心血管疾病是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者最常见的并发症,也是导致患者死亡的主要原因[1]。动脉粥样硬化斑块破裂是CKD患者心血管疾病恶性事件发生的重要病理基础[2],动脉粥样硬化斑块的纤维帽变薄是发生斑块不稳定性和斑块破裂的重要原因[3],而纤维帽中的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的活性和数量是维持纤维帽厚度和动脉粥样硬化斑块稳定性的关键因素[4]。新近研究表明,不稳定性斑块的纤维帽变薄,纤维帽中的VSMCs呈现低增殖能力和衰老现象,导致斑块易破裂进而导致心血管恶性事件的发生[5]。CKD是一种衰老相关性疾病[6],CKD患者具有多种衰老特征的临床表现[7],新近动物实验和体外细胞实验也已经证实,CKD可导致多种细胞衰老进而导致个体衰老[8]。但是CKD与VSMCs衰老的关系及VSMCs衰老在CKD促进斑块不稳定性中的作用尚不清楚。
Klotho基因是1997年由KURO-O等[9]在研究原发性高血压病动物实验中发现的一种与衰老密切相关的基因。Klotho基因缺失的小鼠寿命显著缩短,并表现出类似于人类衰老的各种表现,如动脉粥样硬化、皮肤萎缩、运动失调、骨质疏松、不育症等[9]。而过表达Klotho的转基因小鼠则表现为寿命延长,说明它有抗衰老的特性[10]。因此,Klotho基因也被称为抗衰老基因。我们之前报道过Klotho蛋白对CKD引起的内皮损伤[11]、左室肥厚[12]和血栓形成[13]具有明显的保护作用。因此,Klotho蛋白是重要的心血管保护因子,并且Klotho蛋白的心血管保护作用与其强大的抗氧化应激特性密切相关。本课题组曾报道Klotho蛋白在小鼠尿毒症动脉粥样硬化模型(Apoe-/-小鼠制备5/6肾毁损CKD动物模型)中的表达显著降低[14],但是Klotho蛋白是否对CKD引起的动脉粥样硬化斑块不稳定性发挥作用还并不明确。因此,本研究以Apoe-/-小鼠制备5/6肾毁损CKD动物模型和人VSMCs细胞株为研究对象,探讨CKD对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响和Klotho蛋白在此病理过程中的作用,初步揭示CKD导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的机制,并为其防治提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验材料和试剂8周龄雄性Apoe-/-小鼠和高脂饲料购自北京华阜康公司;VSMCs细胞株购于美国ATCC细胞库;DMEM低糖培养基、胰酶、胎牛血清购于美国HyClone公司;PBS、4%多聚甲醛、柠檬酸盐、免疫染色一抗稀释液、FITC标记山羊抗兔免疫荧光二抗、DAPI染色液、抗荧光淬灭剂、DCFH-DA探针购自上海碧云天公司;α-SMA抗体购自美国Abcam公司;山羊血清购自北京中杉金桥公司;半乳糖苷酶染色试剂盒购自美国CST公司;Klotho蛋白购自美国R&D公司。
1.2 制备动物模型和分组5/6肾毁损CKD动物模型建模方法为:8周龄雄性Apoe-/-小鼠麻醉消毒后,先电凝右侧肾皮质2/3,2周后行左侧全肾切除。实验分3组(每组8只小鼠):①假手术组(sham组);②CKD组;③Klotho+CKD组。sham组小鼠只进行麻醉、消毒、打开肾脏包膜,不做肾脏电凝和切除。CKD组小鼠按CKD动物模型方法进行建模。Klotho+CKD组小鼠则在CKD术后通过腹腔注射Klotho蛋白(0.01 mg/kg,每2天注射1次)建模。左肾切除术后CKD组、Sham组和Klotho+CKD组持续以高脂饲料饲养12周。12周后收集小鼠血清和心脏,检测血脂、肌酐和尿素氮水平以评估小鼠建模是否成功。小鼠心脏进行固定、脱水、包埋、石蜡切片,完成HE染色和免疫荧光染色实验。实验按陆军军医大学动物伦理委员会批准的动物保护指南实施。
1.3 HE染色取各组小鼠心脏以4%多聚甲醛固定24 h,脱水后石蜡包埋切片,切片厚度为4 μm。HE染色:将主动脉根部石蜡切片置于60 ℃孵箱中脱蜡30 min,分别经水化、苏木精染色2 min、伊红染色30 s、梯度浓度乙醇分化脱水、二甲苯透明、风干后中性树胶封片。染色后的HE切片使用Olympus显微镜拍照。使用Image-Pro-Plus6.0软件进行斑块面积定量分析。
1.4 α-SMA免疫荧光染色脱蜡、水化方法同HE染色,水化后切片置于柠檬酸盐溶液中,95 ℃的水浴锅中进行抗原修复30 min,自然冷却后使用山羊血清室温封闭15 min,按1 :100稀释α-SMA抗体,滴加至切片上,4 ℃孵育过夜。第2天,PBS洗切片3次,滴加山羊抗兔免疫荧光抗体37 ℃孵育1 h,而后PBS洗切片3次,DAPI染色5 min,抗荧光淬灭剂滴加后盖玻片封片。免疫荧光切片使用蔡斯780共聚焦显微镜拍照。使用Image-Pro-Plus 6.0软件进行纤维帽厚度分析。
1.5 VSMCs细胞培养和分组VSMCs细胞株,置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37 ℃,5%CO2的恒温培养箱进行培养,当细胞贴壁融合至80%以上用0.25%胰酶进行消化并传代。实验分4组:①对照组(Normal组):使用10%健康人血清孵育72 h;②Klotho+Normal组:10%健康人血清培养的条件下使用Klotho蛋白预孵育(200 pmol/L,预孵育30 min);③CKD组:使用10% CKD 5期患者血清孵育72 h;④Klotho+CKD组:10% CKD 5期患者血清培养的条件下使用Klotho蛋白预孵育(200 pmol/L,预孵育30 min)。本研究经本院伦理委员会批准(2012050-1)。
1.6 细胞半乳糖苷酶染色按照细胞衰老测定试剂盒说明检测,按上述方法分组处理细胞后,PBS洗3次,10%多聚甲醛室温固定10 min,PBS洗3次,根据说明书配制染色工作液,在37 ℃无CO2的孵育箱中染色16 h,第2天PBS洗3次后,使用Olympus显微镜拍照,并分析记录阳性细胞比例。
1.7 细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测按照1 :1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA探针,使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液,加入稀释好的DCFH-DA 1 mL。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,0.25%胰酶消化为单细胞悬液后使用流式细胞仪BD verse上机检测,使用Flow Jo V10.3进行结果分析和作图。
1.8 统计学分析实验重复3次,数据以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件,实验中多组间比较用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。
2 结果 2.1 CKD对动脉粥样硬化斑块面积的影响和Klotho的作用检测各组小鼠血清血脂、肌酐、尿素氮水平,结果显示,与sham组比较,CKD组小鼠肌酐、尿素氮显著升高,Klotho+CKD组小鼠肌酐、尿素氮较CKD组显著降低(P < 0.01,表 1);血脂水平在各组中无明显变化(P>0.05,表 1),表明建模成功。
组别 | TCH | LDL | HDL | BUN | SCR |
sham组 | 808.75±45.99 | 296.88±33.29 | 40.51±4.28 | 39.86±3.84 | 0.56±0.07 |
CKD组 | 809.13±54.58 | 297.50±32.70 | 40.70±3.83 | 80.40±8.20a | 0.81±0.07a |
Klotho+CKD组 | 805.13±47.94 | 295.25±32.33 | 39.89±4.43 | 55.48±5.75b | 0.72±0.05b |
a:P < 0.01, 与sham组比较; b:P < 0.01, 与CKD组比较 |
将各组小鼠的主动脉根部层面切片进行HE染色。结果显示,与sham组比较,CKD组小鼠主动脉根部层面的斑块面积显著增大,腹腔注射Klotho蛋白可以显著抑制CKD导致的动脉粥样硬化斑块面积增加(P < 0.01,图 1)。
2.2 CKD对纤维帽厚度的影响和Klotho的作用
对sham组、CKD组和Klotho+CKD组的主动脉根部层面行α-SMA免疫荧光染色,分析CKD对纤维帽厚度的影响和Klotho的作用。结果显示,CKD组的纤维帽厚度较sham组显著变薄,腹腔注射Klotho蛋白显著抑制CKD引起的纤维帽变薄(P < 0.01, 图 2)。以上结果提示,CKD导致动脉粥样硬化斑块不稳定性增加,表现为斑块面积增加和纤维帽变薄,而Klotho蛋白在此病理过程中发挥明显的保护作用。
2.3 CKD血清对VSMCs细胞衰老表型的影响和Klotho的作用
半乳糖苷酶染色(衰老标志物)提示,CKD血清孵育72 h后,与健康人血清孵育后相比,半乳糖苷酶阳性VSMCs比例显著增加。Klotho蛋白预孵育可以显著抑制CKD引起的半乳糖苷酶阳性VSMCs比例增加(P < 0.01, 图 3)。以上结果提示CKD诱导VSMCs衰老是CKD导致纤维帽变薄和斑块不稳定的重要机制,而Klotho蛋白可以抑制CKD诱导VSMCs细胞衰老,进而对CKD导致的斑块纤维帽变薄和斑块不稳定发挥保护作用。
2.4 CKD血清对VSMCs细胞ROS生成的影响和Klotho的作用
使用DCFH-DA探针标记VSMCs,检测CKD血清孵育后VSMCs的ROS水平。结果提示,CKD血清孵育后,与健康人血清孵育后相比,VSMCs细胞ROS水平显著增加,而Klotho蛋白预孵育可以显著抑制CKD引起的VSMCs细胞ROS水平增加(P < 0.01, 图 4)。以上结果说明CKD引起VSMCs的ROS大量生成是CKD导致VSMCs衰老的重要机制,Klotho蛋白可以抑制CKD导致的VSMCs细胞ROS增加和衰老。
3 讨论
本研究通过动物实验发现CKD导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的显著增加,表现为斑块面积明显增大和纤维帽显著变薄。初步研究其机制为CKD导致VSMCs细胞ROS显著增加和衰老。并且,我们通过对小鼠进行腹腔注射Klotho蛋白和体外Klotho蛋白预孵育发现,Klotho蛋白在CKD导致动脉粥样硬化斑块不稳定性和VSMCs细胞衰老中发挥保护作用。
既往BRO等[15]报道Apoe-/-CKD模型,但其研究关注于CKD导致动脉粥样硬化斑块加速进展和血管钙化,而本研究更关注动脉粥样硬化斑块的稳定性。在CKD患者中,急性心肌梗死的发生率是普通人群的7.4倍,而斑块稳定性是心血管恶性血栓事件发生的病理基础[16],与患者预后有着密不可分的关系,研究斑块稳定性更有利于探究心血管恶性血栓事件的发生机制和防治措施。但是CKD导致斑块不稳定性的机制并不明确,本研究初步探讨了CKD导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的机制。
纤维帽是由VSMCs和其分泌的纤维和细胞外基质构成,VSMCs在动脉粥样硬化斑块的发生发展中起着重要作用,尤其是对晚期动脉粥样硬化斑块的稳定性。既往已经报道VSMCs衰老能促进斑块不稳定性的发生,但机制并未完全阐明。WANG等[5]报道斑块VSMCs中TRF2蛋白表达明显减少,该研究通过VSMCs特异TRF2点突变小鼠使VSMCs中TRF2功能缺失,发现TRF2功能缺失导致VSMCs衰老增加,进而增加了斑块和坏死核面积,导致动脉粥样硬化斑块不稳定;相反,过表达TRF2后能减少VSMCs衰老,并减少斑块和坏死核面积,增加斑块稳定性,提示延缓VSMCs衰老,对维持斑块稳定性起着十分重要的作用。本研究中,此现象得到进一步佐证,即VSMCs衰老增加斑块不稳定性,结果显示:Klotho蛋白能够保护CKD诱导的VSMCs衰老,进而保护CKD导致的纤维帽变薄和斑块不稳定性,为CKD相关的动脉粥样硬化斑块不稳定性的防治提供新靶点。但是本研究的不足之处在于仅在体外细胞实验中证实CKD导致VSMCs衰老,CKD是否可以加速小鼠斑块纤维帽中的VSMCs衰老,甚至是人斑块纤维帽中的VSMCs衰老,将是后期研究工作关注的重点。
既往研究发现,ROS和细胞衰老关系密切,ROS通过导致DNA损伤、线粒体损伤[17]等,进而导致细胞衰老,ROS的大量产生是衰老的重要机制。而VSMCs细胞中ROS主要来自线粒体和NADPH家族[18]。NADPH家族主要包括:NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5等[19]。既往研究发现NOX4来源的ROS在年龄相关性心血管疾病中发挥重要作用。线粒体功能异常也可导致ROS的大量产生,并促进动脉粥样硬化进展[20]。
CKD是一种衰老相关疾病,其诱导细胞衰老的机制与引起细胞生成大量ROS有密切的关系。而CKD内环境复杂,导致细胞ROS生成增多、细胞衰老的因素有很多,相比较使用单因素如硫酸吲哚酚或是硫酸对甲酚处理细胞,本研究采用尿毒症患者血清处理细胞,更能模拟尿毒症患者体内复杂的内环境。本研究发现,尿毒症患者血清孵育后,ROS显著升高在CKD诱导VSMCs细胞衰老中发挥重要作用,但是此病理生理过程中ROS的来源并未阐明清楚,这将是我们今后研究工作的重要关注点。
综上所述,本研究发现CKD引起VSMCs细胞ROS显著增加和VSMCs细胞衰老,导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的发生。进而推测在CKD状态下,VSMCs细胞衰老是CKD患者高心血管恶性事件发生率的重要机制。本研究还发现,通过外源性补充Klotho蛋白能显著抑制CKD诱导的VSMCs细胞ROS增加和VSMCs细胞衰老,进而保护CKD引起的动脉粥样硬化斑块不稳定性,为防治CKD引起的动脉粥样硬化斑块不稳定性提供了新的治疗思路和靶点。
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