老年性聋(presbycusis)又称年龄相关性聋(age-related hearing loss,ARHL),是成年人听力损失的最常见类型之一,是引起摔倒、抑郁、痴呆、孤独、认知能力下降的独立危险因素[1]。老年性聋通常为感音神经性聋,从外周听觉感受器到听觉中枢的病变都可引起[2]。内毛细胞(inner hair cells, IHCs)将声音的机械刺激转化为电信号后通过突触传递至螺旋神经节细胞,再以动作电位的模式传导至听觉中枢。而内毛细胞和Ⅰ型螺旋神经节之间的神经传递是由内耳特殊的突触结构——带状突触介导[3]。若因带状突触数量、结构或功能改变,导致突触传递异常而引起的听力障碍,即为耳蜗突触病(cochlear synaptopathy, CS)[4-5]。随着年龄增加,内耳突触数量明显下降,功能减退,带状突触损伤被认为是老年性聋的重要致病因素之一[6-7],但是目前仍缺乏相关的基因调控机制研究。因此,对老年性聋突触调控基因的检测与筛选十分必要。
转录组测序(RNA-seq)能够对物种的整个转录组进行单核苷酸水平的测序,提供组织全部的基因表达数据,得到最全面的转录组信息[8],目前已广泛应用于内耳的研究中[9-11]。本研究通过对成年组和老年组C57BL/6J小鼠内耳基底膜进行转录组测序,筛选差异表达基因(DEGs)。通过基因本体(GO)数据库和KEGG数据库对DEGs进行功能及通路富集,筛选突触调控基因,并用qRT-PCR和免疫荧光验证差异。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物选用健康SPF级C57BL/6J小鼠,耳郭反射灵敏,无中耳感染,雌雄不拘,购于陆军军医大学实验动物中心,动物实验通过伦理委员会审批[编号SYXK(渝) 20170002],严格遵守批准机构的动物保健和使用协议。
1.1.2 实验试剂测序总RNA提取试剂盒(Qiagen),逆转录试剂盒(Promega),Real-time PCR试剂、Actb、目的序列(Thermo Fisher),TRIzol(Takara),兔多克隆一抗KCNQ2(Abcam),KCNMB4(Bio-techne),山羊抗兔二抗(Abcam), 封闭山羊血清(索莱宝)。
1.2 实验方法 1.2.1 转录组测序按鼠龄分为成年组(4周龄,n=18)与老年组(40周龄,n=18),解剖并制备基底膜[12],以6只小鼠(共12个基底膜)为一个样本。总RNA提取根据试剂盒操作执行,RNA的质控方法采用NanoDrop 2000、凝胶电泳28s/18s和Agilent 4200 TapeStation System,RNA质量测定采用Qubit2.0。利用Illumina Hiseq X Ten测序平台进行转录组学测序,4周龄和40周龄小鼠分别进行3组生物学重复。采用HISAT2工具将过滤得到的clean reads与参考基因组比对,FeatureCounts对mRNA进行注释和定量,DESeq2对两组样本进行差异基因筛选。差异倍数(fold change, FC)≥1.5且P<0.05视为DEGs。
1.2.2 GO数据库和KEGG数据库分析采用R包(clusterprofiler)对DEGs基于GO数据库进行基因功能注释,筛选出DEGs所体现的显著性功能。DEGs的通路分析基于KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/),从数据库中筛选出与DEGs显著相关的通路。富集显著性标准均为P < 0.05。
1.2.3 实时荧光定量PCRTRIzol法提取基底膜总RNA,测定RNA浓度及纯度。按照逆转录试剂盒(Promega)操作进行逆转录,逆转录引物序列见表 1。按照Real-time PCR(Thermo Fisher)试剂说明书,以Actb作为内参,反应条件为50 ℃ 2 min,95 ℃ 2min,(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1min)×40个循环周期。计算两组样本目标mRNA相对表达量,采用2-ΔΔCt方法计算相对Ct值。每组样本进行3次生物学重复。
基因 | 上游 | 下游 |
Kcnq2 | AGGGACCTGGGTATTTGG | TTGGATTCTAGCAGAGGCA |
Kcnk3 | GCAGACGCAGCCGCAGTATG | GCTCCGCATCACGCTTCTCG |
Kcnmb4 | GCGAAGCTCAGGGTGTCTTAC | CCGGAGACGATGAGGAACAA |
Kcnq9 | GAGTCGGACCATGAGATGCG | GAGCTGATGTTGTACTTGCCT |
Kcnh5 | TGGACTGGCCTGTAGTTTATAGT | GGTGCGATTTGCATGTAAAACC |
Kcnc2 | TCGCCACCCAGGAGTATTC | CTCCACGTCGGTCTCATCG |
Actb | GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG | ATGCCACAGGATTCCATACC |
1.2.4 免疫荧光染色
基底膜漂洗后0.25% Triton X-100破膜30 min,5%山羊血清封闭1 h,弃血清分别加入1:100 KCNQ2,1:50 KCNMB4兔多克隆一抗。4 ℃过夜,漂洗后按1:250的比例避光孵育山羊抗兔二抗(荧光激发波长568 nm)1 h,洗净后用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜(LSM 880, ZEISS)观察。
1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计处理,计量资料采用x±s表示,两独立样本t检验对qRT-PCR相对Ct值进行分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 内耳基底膜DEGs分析基于RNA测序表达谱数据,共检测到33 911个mRNA,包含DEGs 3 267个,其中下调基因1 521个,上调基因1 746个。两组样本间相关性分析(图 1A),相关系数均大于0.9,表明样本相关性很好。火山图用于观察和评估两组间mRNA表达的变化(图 1B)。DGEs聚类分析热图显示6个测序样本聚集为两个组,差异基因功能聚类为两个功能区(图 1C)。
2.2 GO,KEGG分析揭示DEGs功能及通路
对全部DEGs进行GO数据库功能富集分析及KEGG通路分析。GO富集分析显示下调基因功能主要富集在电压门控离子通道活性调控和突触调控,其中钾通道复合体富集分数最高,上调基因功能主要富集在免疫调控。富集分数较高的部分条目见表 2。KEGG通路分析结果显示,329个下调基因富集到38条通路,538个上调基因富集到82条通路。差异基因数量富集较多的通路见表 3。
GO生物学过程条目 | 基因数 | P值 | 富集分数 | 趋势 |
voltage-gatedcation channel activity | 38 | 1.55×10-19 | 5.963063322 | ↓ |
voltage-gated channel activity | 45 | 8.11×10-20 | 5.075469193 | ↓ |
voltage-gated ion channel activity | 45 | 8.11×10-20 | 5.075469193 | ↓ |
potassium channel complex | 29 | 3.15×10-17 | 6.962919762 | ↓ |
cation channel complex | 53 | 1.09×10-25 | 5.704461018 | ↓ |
axon part | 56 | 6.47×10-25 | 5.20660882 | ↓ |
signal release from synapse | 31 | 1.13×10-14 | 5.326543552 | ↓ |
neurotransmitter secretion | 31 | 1.13×10-14 | 5.326543552 | ↓ |
synaptic vesicle cycle | 29 | 1.08×10-13 | 5.271162267 | ↓ |
immunoglobulin receptor binding | 109 | 1.5×10-108 | 13.84106866 | ↑ |
antigen binding | 127 | 1.5×10-105 | 10.959927 | ↑ |
chemokine activity | 22 | 1.14×10-17 | 9.777635659 | ↑ |
MHC protein complex | 18 | 1.46×10-18 | 13.38534669 | ↑ |
immunoglobulin complex, circulating | 103 | 4.3×10-99 | 13.04933592 | ↑ |
immunoglobulin complex | 105 | 3.3×10-100 | 12.91990897 | ↑ |
immune response-regulating cell surface receptor signaling pathway | 146 | 4.6×10-104 | 8.933463096 | ↑ |
adaptive immune response based on somatic recombination of immune receptors built from immunoglobulin superfamily domains | 180 | 3.1×10-120 | 8.195691134 | ↑ |
positive regulation of lymphocyte activation | 171 | 4.2×10-111 | 7.930856965 | ↑ |
通路条目 | 基因数 | P值 | 富集分数 | 趋势 |
Neuroactive ligand-receptor interaction | 38 | 3.69E-09 | 2.854347902 | ↓ |
Calcium signaling pathway | 21 | 1.03E-05 | 2.904424181 | ↓ |
Retrogradeendocannabinoid signaling | 18 | 1.55E-05 | 3.136778116 | ↓ |
cAMP signaling pathway | 18 | 0.001186 | 2.229937049 | ↓ |
Cytokine-cytokine receptor interaction | 84 | 2.76E-34 | 4.536320707 | ↑ |
Epstein-Barr virus infection | 55 | 9.71E-19 | 3.822531114 | ↑ |
Chemokine signaling pathway | 51 | 9.81E-19 | 4.076208178 | ↑ |
2.3 突触调控基因
通过对DEGs的GO功能富集及KEGG通路富集,筛选出参与突触调控的DEGs共64个,其中下调基因43个,上调基因21个。下调基因中包含离子转运调控基因19个,其中钾离子通道数量最多(Kcnq2,Kcnk3,Kcnmb4,Kcnk9,Kcnh5,Kcnc2),且富集分数最高。参与突触调控基因名称及表达值见图 2。
2.4 qRT-PCR
因下调基因中钾离子通道基因数量最多且富集分数最高,提示其对老年性聋突触调控可能有重要意义。我们采用qRT-PCR验证内耳下调钾离子通道基因(Kcnq2,Kcnk3,Kcnmb4,Kcnk9,Kcnh5,Kcnc2)mRNA表达差异。通过qPCR的ΔCt值和测序结果FC值计算ΔΔCt值,钾通道基因qRT-PCR变化趋势与测序结果一致,均为表达下降(P < 0.05,图 3)。
2.5 免疫荧光
免疫荧光验证钾通道基因中差异倍数较大的KCNQ2和KCNMB4差异表达。结果显示:KCNQ2在内外毛细胞均有表达,散点状分布在毛细胞胞质,尤其高表达在内毛细胞基底部,老年鼠KCNQ2表达量明显降低(图 4A);KCNMB4仅特异性高表达在成年鼠内毛细胞胞质,呈散点状分布,老年鼠与成年鼠相比,仅内毛细胞核周有少量表达,表达量明显下降(图 4B)。
3 讨论
老年性聋发病机制的研究仍存在较大争议。既往认为,老年性聋可能与毛细胞数量减少,螺旋神经节和神经细胞退化相关[13]。近年来有研究发现突触对损伤更敏感,在毛细胞和螺旋神经节神经元形态及ABR尚正常时,先出现突触损伤[4],而突触损伤后再生能力非常有限。因此,耳蜗突触病(CS)被认为可能与老年性聋发生发展有关,但其机制仍不明确。部分学者认为谷氨酸兴奋毒性累积,导致神经末梢肿胀及传导受损是可能的机制之一[6-7]。也有学者认为与氧化应激解偶联蛋白UCP2上调有关,但目前仍缺乏功能和机制验证[14]。
C57小鼠是研究老年性聋的理想模型,从6月龄开始出现耳蜗底回带状突触数量减少,10月龄开始各回均明显减少[15]。本研究对C57小鼠成年组与老年组内耳基底膜进行转录组测序,通过DEGs分析,筛选突触调控基因,发现下调基因中有较多基因参与离子转运。离子通道是蛋白质孔隙,通过调节离子流动产生电流启动电信号,在保证毛细胞正常发育,维持细胞功能及耳蜗内淋巴电位等方面不可或缺[16],因此离子转运对突触调控可能具有重要功能。其中钾离子是维持正常听觉的重要元素,在耳蜗钾循环和神经信号传导中发挥重要作用。内淋巴液高钾环境能为毛细胞机械传导提供钾离子驱动力及维持毛细胞功能所必需的静息电位[17]。实验表明,增加钾离子浓度可促进毛细胞钙离子的内流,进而促进突触囊泡融合及突触后神经元去极化[18]。
KCNQ2是KCNQ钾通道家族中的一员,是M型电流的基础[19]。抑制M型电流可使细胞兴奋性增高,导致小鼠癫痫发生[20]。使用KCNQ2/3激活剂激活耳蜗钾通道,可减轻水杨酸引起的听力损害,说明KCNQ2对听功能的维持有保护作用[21]。KCNQ2在老年鼠内耳的表达情况目前尚少见报道,我们通过免疫荧光显示KCNQ2主要表达在内、外毛细胞胞质,尤其高表达在内毛细胞基底部,并在老年鼠中的表达明显降低。既往研究表明,对感觉系统持续刺激会产生兴奋毒性,累积后可导致突触损伤[22]。钾离子通道是神经元信号的阻断剂,可识别细胞去极化及中止动作电位,KCNQ2在老年鼠中表达下降可能通过对细胞兴奋性调控参与老年性聋突触变化。
KCNMB4是大电导钙激活钾通道(large conductance calcium-activated potassium,BKCa)家族中的一员。突触前BK通道激活将缩短电压门控钙通道的开放,从而减少钙内流和递质释放[23],可能起到保护细胞免于因过度活跃,产生兴奋毒性和死亡的作用[24]。KCNMB4目前在内耳研究尚不清楚,我们发现KCNMB4特异性高表达在内毛细胞,并在老年鼠中的表达明显降低。老年性聋突触损伤可能与KCNMB4表达降低,其对毛细胞的保护作用减弱有关。
综上所述,本研究通过对4周龄和40周龄C57小鼠内耳基底膜转录组测序,揭示DEGs功能主要富集在电压门控离子通道活性调控与突触调控。筛选出突触调控基因后,验证了6个钾离子通道基因(包括KCNQ2,KCNMB4)在老年鼠内耳基底膜表达下调。我们猜想钾通道基因的表达下降,使其对毛细胞兴奋性的调控作用降低,导致兴奋毒性累积,进而引起内毛细胞突触损伤,是老年性聋突触损伤的可能机制。我们的结果可以为老年性聋突触损伤机制研究提供新的思路。
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