肾缺血再灌注所致急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)为临床常见急重症,AKI造成的系统炎性反应常合并肾外远端其他脏器如脑、肺、心等受损,导致其死亡率居高不下[1]。围手术期AKI过度系统炎症反应与患者不良预后密切相关。采取措施预防和减轻AKI同时,减弱AKI所致系统炎性反应,改善肾外远端器官功能,具有重要临床价值。
右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一类高选择性α2肾上腺素能受体(α2 adrenoceptor,α2AR)激动剂,具有镇静、镇痛、抗交感特性,常用于临床麻醉和重症监护室镇静治疗。近年研究表明其具有一定抗炎作用[2]并且可改善围术期患者预后[3-4]。我们前期研究结果证实,Dex对肾缺血再灌注损伤具有肾保护作用,此外还能减轻其所导致的远端肺损伤[5-6]。巨噬细胞(macrophage,M)作为一种多功能细胞群体,可活化为促炎M1型与抗炎M2型[7],其两种表型在炎症的发生、发展及修复中发挥重要作用。Dex的抗炎特性是否与其调节巨噬细胞极性转换相关并不清楚,故本研究将以动物肾缺血再灌注所致系统性炎症反应为病理模型,探索Dex对巨噬细胞极性转换的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物清洁级雄性C57BL/6J小鼠(20~ 22 g),购自陆军军医大学实验动物中心。动物实验获得陆军军医大学实验动物管理委员会许可,并严格遵从国家实验动物管理及使用指南的相关规定。
1.1.2 主要试剂和仪器兔抗鼠诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)一抗、山羊抗鼠精氨酸酶1(arginase 1, Arg 1)一抗、驴抗兔二抗、驴抗山羊二抗均购自美国Abcam公司,兔抗鼠GADPH一抗购自美国CST公司,磷酸盐缓冲液(PBS)、洗膜缓冲液(TBST)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、增强型化学发光(Enhanced Chemiluminescent,ECL)显色液购自中国碧云天公司,小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA检测试剂盒购自美国Abcam公司,胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI1640培养基购自美国HyClone公司,肝素钠购自江苏万邦生化医药公司,HEMAVET 950FS血液分析仪购自美国Drew Scientific公司,GellDoc 2000凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,多功能酶标仪购自美国Thermofisher公司。
1.2 方法 1.2.1 动物分组与处理动物术前禁食12 h,自由饮水。15只C57BL/6J小鼠分为3组,假手术组:行开腹关腹手术;肾缺血再灌注组:双侧肾蒂夹闭60 min;Dex预处理组:双侧肾蒂夹闭前15 min,腹腔注射Dex 25 μg/kg。实验动物处理的具体方法参照我们之前的研究[5-6]。
1.2.2 血液收集与血清制备开腹手术或再灌注24 h后,行开胸心脏采血,同时制备抗凝血标本与非抗凝血标本。非抗凝血标本至于冰箱过夜后,4 ℃ 3 000× g离心15 min,取血清,-80 ℃保存备用。
1.2.3 腹腔巨噬细胞制备心脏采血后,小鼠腹腔注射冰PBS 5 mL,轻柔腹部,吸出腹腔液,300×g离心5 min,弃上清,并用含15% FBS的RPMI1640培养基清洗2遍后,接种于细胞培养皿中,细胞孵箱孵育2 h后,PBS洗掉非贴壁细胞,所得细胞即为腹腔巨噬细胞,用于下一步实验。
1.2.4 血液中性粒,单核细胞,淋巴细胞的检测将收集好的抗凝血标本使用HEMAVET 950FS动物血液分析仪上机分析,检测中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞的数目变化。
1.2.5 Western blot法检测小鼠腹腔巨噬细胞表型提取之前制备好的不同实验组腹腔巨噬细胞蛋白(单只小鼠的腹腔巨噬细胞为一个样本),测定总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后转移蛋白至0.2 μm PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入兔抗鼠iNOS一抗和山羊抗鼠Arg 1一抗(1 :2 000);兔抗鼠β-actin抗体(1 :2 500),4 ℃过夜,TBST清洗3遍。加入相应二抗,室温下摇床震荡孵育2 h,TBST再次清洗3遍后,滴加ECL显色液后,置于凝胶成像仪中显色,并用Image J软件进行灰度值测定。以目的基因条带灰度值与内参GADPH条带灰度值的比值反应目的基因表达水平。
1.2.6 ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平按照试剂盒说明书操作检测各处理组相应炎性因子浓度。用酶标仪在450 nm波长下测定其光密度D(450),通过标准曲线计算血清中相应炎性因子的浓度。
1.3 统计学分析采用SPSS 24.0统计软件分析,数据以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 各组中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞数目变化与假手术组相比,肾缺血再灌注组与Dex预处理组中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞数目均明显增加(P < 0.01,图 1)。与肾缺血再灌注组相比,Dex预处理组没有改变中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞数目(P>0.05,图 1)。
2.2 各组炎症因子变化
与假手术组相比,肾缺血再灌注组小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β显著增加(P < 0.01,图 2A、B);Dex预处理后显著下调TNF-α(P < 0.05,图 2A)与IL-1β水平(P < 0.01,图 2B),同时升高抗炎因子IL-10水平(P < 0.01,图 2C)。
2.3 各组巨噬细胞极性变化
与假手术组相比,肾缺血再灌注组iNOS表达显著上升(P < 0.01,图 3A),同时Arg 1显著降低(P < 0.01,图 3B);Dex预处理组显著减少iNOS的表达(P < 0.05,图 3A),同时显著增加Arg 1的表达(P < 0.05,图 3B)。
3 讨论
围术期缺血再灌注所致AKI常见,住院患者AKI 30%~40%发生于围术期[8]。尽管透析技术与治疗方法在过去数十年里改进不少,但与AKI相关的发病率和死亡率无明显改善[9]。AKI常伴随肾外脑、肺、心、肝等多器官的病理性损伤和功能障碍,此为其死亡率居高不下的重要原因[1]。目前研究证实,AKI所致系统性炎症反应为继发肾外器官受损的关键因素。巨噬细胞作为一种多功能免疫细胞群体,经不同刺激因素活化后可转化为M1型与M2型。M1型高分泌IL-1β、TNFα、IL-12,高表达一氧化氮合酶(iNOS)等,呈促炎功能活性;M2型则高分泌IL-10、IL-1ra,高表达精氨酸酶(Arg)等,呈抗炎与组织修复功能活性[7]。巨噬细胞的活化状态对炎症反应的启动、维持与消退,损伤组织器官的修复与重塑发挥了重要调控作用[10-12]。因此,采取措施调节巨噬细胞的极性转换,减少M1表型而增加M2表型,可成为抑制AKI所致系统炎性反应而实现肾外器官保护的一种治疗策略。
我们前期研究证实,临床麻醉和ICU中常用的Dex可通过抑制炎症反应而发挥肾保护及肺保护作用,但其抗炎的确切机制并不十分清楚[5-6, 13]。最近的研究表明,腹腔巨噬细胞的活化状态对胆碱能抗炎通路的激活作用,进而调控炎症,与急性肾损伤程度密切相关[14]。本研究通过检测循环中性粒细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞数目变化,发现Dex并不能改变肾缺血再灌注后上述免疫细胞数目升高的状况,但能使腹腔巨噬细胞的极性发生变化,M1标志物iNOS表达减少,同时血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平降低,而M2标志物Arg1表达增加,抗炎因子IL-10水平增高。Dex抗炎而发挥的器官保护效应,还体现在神经系统及脓毒症多器官保护。QIAO等[15]的动物实验证实,Dex可显著抑制脓毒症大鼠炎症反应而改善其生存率;PANDHARIPANDE等[16]的临床随机试验研究发现,脓毒症患者使用Dex镇静,相比于使用劳拉西泮镇静,其可显著降低神经损伤及28 d死亡率。结合本研究结果推测,Dex在多种病理状况下所展现出的抗炎效应,很可能与其调节巨噬细胞极性转换即抑制M1而增加M2密切相关。
巨噬细胞极性转换是胞内众多分子事件和信号通路参与调控的结果,目前研究所涉及的信号通路包括JNK、Notch、TGF-β、JAK/STAT、TLR/NF-κB、低氧依赖等,miRNA参与了转录后的修饰调节,表观遗传和翻译后修饰也涉及巨噬细胞的极性调控[17-18]。巨噬细胞极性调控的确切机制仍不清楚,且未见到α2AR信号通路对巨噬细胞极性调控的相关研究。近年有研究表明PI3K-Akt通路在胶质瘤浸润小胶质细胞/巨噬细胞极性转换的调控中发挥作用,具体机制不明[19]。我们前期试验发现,α2AR活化后激活胞内PI3K/Akt通路,增加Akt磷酸化而减轻氧糖剥夺诱导的人肾小管上皮细胞损伤[5]和肾缺血再灌注小鼠血清诱导的肺微血管内皮细胞凋亡[6]。此外,研究还证实活化肺微血管内皮细胞α2AR可进一步激活黏着斑激酶(FAK)而维持细胞骨架形态和细胞间连接的完整性,减轻AKI所致肺水肿[20]。FAK是PI3K/Akt通路的上游信号因子[21],结合本研究所发现高选择性α2AR激动剂dex调控巨噬细胞极性转化,推测α2AR/FAK/PI3K-Akt是潜在的可外源干预调控的巨噬细胞极性转换信号通路,有待深入研究验证。
综上,本研究证实高选择性α2AR激动剂Dex可调控巨噬细胞极性转换,减少促炎M1型而增加抗炎M2型,减轻肾脏缺血再灌注所致系统炎性反应,在一定程度上阐释Dex的抗炎机制。临床围术期应用Dex,能否降低AKI及其所致肾外器官损伤发生率值得进一步探索。
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