2. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院病理科
2. Department of Pathology, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
RanBP9，又名RanBPM(Ran-binding protein in microtubule organizing center)，是一个新的Ran蛋白结合蛋白[1]。它广泛表达于不同组织和细胞系，在细胞内发挥支架蛋白的作用，是细胞内具有不同生物学功能的蛋白复合体的关键组成部分，可维持蛋白质稳定、调节基因转录活性。进一步研究发现RanBP9亦参与调节细胞周期、细胞黏附、凋亡、迁移等[2]。同时RanBP9与多种肿瘤的发生、发展密切相关，它在结肠癌、胃癌和肺癌中均发挥抑癌基因的作用，可以显著抑制肿瘤的转移并增加其对化疗药物的敏感性。但关于RanBP9在骨肉瘤发生、发展中的作用尚不清楚，本课题组前期研究发现，RanBP9在骨肉瘤细胞中低表达，且与骨肉瘤的增殖、凋亡和转移相关[3]。RanBP9是一个与凋亡相关的支架蛋白，在细胞内的分布情况随着细胞凋亡的进程可发生显著改变。近期研究表明RanBP9能以凋亡前体蛋白的形式在细胞凋亡中发挥重要的调节作用[3]，但其在骨肉瘤凋亡过程中的作用及分子机制仍有待进一步研究。因此，本研究拟通过过表达RanBP9来进一步探讨其对骨肉瘤细胞凋亡的影响和分子机制。
1 材料与方法 1.1 细胞系和培养人成骨细胞hFOB(hFOB1.19)和骨肉瘤细胞系SaOS2、MG63、U2OS和HOS均购自美国典型培养物保藏中心，由本实验室传代保种。SaOS2、HOS、U2OS培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，MG63培养于含有10%胎牛血清的1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2混合气体的无菌恒温培养箱中培养。hFOB1.19成骨细胞培养于添加G418(终浓度至0.3 mg/mL)、10%胎牛血清的无酚红DMEM/F12培养基中，置于34 ℃、5% CO2混合气体的无菌恒温培养箱中培养。
1.2 过表达RanBP9骨肉瘤细胞株的建立及鉴定带RFP荧光的过表达RanBP9慢病毒载体由上海英骏生物公司合成。将生长状态良好的骨肉瘤SaOS2细胞按1×105/孔接种到6孔板，待细胞融合率约30%时，PBS漂洗细胞3次，更换新鲜无双抗培养基，病毒稀释液中加入促转染试剂polybrene(聚凝胺)，终浓度为5 μg/mL，按照细胞MOI值计算并加入相应量病毒。将培养基和病毒液充分混匀后置于CO2孵箱孵育24 h，换成新鲜的完全培养基。48 h后荧光显微镜下观察转染效率，将细胞进行常规传代培养，通过流式细胞仪筛选出稳定过表达RanBP9的细胞株，分为对照组(Control)和过表达组(over RanBP9)。
1.3 Real-time PCR(RT-PCR)检测提取细胞RNA，按1 :25比例用DEPC水稀释样品RNA 2 μL，用Smartspec 3000核酸蛋白定量仪测定RNA的浓度。按照TaKaRa公司的Prime Script RT reagent Kit说明书，将RNA反转录为cDNA。根据SYBER Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书，配置10 μL反应体系：5 μL SYBER Premix Ex TaqTM Ⅱ、0.8 μL cDNA、上游及下游引物各0.5 μL、3.2 μL dH2O。根据基因BANK中提供的基因序列，用Primier premier 5.0软件设计特异引物，同时以GADPH作为内参。GAPDH上游引物：5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物：5′-GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT-3′；RanBP9上游引物：5′-CGCATCCAATACCAGCAGCC-3′，下游引物：5′- GGCACAGTACCCATGGTGGA-3′；Cytc上游引物：5′-TCGGAGCGGGAGTGTTCGTTG-3′，下游引物：5′-CCTCCCTTTTCAACGGTGTGGC-3′；Caspase-3上游引物：5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′，下游引物：5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3′；Bax上游引物：5′-CCC-GAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游引物：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′；Bcl-2上游引物：5′-GCGGAGTTCACAGCTCTATAC-3′，下游引物：5′-AAAAGGCCCCTACAGTTACCA-3′；Fas上游引物：5′-TATCACCACTATTGCTGGAGTCA-3′，下游引物：5′-GCTGTGTC-TTGGACATTGTCA-3′；Flip上游引物：5′-ACAACAAGGACCACGGGAGGAG-3′，下游引物：5′-TGGAGGCAA-AGAAACCGAAAGC-3′。将反应体系放入仪器Bio-Rad CFX96 Real-time System，根据扩增曲线和溶解曲线，制作标准曲线进行结果分析。
1.4 Western blot检测骨肉瘤细胞RanBP9蛋白表达提取细胞总蛋白，采用Pierce BCA Protein Assay Kit测定蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭：用脱脂奶粉浸泡PVDF膜，水平摇床缓慢摇晃，室温下封闭4 h；将膜放人稀释好的一抗：RanBP9兔抗人多克隆抗体(Abcam公司，美国，1 :1 000稀释)、Cytc小鼠抗人单克隆抗体(Cell Signal Techology公司，美国，1 :300稀释)，Cleaved caspase-3兔抗人多克隆抗体(Abcam公司，美国，1 :500稀释)、Bax兔抗人单克隆抗体(Abcam公司，美国，1 :500稀释)、Fas小鼠抗人多克隆抗体(Abcam公司，美国，1 :300稀释)、Flip鼠抗人多克隆抗体(Cell Signal Techology公司，美国，1 :300稀释)、内参兔抗人GAPDH单克隆抗体(Cell Signal Techology公司，1 :2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日用PBST溶液洗膜10 min×3次。添加二抗(Cell Signal Techology公司，1 :5 000稀释)，室温孵育1.5 h；用化学发光显色试剂盒(Pierce公司，美国)显色，Bio-Rad凝胶成像仪自动曝光成像。
1.5 CCK-8检测细胞增殖能力使用细胞增殖试剂WST-8(Roche Biochemicals，曼海姆，德国)测量细胞生长。将细胞以2 000/孔接种在96孔微量滴定板(Corning Costar，Corning，NY)中后，根据制造商的说明，在收获时将10 μL CCK-8添加到每个孔中。加入CCK-8后1 h，通过测量转化的染料在450 nm波长处的光密度值[D(450)]来测定细胞活力。
1.6 流式细胞仪检测过表达RanBP9对骨肉瘤细胞细胞凋亡的影响将处于对数生长期的overRanBP9和Control骨肉瘤细胞SaOS2置于超低黏附板，悬浮培养3 d，然后收集到离心管中，低温低速(4 ℃ 1 000 r/min)离心5 min，弃去上清液；PBS洗涤细胞沉淀，4 ℃ 1 000 r/min再次离心5 min；弃去PBS后用200 μL结合缓冲液重悬细胞，分别加入Annexin V- APC染色液3 μL和PI 3 μL，混合均匀，避光孵育15 min，每组设3个复孔；转移至流式上机管中，上机检测。
1.7 TUNEL检测细胞凋亡将细胞接种在含10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中的盖玻片上24 h，用4%多聚甲醛固定20 min，在37 ℃用5%山羊血清封闭30 min，然后用0.3% Triton X-100处理，在室温下放置10 min。将酶溶液添加到标记溶液(1 :9稀释)中，以获得末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)反应混合物(Roche)，将50 μL加入每个样品中并孵育在黑暗中于37 ℃的潮湿环境中放置60 min。对于阴性对照，添加50 μL的标记溶液。通过激光共聚焦扫描显微镜采集图片。
1.8 线粒体膜电位分析(ΔΨm)使用线粒体膜电位测定试剂盒(海门市北洋生物技术研究所)和JC-1(亲脂性阳离子5, 5′，6, 6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑碳氰化碘)检测由RanBP9转染诱导的凋亡过程中发生的线粒体膜电位变化。简而言之，将Control细胞和overRanBP9细胞(5×105)接种到6孔板中。过夜生长后，将细胞与1 mL JC-1工作溶液在CO2孵化器中孵育20 min。除去染色溶液，并用JC-1染色缓冲液洗涤细胞2次，然后使用带通滤光片(荧光素和Cy3)通过荧光显微镜分析。
1.9 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析, 数据以x±s表示，两组间均值比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 成骨细胞和骨肉瘤细胞株中RanBP9的mRNA含量和蛋白表达水平RanBP9在成骨细胞hFOB1.19及在骨肉瘤细胞株HOS、SaSO2、MG63和U2OS中均呈阳性表达，且在骨肉瘤细胞中的表达明显低于成骨细胞(P < 0.01, 图 1A)；同时RanBP9在恶性程度较低的骨肉瘤细胞株MG63和HOS中的表达要高于恶性程度较高的细胞株SaOS2和U2OS(图 1A)。Western blot结果与RT-PCR结果一致(图 1B)。
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| 1：hFOB1.19; 2: HOS; 3: SaSO2; 4: MG63; 5: U2OS; A：RT-PCR检测结果；B：Western blot检测结果; C:半定量分析；a：P < 0.01，与hFOB1.19细胞比较 图 1 成骨细胞及骨肉瘤细胞株中RanBP9的mRNA及蛋白表达情况 |
2.2 过表达RanBP9的骨肉瘤细胞株的建立及鉴定
利用慢病毒载体转染SaOS2细胞，成功建立稳定过表达RanBP9的骨肉瘤细胞株，RT-PCR和Western blot检测结果均提示：与Control对照组比较，overRanBP9组RanBP9在核酸及蛋白水平均显著上调(P < 0.01，图 2A、B)。
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| A：RT-PCR检测RanBP9表达；B：Western blot检测RanBP9表达；C：半定量分析 1：Control组；2：over RanBP9组；a：P < 0.01，与Control组比较 图 2 过表达RanBP9的骨肉瘤细胞株的建立及鉴定 |
2.3 CCK-8法检测细胞增殖能力
CCK-8比色法显示：过表达RanBP9的细胞株在接种第2天起，增殖速率显著低于Control组, 差异有统计学意义(2 d：P=0.023；3 d：P=0.002；4 d：P=0.001，图 3)。表明过表达RanBP9显著降低了骨肉瘤细胞的增殖能力。
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| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与Control组比较 图 3 CCK-8检测两组SaOS2细胞增殖能力 |
2.4 过表达RanBP9对骨肉瘤细胞凋亡率的影响
流式细胞仪检测结果显示：过表达RanBP9后，SaOS2细胞的总凋亡率由(16.37±3.48)%增加至(33.62±4.19)%，其中早期凋亡率由7.87%增至14.80%，晚期凋亡率由5.99%增至17.90%。说明过表达RanBP9可以显著增加骨肉瘤细胞的凋亡率，即RanBP9可促进骨肉瘤细胞发生凋亡(P < 0.05，图 4A)。TUNEL染色结果与流式细胞仪检测结果一致：SaOS2在过表达RanBP9后，其荧光强度显著高于对照组(图 4B)。
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| A：流式双标法检测细胞凋亡 1：Control组；2：over RanBP9组；a：P < 0.01，与Control组比较；B：TUNEL染色检测细胞凋亡 图 4 过表达RanBP9对骨肉瘤细胞SaOS2凋亡率的影响 |
2.5 RanBP9对内外源性凋亡信号转导途径相关分子表达的影响
Western blot和RT-PCR检测结果均显示：对于线粒体途径，过表达RanBP9后，Cleaved caspase-3和Cytc表达水平均明显上调，且同时上调了Bax/Bcl-2的比率，差异有统计学意义；对于死亡受体通路而言，RanBP9的上调反而引起了Fas的下调, 同时导致死亡受体通路凋亡抑制因子Flip的表达上调，差异有统计学意义(P < 0.01, 图 5)，但其变化程度较内源性线粒体途径较小。上述结果表明：RanBP9在骨肉瘤中通过显著激活内源性线粒体通路发挥诱导凋亡的作用，而外源性死亡受体途径在该过程中被一定程度的抑制。
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| 1: Cytc; 2: Cleaved caspase-3; 3: Bax; 4: Bcl-2; 5: Fas; 6: Flip; a：P < 0.01，与Control组比较 图 5 Western blot(A)和RT-PCR(B)检测过表达RanBP9对内外源性凋亡信号转导途径相关分子表达的影响 |
2.6 过表达RanBP9后骨肉瘤细胞线粒体膜电位的改变
结果显示：SaOS2细胞展示出橘红色的荧光，代表正常细胞线粒体的JC-1聚合体，而在over RanBP9细胞中红色荧光转变为绿色荧光，更加接近于阳性对照，代表凋亡细胞线粒体的JC-1单体(图 6)。结果表明：RanBP9破坏了线粒体膜电位，诱导了内源性线粒体凋亡信号转导途径，进一步验证了RanBP9通过激活线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡。
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| 图 6 JC-1检测过表达RanBP9后骨肉瘤细胞线粒体膜电位的改变 |
3 讨论
RanBP9，最初由YOKOYAMA等[4]在酵母双杂交实验中进行筛选和鉴定。RanBP9在各种生物体中存在，包括人类、恒河猴、小鼠和青蛙[5-6]，主要分布在细胞核和细胞质中[6]。它在细胞内发挥支架蛋白的作用——参与组成不同功能的蛋白复合体，维持蛋白质的稳定和转录活性，同时亦可调节细胞周期、细胞黏附、迁移等。RanBP9参与中央微管的成核，影响细胞分裂和分化[7]。RanBP9不仅在正常细胞中发挥作用，对疾病的发生、发展亦有影响。WANG等[8-9]报道了RanBP9过表达可以在阿尔茨海默病小鼠模型中可减少树突和棘密度，从而引起棘突丧失导致的学习和记忆缺陷。QIN等[10]研究发现RanBP9在结肠癌中发挥抑癌作用；SHAO等[11]发现在具有远处转移的胃癌中，RanBP9表达降低；ZHAO等[12]则发现与正常组织相比，肺癌中RanBP9表达显著升高，但在肺癌细胞系中敲低RanBP9促进了肿瘤的转移，过表达RanBP9则抑制了肿瘤的发展并增加了肺癌对药物治疗的敏感性；WEI等[13]发现RanBP9和乳腺癌相关。以上研究均提示：RanBP9可作为一个抑癌基因发挥作用，但其在骨肉瘤中的作用仍有待进一步研究。本课题组之前研究发现，RanBP9在骨肉瘤中呈相对低表达，且可抑制肿瘤增殖及转移[3, 14]，但其在骨肉瘤凋亡中的作用机制并不清楚。因此，本研究选择了RanBP9表达较低的骨肉瘤细胞SaOS2为研究对象，利用慢病毒载体建立了稳定过表达RanBP9的骨肉瘤细胞系，来探讨其在骨肉瘤凋亡中的作用及机制。
本研究发现，RanBP9在成骨细胞hFOB1.19及在骨肉瘤细胞株HOS、SaSO2、MG63和U2OS中均呈阳性表达，且在骨肉瘤细胞中的表达显著低于成骨细胞。利用慢病毒载体转染骨肉瘤细胞SaOS2，成功建立了稳定过表达RanBP9的骨肉瘤细胞株：Real-time PCR和Western blot检测结果均提示：与对照组比较，over RanBP9组RanBP9的表达显著上调。CCK-8结果提示过表达RanBP9显著降低了骨肉瘤细胞的增殖能力，而流式双标和TUNEL染色结果都显示过表达RanBP9显著增加了骨肉瘤细胞的凋亡率。以上结果均表明，RanBP9能抑制肿瘤增殖、促进凋亡，可作为一个抑癌基因在骨肉瘤细胞中发挥作用。
RanBP9在细胞内的分布随着凋亡的过程而改变，并能以凋亡前体蛋白的形式在细胞死亡途径中发挥调节作用，本研究亦发现RanBP9可促进骨肉瘤细胞的凋亡，但其具体的作用机制并不清楚。细胞凋亡，即细胞程序性死亡，是死亡信号触发或细胞内外环境变化导致的一种应答反应，是一个细胞主动死亡的过程。它能及时、有效地清除体内过量或具有有潜在危险的细胞，进而维持体内各种细胞的平衡[15]。这对于维持机体内环境的稳定具有重要意义。细胞凋亡的发生受到相关信号通路的精确调控。目前普遍认为主要有两条凋亡诱导途径：外部途径即死亡受体介导的凋亡途径、内部途径即线粒体凋亡途径[16-17]。本实验结果证明了RanBP9过表达在mRNA水平上调了Cytc、Caspase-3的表达以及Bax/Bcl-2的比率，在蛋白水平上调了Cleaved caspase-3和Cytc的表达。同时RanBP9降低了线粒体的膜电位，增加了骨肉瘤细胞中JC-1单体的比例，Cytc表达的增加以及线粒体膜电位的破坏，提示可能存在Cytc线粒体到胞质的释放，进一步证实RanBP9的过表达激活了线粒体通路，即RanBP9通过激活线粒体途径促进了骨肉瘤细胞的凋亡。而线粒体在内源性凋亡信号途径中处于中心位置，Cytc从线粒体释放是细胞凋亡的关键环节，Smac/DIABLO、AIF、Omi/HtrA2等其他凋亡相关分子的释放则不可逆地启动了下游的凋亡信号通路[18]。Cytc的释放是由线粒体膜通透性增加所导致的——呼吸链中的质子和电子的转移使得线粒体膜两侧产生了电位(ΔΨ)，该电位促使了ATP的形成，膜电位不可逆的下降导致了膜通透性的增加。值得关注的是，RanBP9的上调反而引起了死亡受体途径关键因子Fas的下调, 并且导致了死亡受体通路凋亡抑制因子Flip的表达上调，即过表达RanBP9后，骨肉瘤细胞的外源性死亡受体途径被抑制，其抑制程度不如较线粒体途径的激活明显。Fas/FasL信号途径，作为死亡受体信号转导通路的关键通路之一，在诱导细胞凋亡中发挥重要作用。FAS作为跨膜蛋白，由其胞质的C末端区、跨膜区及胞膜外的N末端区三部分组成。其胞内区含有死亡结构域DD，在传递凋亡信号途径中发挥关键作用。Fas与其配体FasL结合后，后者由金属蛋白酶介导的水解，产生可溶性的FasL，只有三聚化的可溶性的FasL才具有功能：通过其胞质区的DD及下游相应的Caspase诱导凋亡的发生，内源性抑制剂Flip则可以通过与Caspase-8竞争性结合，抑制后者的活化，进而抑制死亡受体途径所介导的细胞凋亡。因此，本实验结果显示：RanBP9过表达诱导了骨肉瘤细胞的凋亡，该过程中线粒体通路被显著激活，而死亡受体途在一定程度上被抑制，前者变化程度较后者更为明显，其具体的分子机制仍有待进一步研究。
RanBP9亦可通过与调节凋亡过程的各种蛋白质相互作用，进而在凋亡激活的其他方面发挥作用。例如，RanBP9可以与肿瘤坏死因子TNF受体超家族的一部分p75神经营养因子受体(p75NTR)的细胞内死亡结构域相互作用[18]，而后者可以与许多衔接蛋白结合并促进细胞凋亡[19]。RanBP9还可以与CDK11的胱天蛋白酶处理片段相互作用，而CDK11可参与细胞凋亡信号转导和诱导细胞凋亡[20]。然而，这些相互作用在RanBP9对促进骨肉瘤凋亡中的作用仍有待探索。最后，RanBP9被证明可以通过抑制泛素化和随后的降解来稳定促凋亡转录因子p73[21]，且RanBP9过表达会上调p73 mRNA[22]，表明其在转录和蛋白质水平上都能稳定p73。综上，RanBP9可能在凋亡级联激活的各个步骤参与调节细胞凋亡，其对骨肉瘤细胞的凋亡调控机制值得进一步探索。
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