白色念珠菌是侵袭性真菌感染最常见的病原微生物，位居医院获得性感染的第4位，病死率高达30%~40%[1-2]。生物被膜是白色念珠菌感染患者死亡的一个危险因素[3]，由细胞外基质包裹真菌孢子、菌丝及假菌丝组成，对抗真菌药物的耐药性增加是其重要特征，是造成临床真菌感染迁延不愈和失败的主要原因[4-5]。
菌丝能增强白色念珠菌逃避宿主氧化应激的损伤，是白色念珠菌侵袭及被膜成熟的重要条件[6-7]。凝集素样黏附素3(agglutinin-like sequence 3, ALS3)在菌丝形成过程中起关键作用。有研究将白色念珠菌的ALS3基因敲除后，敲除菌株对宿主细胞的黏附能力下降，菌丝形成受到抑制，生物被膜形成受到抑制[8]。
卡泊芬净(caspofungin, CAS)属棘白菌素类抗真菌药物，在体外和体内有明显的抗生物被膜作用[9-10]，但CAS治疗对生物被膜的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)是其抗浮游状态真菌细胞的200倍以上[11]。
抗菌多肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一系列具有抗菌活性短肽的总称，是机体天然免疫的重要组成部分[12]。嗜铬粒蛋白A(chromogranin, CGA)是肾上腺髓质分泌的重要应激激素原之一，在牛、人等多种种属内高度保守，其水解片段bCAT(bovine CGA344-358)和bCHR(bovine CGA47-66)具有抗菌活性[13]。我们的前期研究发现bCAT能抑制白色念珠菌生物被膜形成[14]，但对于成熟生物被膜的作用及与抗真菌药物联合作用未有研究。
开发新的抗真菌药物或联合应用现有药物均是目前解决真菌生物被膜相关耐药问题的有效途径和方法。目前，已有少量研究将CAS与抗菌物质(如植物防御素HsAFP1)联合作用以达到协同抗白色念珠菌生物被膜的作用[15-16]。因此，本研究基于目前真菌生物被膜耐药性这个焦点问题，联合使用抗菌多肽bCAT与CAS，探讨两种药物联用对白色念珠菌成熟生物被膜中细胞形态、黏附素ALS3基因表达及细胞活性氧含量产生的影响，旨在为难治性生物被膜感染提供新的解决思路。
1 材料与方法 1.1 材料白色念珠菌标准菌株ATCC10231购自北京中科质检生物技术有限公司(中国)；bCAT(氨基酸序列：RSMRLSFRARGYGFRGPGLQL，纯度：95%，分子量：2425.84)由上海科肽生物科技有限公司合成(中国)。3, 3′-[1-(苯氨酰基)-3, 4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(Sodium3, 3′-[1-(phenylamino)carbonyl]-3, 4-tetrazolium-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid, XTT)、二甲基亚砜、甲萘醌、2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)、RPMI1640培养基均购自Sigma公司(美国)，荧光染料SYTO9/PI购自Invitrogen公司(美国)，YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)液体培养基、沙氏琼脂培养基(Sabouraud’s Agar, SDA)购自索莱宝公司(中国)，磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)购自博士德生物工程有限公司(中国)。注射用醋酸卡泊芬净购自默沙东公司(法国)。引物由上海生工合成(中国)。真菌总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司(美国)，逆转录和qRT-PCR试剂盒购自上海创英生物科技有限公司(中国)。
1.2 菌种和培养条件冻存于-80 ℃的白色念珠菌标准菌株ATCC10231接种于SDA平板，37.0 ℃培养24~48 h，肉眼观察白色菌落形成；挑选单个白色菌落接种于含有2 mL YPD培养基的试管中，放置于摇床37.0 ℃、100 r/min培养24 h以保证菌株的纯度与活力。离心(1 000 r/min，10 min)后PBS充分清洗YPD培养基，重复2次后加入RPMI1640培养基，使用血细胞计数板计数调整菌液浓度为106个/mL后放置于4 ℃备用。
1.3 XTT法测bCAT和CAS抗白色念珠菌成熟生物被膜[17]96孔板中每孔加入100 μL菌液，保鲜膜覆盖创造微氧环境后放入37 ℃孵箱中生长24 h形成生物被膜，倒置显微镜下观察到孢子、菌丝体及假菌丝，PBS充分洗涤后采用两倍稀释法依次加入bCAT、CAS，使bCAT最终药物浓度为3 105、1 553、776、388、194 μg/mL，CAS最终浓度为128、64、32、16、8 μg/mL，以不加入bCAT及CAS的RPMI1640培养基作为空白对照组(control组)。药物作用24 h后PBS充分洗涤未黏附的白色念珠菌，每孔加入100 μL XTT(0.5 μg/mL)及甲萘醌混合物(1 μmol/L)后避光放置于恒温箱中37 ℃作用2 h后使用多功能酶标仪测定490 nm处的光密度值[D(490)]。计算各实验组代谢活性(metabolic activity)=[实验组D(490)/ccontrol组D(490)]×100%，当代谢活性小于50%时认为抗成熟生物被膜有效，此时的药物浓度记为MBIC50。每次设置3个实验孔重复3次。
1.4 棋盘法测定bCAT联合CAS对白色念珠菌生物被膜的作用生物被膜培养方法及代谢活性检测同1.3，棋盘稀释法加药简述如下：bCAT及CAS从低于MBIC50下一个浓度开始用RPMI1640倍比稀释，各取50 μL分别加入已培养生物被膜平板(方法同1.3)的行与列上，37 ℃孵箱中作用24 h后测生物被膜的代谢活性(方法同1.3)。以协同抗菌指数(FICI)来判定药物的相互作用方式，公式为：FICI =(联合用药时A药MIC/单独应用A药时MIC)+(联合应用B药时MIC/单独应用B药时MIC)。FICI指数为≤0.5、>0.5~1、>1~2、>2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。每次设置3个实验孔并重复3次。
1.5 激光共聚焦观察生物被膜活死菌变化使用SYTO9/PI荧光染料对被膜细胞进行荧光标记，其中SYTO9能将成熟生物被膜中活的真菌细胞标记为绿色荧光，而PI能透过死亡的真菌细胞，标记为红色荧光。将处理后的生物被膜使用无菌水冲洗2遍，加入200 μL SYTO9/PI染料，室温避光孵育30 min，无菌水洗去残留染料，激光共聚焦显微镜观察被膜活死菌变化，并使用Image J软件进行荧光定量分析。
1.6 DCFH-DA测细胞内活性氧(ROS)含量[18-19]根据1.3方法处理成熟生物被膜后将孔板内生物被膜刮出，血细胞计数板调整菌液浓度为106个/mL，加入100 μL DCFH-DA溶液(溶于DMSO中，最终浓度10 μg/mL)，使用多功能酶标仪测37 ℃下DCFH-DA作用0 min(F0)及30 min(F30)后的荧光量(激发波长488 nm, 发射波长520 nm)。根据公式计算ROS相对含量：ROS相对含量(%)=[(F30-F0)/F0]×100%。
1.7 RT-PCR检测被膜黏附因子ALS3 mRNA的表达使用真菌RNA提取试剂盒提取总RNA, 核酸测定仪(NanoDrop2000/2000c)检测总RNA纯度和浓度，用2X SYBR Green Master MIX试剂盒将总RNA反转录为cDNA用于PCR扩增，使用EvanGreen qPCR Master Mix进行PCR定量。PCR反应体系为：PCR Mix 10 μL，基因上下游引物各0.25 μL，cDNA 1 μL，超纯水补至终体积为20 μL。反应参数为：95 ℃预变性10 min，40个循环包括95 ℃变性15 s，退火60 ℃ 60 s。用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行检测和分析，mRNA的表达量以2(-ΔCt sample-ΔCt control)来计算。引物序列如下:ALS3-正义链: 5′-TAATGATGGTGGCAAGAA-3′，ALS3-反义链: 5′-TAGCGAATCCCATTGTAC-3′，ACT1-正义链: 5′-GCTGGTAGAGACTTGACCAACCA-3′，ACT1-反义链: 5′-GACAATTTCTCTTTCAGCACTAGTAGTGA-3′。
1.8 统计学分析采用SPSS 22.0软件分析、GraphPad prism5作图，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，其两两比较使用Dunnett T3检验，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 bCAT联合CAS具有协同抗菌作用XTT检测结果显示，bCAT及CAS抗成熟被膜MBIC50分别为3 105 μg/mL、CAS 128 μg/mL。bCAT浓度为3 105 μg/mL时，生物被膜代谢活性为(44.25±5.26)%，不同bCAT浓度比较差异具有统计学意义(F=55.71，P < 0.05)，两两比较发现各组与3 105 μg/mL组相比，差异具有统计学意义(P < 0.05，图 1A)。不同浓度CAS作用后生物被膜活性改变如图 1B所示，当CAS浓度为128 μg/mL时，被膜代谢活性为(41.99±11.88)%，组间比较差异具有统计学意义(F=44.43，P < 0.05)，两两比较发现各组与3 105 μg/mL组相比，差异具有统计学意义(P < 0.05)。采用棋盘稀释法检测bCAT联合CAS抗成熟被膜作用，当bCAT浓度776 μg/mL联合CAS浓度4 μg/mL时，成熟被膜代谢活性为(46.66±1.62)%(图 1C)，FICI值为(0.281 25，< 0.5)，两者联合使用具有协同抗菌作用。
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| A: bCAT抗成熟生物被膜 a: P < 0.05，与bCAT浓度为3 105 μg/mL比较; B: CAS抗成熟生物被膜 a: P < 0.05，与CAS浓度为128 μg/mL比较; C:棋盘稀释法检测bCAT与CAS联合使用抗白色念珠菌成熟生物被膜 热图中红色代表成熟生物被膜100%代谢活性，蓝色代表 30%代谢活性; D:倒置显微镜观察白色念珠菌形态(×400) 图 1 bCAT协同CAS抗成熟生物被膜 |
倒置显微镜观察白念珠菌酵母-菌丝态的转换，实验结果显示，在加药作用24 h后，control组菌丝形态形成正常(图 1D)，视野下见大量菌丝相真菌。bCAT (776 μg/mL)和CAS(4 μg/mL)单独作用不能有效抑制白念珠菌酵母-菌丝态转换，但与control组相比，菌丝形成较短(图 1D)。联合作用时，菌丝相细胞明显减少(图 1D)。
2.2 PCR检测黏附因子mRNA表达量及荧光酶标仪检测ROS含量的变化RT-PCR结果显示，单用bCAT与CAS时ALS3基因表达分别为(12.48±5.30)%、(3.74±1.10)%，两者联合作用后ALS3表达量为(1.71±0.65)%，经单因素方差分析比较，组间差异具有统计学意义(F=29.733, P < 0.05)，两两比较采用T3检验，发现control、bCAT、CAS组与bCAT+CAS组比较，差异具有统计学意义(P < 0.05，图 2A)。对于ROS含量的检测，发现各组被膜ROS含量分别为，control组：(58.69±25.46)%，bCAT组：(95.89±17.18)%，CAS组：(114.06±47.64)%，bCAT+CAS组：(428.96±47.67)%，bCAT联合CAS明显增加了ROS含量，组间差异具有统计学意义(F=192.503，P < 0.05)，与bCAT+CAS组比较，control、bCAT、CAS组差异具有统计学意义(P < 0.05，图 2B)。
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| control组为空白对照组，bCAT处理被膜的浓度为776 μg/mL，CAS浓度为4 μg/mL；a: P < 0.05，与bCAT+CAS组比较；A:黏附因子ALS3基因相对表达量；B:生物被膜细胞内ROS含量的变化 图 2 生物被膜黏附因子ALS3基因表达量及被膜内细胞ROS含量的变化 |
2.3 激光共聚焦显微镜观察生物被膜活死菌变化
激光共聚焦显微镜观察SYTO9/PI染色后白色念珠菌的活性变化，绿色代表活菌，红色代表死菌。结果显示control组、bCAT、CAS组以绿色荧光为主，其中bCAT组及CAS组见少量红色荧光，表明活菌数较多(图 3A~C)。而在bCAT+CAS组中见大量红色荧光，绿色荧光较少，表明死菌数增加(图 3D)，各组具体荧光强度变化见表 1。
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| 生长成熟的白色念珠菌生物被膜在bCAT、CAS作用24 h后SYTO9/PI染色，使用激光共聚焦观察白色念珠菌细胞的活性变化，其中绿色荧光表示活菌，红色荧光表示死菌 A：control组; B：bCAT(776 μg/mL)组; C：CAS(4 μg/mL); D：bCAT(776 μg/mL)+CAS(4 μg/mL)组 图 3 激光共聚焦观察生物被膜活死菌变化(×100) |
| 组别 | 荧光 | 区域 | 平均荧光强度 |
| control组 | 绿色荧光 | 1048576 | 21 465.63 |
| 红色荧光 | 1048576 | 36.10 | |
| bCAT组 | 绿色荧光 | 1048576 | 14 798.24 |
| 红色荧光 | 1048576 | 3 915.11 | |
| CAS组 | 绿色荧光 | 1048576 | 15 054.17 |
| 红色荧光 | 1048576 | 1 183.08 | |
| bCAT+CAS组 | 绿色荧光 | 1048576 | 3 264.00 |
| 红色荧光 | 1048576 | 11 530.37 |
3 讨论
生物被膜的形成是白色念珠菌的主要耐药机制，白色念珠菌形成生物被膜的能力与患者感染死亡率密切相关[20]。目前临床使用抗真菌药物如氟康唑对成熟生物被膜基本无作用，两性霉素B脂质体和CAS虽然被证实能治疗被膜感染，但其MBIC50明显升高，大大增加毒副作用[21]。因此，针对成熟生物被膜治疗的研究已经迫在眉睫。
抗真菌药物联合用药是指将抗真菌药物与非抗真菌药联合使用，或者两种及以上抑制真菌生长代谢不同阶段或不同靶点的抗真菌药物联合应用，从而产生协同抗真菌作用，降低了使用高剂量药物的副作用[22]。CAS属棘白菌素类抗菌素，能通过抑制真菌细胞壁的β-(1, 3)-D-葡聚糖合成[23]，破坏成熟被膜的细胞壁。bCAT(bCGA344-364)是CGA衍生的具有抗菌活性的多肽片段，bCGA344-358是其活性中心，为阳离子多肽(+5)并富含脯氨酸，能穿透细胞膜，到达细胞内，发挥抗菌作用[24-25]。本研究通过二倍稀释法研究发现bCAT及CAS单独作用于成熟的生物被膜的MBIC50分别为3 105、128 μg/mL，对比抗浮游状态念珠菌的浓度明显增加。并通过棋盘稀释法联合使用bCAT及CAS联合作用于成熟被膜的MBIC50为776 μg/mL+4 μg/mL。明显降低了bCAT及CAS的用量，并且具有协同作用(FICI＜0.5)。
黏附是被膜形成的第一步，酵母相-菌丝相的转变是生物被膜形成的重要环节，黏附因子的高表达在此过程中产生重要作用[26-27]。ALS3是黏附蛋白家族中重要的黏附素，在成熟生物被膜中高表达[28]。MANOHAR-N等[29]的研究证实，降低ALS3基因的表达能抑制菌丝形成，从而抑制被膜的形成。我们的研究发现bCAT及CAS能有效降低ALS3基因的表达，联合使用更显著，从而抑制白色念珠菌孢子向菌丝的转变，发挥抗成熟被膜的作用。
此外，通过不触发ROS的产生来逃避中性粒细胞的杀伤作用，也是白色念珠菌通过被膜产生耐药的重要机制之一[30]。ROS是细胞代谢的副产物，当胞内ROS水平超过其自身代谢水平，过多的ROS会破坏细胞大分子，如蛋白质、DNA等，造成细胞损伤，最终导致细胞死亡[31]。已有研究证实增加ROS具有抗白色念珠菌生物被膜的作用[32-33]。本研究结果证实bCAT联合CAS能增加成熟生物被膜ROS含量。同时，通过激光共聚焦发现bCAT与CAS联合作用于成熟被膜后，生物被膜中死菌(红色荧光)明显增加，表明与CAS的联合使用增加了bCAT穿透细胞的能力，引起细胞内环境的变化，增加ROS含量，造成细胞损伤明显。
生物被膜是真菌为适应环境变化做出的改变，一旦形成后，针对浮游状态的药物常规MIC值便不能达到有效抗菌的效果。本研究发现bCGA衍生多肽bCAT联合CAS具有协同抗成熟生物被膜的作用，抑制及破坏已形成的菌丝，可能机制与降低ALS3表达、增加细胞膜通透性及细胞内ROS含量有关。本研究具有一定的临床前景，有望为临床真菌难治性生物被膜感染的治疗思路提供依据。本研究也存在一定局限性，如仅从标准菌株进行研究，未对临床菌株进行相关研究。
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