%~75%为3分；>75%为4分。两种评分方法乘积得到判定阳性结果：两者乘积 < 8为低表达，≥8为高表达。
1.3.5 病例随访随访调查患者死亡时间及原因以及发生远处转移的时间，观测患者总生存期(overall survival, OS)及无病生存期(disease-free survival, DFS)。随访从第一次明确诊断开始，到发生远处转移时间或死亡时间或末次随访时间；发现患者死亡或转移随访即终结，随访截止时间为2019年1月1日。
1.3.6 CCK-8增殖试验严格参照CCK-8试剂盒说明书的步骤进行试验，分为3组：分别将miRNA-NC(miRNA-NC组)、miRNA-124 mimics(miRNA-124 mimics组)和miR-124 inhibitor(miR-124 inhibitor组)转染至膀胱癌T24细胞，并转染后的细胞接种于96孔板中并置于恒温培养箱培养，待细胞贴壁后，分别于0、24、48、72 h时间点加入10 μL CCK-8，继续置于37 ℃恒温培养箱培养2~4 h，使用酶联免疫检测仪于450 nm波长处检测各组的细胞光密度值[D(450)]，计算增殖率。
1.3.7 蛋白质免疫印迹(Western blot)试验经过处理的细胞铺种在6孔板中，待细胞生长良好吸去旧培养基，PBS冲洗细胞1~2次。加入含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液，细胞刮刀将细胞刮下收集至EP管中，冰上裂解细胞30 min，高速离心并收集上清，即为细胞的总蛋白，并置于-80 ℃冰箱保存；BCA法对蛋白进行定量，完成后加入上样缓冲液混匀，煮沸5 min变性。配置的相应浓度的分离胶和浓缩胶，加样并进行电泳，后进行转膜操作，转膜完成后用10%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜1~2次，裁剪条带后加入一抗4 ℃过夜孵育。第二日取出PVDF膜并用TBST洗涤3~5次，每次5 min；随后加入二抗孵育1 h，TBST洗涤3~5次，ECL发光试剂盒进行显影，化学发光仪检测并拍照。
1.4 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验；计数资料以百分数表示，采用χ2检验。使用Kaplan-Meier绘制生存曲线，采用Log-rank分析miR-124与膀胱癌患者临床预后的关系。
2 结果 2.1 miR-124在人正常膀胱尿路上皮及膀胱癌细胞中的表达qPCR检测miR-124在人正常膀胱尿路上皮细胞及膀胱癌细胞中的表达，结果发现，与人正常膀胱尿路上皮细胞SV-HUC-1比较，膀胱癌细胞5637、J82、T24、TCCSUP、UMUC3中miR-124的表达水平明显降低(t= 16.37, P < 0.01; t=29.99, P < 0.01; t=50.84, P < 0.01; t=28.3, P < 0.01；t=56.95, P < 0.01，图 1)。
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| a：P < 0.01，与SV-HUC-1比较 图 1 qPCR检测miR-124在人正常膀胱尿路上皮及膀胱癌细胞中的表达(n=3，x±s) |
2.2 miR-124在膀胱癌组织中的表达及与临床病理参数的关系
采用原位杂交技术检测114例膀胱癌组织及癌旁正常组织中miR-124的表达。结果显示，miR-124蛋白主要定位于细胞质，染色呈棕褐色，在正常膀胱组织中明显高表达，在癌组织中显著低表达(图 2)；miR-124正常膀胱组织呈阳性表达有81例，在膀胱癌组织呈阳性表达有42例，miR-124在正常膀胱组织的阳性表达显著高于膀胱癌组织(P < 0.001)。相关性分析表明，miR-124低表达与膀胱癌临床T分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度密切相关(P < 0.05)，但与性别、年龄、远处转移等无明显相关性(P>0.05)，见表 2。
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| 图 2 原位杂交技术检测miR-124在正常膀胱组织、非浸润性及浸润性膀胱癌组织中的表达 |
| 临床病理参数 | n | 低表达组 | 高表达组 | χ2 | P |
| 性别 | |||||
| 男 | 74 | 46(45.61) | 28(54.39) | 0.090 | 0.764 |
| 女 | 40 | 26(66.67) | 14(33.33) | ||
| 年龄/岁 | |||||
| ≤60 | 67 | 46(43.59) | 21(56.41) | 2.122 | 0.146 |
| >60 | 47 | 26(62.5) | 21(37.5) | ||
| TNM分期 | |||||
| T1-T2 | 69 | 37(64.44) | 32(35.56) | 6.829 | 0.009 |
| T3-T4 | 45 | 35(22.22) | 10(77.78) | ||
| 淋巴结转移 | |||||
| N0 | 78 | 43(59.18) | 35(40.81) | 6.844 | 0.009 |
| N1-N3 | 36 | 29(21.42) | 7(78.57) | ||
| 远处转移 | |||||
| M0 | 86 | 57(53.45) | 29(46.55) | 1.466 | 0.226 |
| M1 | 28 | 15(33.33) | 13(66.67) | ||
| 分化程度 | |||||
| 中高分化 | 63 | 34(54.35) | 29(45.65) | 5.111 | 0.024 |
| 低分化 | 51 | 38(23.53) | 13(76.47) | ||
2.3 miR-124表达与膀胱癌患者预后的关系
将所收集的膀胱癌样本分成miR-124高表达组和miR-124低表达组，通过Kaplan-Meier法通过绘制生存曲线，分析miR-124表达与膀胱癌预后的关系，结果发现，miR-124高表达的膀胱癌患者中，3年患者随访中出现5例失访；miR-124低表达膀胱癌患者中，3年患者随访中出现4例失访；miR-124低表达组患者的总生存期(overall survival, OS)明显短于高表达组患者(χ2=22.7, P < 0.01)；miR-124低表达组患者的无病生存期(disease-free survival, DFS)也明显短于高表达组患者(χ2=26.57, P < 0.01)。提示miR-124表达越低，膀胱癌患者预后越差。多因素分析结果提示，miR-124在膀胱中低表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(OS HR=4.63; 95% CI: 1.39~7.23; P=0.007; DFS HR=5.82; 95% CI: 1.56~11.42; P=0.003)。见图 3。
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| A：总体生存期；B：无病生存期a：P < 0.01，与miR-124高表达组比较 图 3 miR-124表达水平与膀胱癌患者总生存期及无病生存期的关系 |
2.4 CCK-8法检测miR-124表达改变对膀胱癌细胞T24增殖能力的影响
采用CCK-8增殖试验检测3组T24细胞在0、24、48、72 h各时间点的增殖情况。结果表明，与对照组(miRNA-NC)相比，miR-124 mimics组各时间点的细胞增殖能力明显降低(P < 0.05)；而miR-124 inhibitor组细胞增殖能力明显升高，差异均有统计学意义(P < 0.05，图 4)。
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| a：P < 0.05，与miRNA-NC组比较；b：P < 0.05，与miR-124 mimics组比较 图 4 CCK-8检测各组膀胱癌细胞的增殖能力 (n=3，x±s) |
2.5 miR-124表达改变对膀胱癌细胞增殖相关蛋白及AKT信号通路的影响
为明确上调miR-124表达后，膀胱癌细胞增殖能力降低的潜在调控机制，采用Western blot检测miR-124表达改变后增殖相关蛋白PCNA、Ki-67及AKT信号通路蛋白的表达水平。结果显示，与miRNA-NC组比较，miR-124 mimics组T24细胞的增殖相关蛋白PCNA、Ki-67以及磷酸化的p-AKT蛋白表达水平降低(P < 0.05)，而AKT蛋白表达水平未发生变化(P> 0.05)；miR-124 inhibitor组中的PCNA、Ki-67及p-AKT的蛋白表达水平较miRNA-NC组和miR-124 mimics组升高(P < 0.05)，而AKT蛋白表达水平未发生变化(P> 0.05)，见图 5。
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| A：Western blot检测结果；B：PCNA、Ki-67、AKT及p-AKT蛋白半定量分析(n=3，x±s) a：P < 0.05，与miRNA-NC组比较；b：P < 0.05，与miR-124 mimics组比较 图 5 Western blot检测PCNA、Ki-67、AKT及p-AKT蛋白的表达水平 |
3 讨论
膀胱癌是常见的癌症[5]。在我国，随着诊疗技术及筛查手段的提高，膀胱癌的发病率呈逐年递增趋势，男性膀胱癌的患病率是女性的3~4倍，现已位居全部恶性肿瘤中第十位[6]。早期膀胱癌患者症状不典型，多因出现血尿后前来就诊，往往大多数患者被确诊为膀胱癌时已发生转移，导致膀胱癌患者疗效欠佳且预后较差[7]。有研究指出，由于膀胱癌新的治疗药物进展缓慢以及治疗手段未有明显改进，导致膀胱癌近30年来生存率未得到明显改善[8]。因此，深入探究膀胱癌的分子机制及发病机理，寻找新的诊断标志物及分子治疗靶点，一直是目前研究重点与难点，对改善膀胱癌治疗效果、降低死亡率及改善患者预后具有至关重要的临床意义[9]。
miRNA作为生命过程的重要调控分子，与肿瘤的发生、发展关系密切[10]。研究发现，miRNA在多种肿瘤表型差异表达明显，提示其可作为肿瘤的诊断及预后标志物[11]。ZHANG等[12]采用miRNA表达谱确定了miR-191、miR-23-3p、miR-145、miR-328和miR-18a这5个血清miRNAs与非小细胞肺癌(non-small cell lung Cancer, NSCLC)患者的3年总生存率显著相关，提示他们可以作为晚期NSCLC患者的预后预测因子。研究报道，胃癌患者血清中高表达的miR-451和miR-16将预示着更高的总体生存率[13]。在ZHU等[14]采用表达谱芯片共筛选出了miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p共5个miRNA在非贲门腺癌患者血浆中的水平持续升高，并被作为检测早期非贲门腺癌的潜在无创生物标志物。上述结果表明，miRNA在多种肿瘤进展过程中发挥重要作用，并可作为肿瘤的早期诊断及预后评判指标。miR-124作为抑瘤因子在多种肿瘤中发挥抑瘤作用[15]。在NSCLC细胞中，miR-124表达水平明显低于正常肺上皮BEAS-2E细胞；且miR-124在NSCLC组织的表达水平明显低于正常肺组织，miR-124的表达水平与肿瘤转移(TNM)的分期、分化程度和淋巴结转移显著相关。本研究结果显示，miR-124在人膀胱癌细胞5637、J82、T24、TCCSUP、UMUC3中的表达水平均明显低于SV-HUC-1(P < 0.01)；与miR-124在膀胱癌细胞中的表达趋势相一致的是，原位杂交技术结果表明miR-124在正常膀胱组织中呈强阳性表达，在非浸润性膀胱癌组织中表达降低，在浸润性膀胱癌组织中的表达较前两者更低。说明miR-124可能参与了膀胱癌发生、发展过程。miR-124低表达与膀胱癌临床T分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度密切相关(P < 0.05)，但与性别、年龄、远处转移等无明显相关性(P>0.05)。miR-124低表达可能与膀胱癌的恶性程度及不良预后呈正相关，提示其可能参与了膀胱癌发生的恶性进程。
有研究发现，与正常肺细胞和组织相比，miR-124在NSCLC细胞株SPC-A1、NCI-H1650及NSCLC组织的表达下调。miR-124低表达患者的OS和PFS明显缩短。进一步机制探讨发现，肿瘤抑制因子miR-124通过抑制靶基因泛素特异性蛋白酶14(Ubiquitin-specific protease 14, USP4)的表达，负调控NSCLC细胞生长和自我更新，进而提高NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性[16]。本研究分析miR-124表达与膀胱癌患者预后之间的关系，Kaplan-Meier结果显示，miR-124低表达组患者的OS和DFS明显短于高表达组患者(P < 0.01)；多因素分析结果提示，miR-124在膀胱中低表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素。提示miR-124表达越低，膀胱癌患者预后越差，有望成为膀胱癌新的预后标志物。
miR-124在胃癌组织样品和细胞系中的表达都显著降低，且过表达miR-124(miR-124 mimics)可明显抑制了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[17]。有研究报道，与miR-NC组比较，过表达miR-124(miR-124 mimics)可显著降低结直肠癌细胞的活力，明显诱导细胞凋亡和抑制细胞侵袭能力(P < 0.05)；并且明显增强了Wnt4的表达。由此提出miR-124可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡[18]。本研究采用Lipofectamine 2000将miR-124 mimic、miR-124 inhibitor及miRNA-NC转染至T24细胞中，CCK-8检测细胞增殖能力，结果发现，与miRNA-NC组相比，miR-124 mimics组T24细胞增殖能力明显下降(P < 0.05)，而miR-124 inhibitor组中T24细胞增殖能力增强(P < 0.05)。说明上调miR-124可抑制T24细胞的增殖能力。这与CAO等[19]研究结果相一致。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，其通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与多种实体肿瘤的发生、发展关系密切[20-21]。本研究采用Western blot检测增殖相关蛋白(PCNA、Ki-67)及PI3K/AKT通路中AKT以及磷酸化的p-AKT的表达水平，结果表明，与miRNA-NC比较，miR-124 mimics组中的PCNA、Ki-67及p-AKT蛋白表达量降低(P < 0.05)；miR-124 inhibitor组中的PCNA、Ki-67及p-AKT的蛋白表达量较miRNA-NC组和miR-124 mimics组升高(P < 0.05)，而总AKT蛋白表达量未发生变化(P>0.05)。提示上调miR-124有效抑制T24细胞的增殖和PI3K/AKT通路的活化，miR-124可能通过AKT信号通路调控膀胱癌细胞的增殖，进而影响肿瘤的恶性进程。
综上所述，miR-124在膀胱癌组织与癌细胞中均明显降低，与膀胱癌临床T分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度及不良预后密切相关，上调miR-124可显著减少细胞增殖，其机制可能与AKT信号通路有关，有望为膀胱癌的预后评判和治疗提供新的标志物和治疗靶点。
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