乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势[1]。目前针对乳腺癌特异性靶点的治疗药物不断增多。CXC型趋化因子受体4(CXC chemokine receptor type 4，CXCR4)在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中均有表达。它的配体为趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor，SDF-1), SDF-1/CXCR4信号转导轴在肿瘤的生长、增殖、转移、侵袭过程中扮演重要角色[2-4]，阻断这一信号转导轴能有效抑制肿瘤的生长和转移。而AMD070是针对CXCR4的小分子拮抗剂，并已经进入临床前试验[5]。探讨具有靶向、安全、高效的药物递送系统是AMD070能发挥治疗作用的基础和关键环节。我们的前期研究显示，超声纳米泡不仅是良好的超声造影剂，而且还可以作为一种良好的药物递送系统参与治疗[6]。它具有结构简单，稳定性好，无免疫反应的优点，在超声靶向纳米微泡破坏(ultrasound targeted nano-microbubble destruction，UTMD)的配合下将药物或者基因递送到肿瘤内部, 从而提高肿瘤局部药物浓度或转染效率[7]。但是目前UTMD的参数并不统一，需要对其进行优化，从而提高超声纳米泡联合UTMD对肿瘤的治疗效果[8]。基于此，本研究拟将AMD070连接在脂质纳米泡上形成诊疗一体化的靶向纳米泡(targeted nanobubbles，TBs)，研究其与CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞特异性结合能力，同时优化UTMD参数(包括声强、辐照时间、纳米泡浓度)，研究靶向纳米泡联合优化后的UTMD促进AMD070靶向释放，抑制乳腺癌细胞生长的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞株人乳腺癌系MCF-7细胞(CXCR4阳性)、MDA-MB-468细胞(CXCR4阴性)购自中科院上海细胞库。
1.2 主要材料DPPC(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPE(1，2-二棕榈酰基-snglycero-3-磷酸乙醇胺)、DPPG(1，2-dipalmitoyl-sn-glycem-3-磷酸甘油)、DPPA(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯)和DSPE-PEG2000-COOH (1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸)购自中国西安瑞禧公司；胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素、细胞培养基DMEM、胰酶EDTA购自以色列BI公司；5%牛血清白蛋白(5%BSA)购自中国北京索莱宝试剂公司；CCK-8试剂盒购自中国上海碧云天生物技术公司；八氟丙烷(C3F8)购自中国天津核工业理化工程研究所。CXCR4兔抗人一抗购自美国Abcam公司。碳酰二亚胺盐酸盐[1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyloar bodlimide hydrochloride, EDC·HCl]、N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysullinimide, NHS)均购自美国Sigma公司。
ST-B系列混合器购自北京AT & MBiomaterials公司；IX7l光学显微镜购自日本Olympus Corporation公司；Malvern Zetasizernano ZS90检测器购自Malvem Instmments Inc公司；JEM-1400透射电子显微镜(JEOL)购自日本Tokyo公司；WED-100超声治疗设备购自中国深圳医疗电子有限公司。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养将人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-468细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2的孵箱中培养，取对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后传代或进行实验。
1.3.2 DSPE-PEG2000-AMD070的合成与鉴定将DSPE- PEG2000-COOH与NHS、EDC按照1 :2 :2的摩尔比例溶于二甲基亚砜中(DMSO)，在室温下振荡活化2 h，再加入AMD070(DSPE-PEG2000-COOH与AMD070摩尔比为1 :1.5)，活化的脂质DSPE-PEG2000-COO-琥珀酰亚胺与AMD070发生酰胺反应，反应结束后将溶液转移至4 ℃透析袋中(截留分子量)，除去未反应的NHS、EDC·HCl和AMD070，放于冻干机中去除DMSO和无离子水，得到DSPE-PEG2000-AMD070的固体。取DSPE-PEG2000-COOH固体用质谱仪检测相对分子质量。
1.3.3 靶向纳米泡(targeted nanobubbles，TBs)与空白纳米泡(blank nanobubbles，NBs)的制备将DPPA、DPPC、DPPE、DPPG和DSPE-PEG2000-AMD070按照一定比例混合，溶解于1 mL甘油PBS溶液(甘油:PBS=1 :9)，充分溶解，次日将溶液转移至西林瓶中，充入C3F8置换瓶内空气，用ST型银汞胶囊震荡仪震荡90 s，振荡后悬液300×g离心3 min，去除未溶解的脂质和微泡，获得TBs，置于4 ℃冰箱中备用。以DPPA、DPPC、DPPE、DPPG以及DSPE-PEG2000-COOH为原料按照上述方法制备空白纳米泡(NBs)。
1.3.4 TBs的物理性质检测马尔文粒径分析仪(Malvern Instruments Inc，Worcestershire，UK)测量TBs的粒径和电位。通过光学显微镜观察TBs的分布，用DiI对TBs进行标记，置于荧光显微镜下观察。透射电镜观察TBs的表面形态与内部结构。
1.3.5 TBs和NBs与乳腺癌细胞结合将对数期的MCF-7细胞和MDA-MB-468细胞以5×104个/孔接种在24孔板中，过夜培养后用4%多聚甲醛固定，用5%BSA室温封闭1 h，将细胞分成3组，第1组加入50 μL的TBs，第2组加入50 μL等浓度的NBs，第3组先用CXCR4抗体孵育2 h，漂洗后加入50 μL等浓度的TBs，3组均在4 ℃冰箱中孵育2 h，爬片清洗3次后，将爬片倒置于载玻片上，在光学显微镜下观察。
1.3.6 TBs联合UTMD对乳腺癌细胞生长抑制的检测为了尽可能降低超声辐照的作用对细胞生长的不利影响，需要筛选合适的超声辐照参数，将对数生长的MCF-7细胞以5×103个/孔接种在96孔板中，过夜培养后，以超声声强(0、1.0、1.75、2.0 W/cm2)、培养基中空白纳米泡浓度(0、5×106、1×107、2×107、4×107个/mL)及超声辐照时间(0、5、10、20、40 s)的条件处理细胞，其中无辐照、无纳米泡处理组设为对照组，继续培养48 h后，加入CCK-8试剂并在培养箱中孵育2 h，用酶标仪在波长450 nm处读取光密度值[D(450)]，计算细胞生存率，筛选出与对照组无统计学差异的超声辐照条件。
1.3.7 TBs联合UTMD对乳腺癌细胞的生长抑制作用用不同浓度梯度(0、2.5×106、5×106、1×107、2×107、4×107个/mL)的TBs联合筛选出的超声辐照条件处理两种乳腺癌细胞，无辐照、无纳米泡处理组设为对照组，培养48 h后，加入CCK-8试剂并在培养箱中孵育2 h，用酶标仪在波长450 nm处读取光密度值[D(450)]，计算细胞生存率，实验重复3次。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析，P < 0.05表示为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 DSPE-PEG2000-AMD070的合成与鉴定质谱检测合成的DSPE-PEG2000-AMD070相对分子质量为3 152.39(图 1)，理论计算DSPE-PEG2000-AMD070的相对分子质量为3 149.48，故合成的DSPE-PEG2000-AMD070的相对分子质量与理论值一致，说明AMD070已与DSPE-PEG2000-COOH相连接。
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| 图 1 DSPE-PEG2000-AMD070的质谱 |
2.2 TBs的物理性质检测
TBs粒径为(481.72±26.17)nm，电位为(-7.14±0.31)mV, 在光镜下靶向纳米泡分布均匀(图 2A)，荧光显微镜下TBs呈均匀红色，表明脂质纳米泡质地均匀，结构完整，无明显聚集或破碎(图 2B)。电镜下TBs呈圆形，大小匀称，与光镜、荧光显微镜观察结果基本一致(图 2C)。
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| A：光学显微镜下的TBs形态；B:荧光显微镜下DiI标记的TBs形态；C：透射电镜观察TBs形态 图 2 TBs的物理性质检测 |
2.3 TBs体外靶向能力
光学显微镜下观察TBs能与CXCR4阳性的MCF-7细胞大量结合，与CXCR4阴性的MDA-MB-468细胞几乎不结合，NBs与两种细胞均不结合。在用CXCR4抗体阻断乳腺癌细胞的CXCR4位点后，TBs与两种细胞都没有明显结合(图 3)，说明TBs能特异性的结合于CXCR4阳性细胞的细胞膜周围。
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| (箭头示TBs) 图 3 TBs和NBs与CXCR4阳性表达的MCF-7细胞和阴性表达的MDA-MB-468细胞的结合情况 |
2.4 UTMD参数筛选
CCK-8检测分析UTMD参数对细胞生存率的影响，在超声功率的筛选中，声强1.0 W/cm2的细胞生存率与对照组(0 W/cm2)差异无统计学意义，但是声强1.75、2.0 W/cm2的细胞生存率较对照组显著降低(P < 0.05，图 4A)，说明声强1.0 W/cm2对细胞生长没有明显影响。在辐照时间的筛选中，辐照5、10 s的细胞生存率与对照组(0 s)差异无统计学意义，当辐照20、40 s时细胞生存率较对照组显著降低(P < 0.05，图 4B), 说明辐照时间不超过10 s对细胞生长无明显影响。在纳米泡浓度筛选中，空白纳米泡浓度在5×106~2×107个/mL之间对细胞生存率无明显影响，当浓度达到4×107个/mL时，细胞生存率较对照组(0个/mL)显著降低(P < 0.05，图 4C)。由此可得超声声强1.0 W/cm2、辐照时间10 s、超声纳米泡浓度5×106~2×107个/mL为最佳超声辐照参数。
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| A：不同超声声强下细胞生存率(辐照时间10 s，纳米泡浓度1.0×107个/mL) a：P < 0.05，与0 W/cm2对照组比较；B：不同超声辐照时间下的细胞生存率(超声声强1.0 W/cm2，纳米泡浓度1.0×107个/mL) a：P < 0.05，与0 s对照组比较；C：不同纳米泡浓度下的细胞生存率(超声声强1.0 W/cm2，辐照时间5 s) a：P < 0.05，与0个/mL比较 图 4 CCK-8法检测不同超声条件下MCF-7细胞的生存率 |
2.5 TBs联合UTMD对乳腺癌细胞的生长抑制作用
CCK-8检测分析TBs联合UTMD对乳腺癌细胞生存率的影响，对于MCF-7细胞，TBs浓度在0~2.5×106个/mL时，细胞的生存率与对照组差异无统计学意义，当TBs浓度处于5×106~2×107个/mL，细胞生存率逐渐降低，与对照组差异有统计学意义(P < 0.05)，且TBs联合UTMD组细胞生存率较同浓度的TBs处理组更低(P < 0.05), 在TBs浓度达到2×107个/mL，在超声辐照的配合下，MCF-细胞的生存率是所有处理组里最低的(图 5A)。而在MDA-MB-468细胞，TBs联合UTMD在各个浓度梯度对细胞生存率的影响差异均无统计学意义(图 5B)。
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| A：MCF-7细胞a：P < 0.05，与0个/mL的无超声辐照组比较；b：P < 0.05，与同浓度TBs无超声辐照组比较；B：MDA-MB-468细胞 图 5 CCK-8法检测TBs对不同乳腺癌细胞的生长抑制作用 |
3 讨论
药物治疗是乳腺癌治疗方案中的重要组成部分，但是目前抗肿瘤药物普遍缺乏特异性，且为全身用药，全身毒副作用大[9]。因此, 构建一种靶向的、高效的、安全的药物递送系统成为目前研究的热点。超声微泡不仅可作为临床上良好的超声造影剂，还可作为一种良好的药物载体，携载药物或基因随着全身血液循环到达肿瘤部位，在超声靶向微泡破坏(UTMD)的配合下实现定向爆破，将携载的药物或基因释放于肿瘤部位，提高肿瘤局部药物浓度或转染效率，从而提高肿瘤治疗效果[10-12]。我们的前期研究显示，比常规微泡粒径更小、穿透力更强的纳米泡同样具备增强显像和在超声辐照下定向爆破促进药物释放和抑制肿瘤生长的作用[6, 13]。由于CXCR4在多种肿瘤中都存在过表达，已成为多种肿瘤靶向治疗中的高特异性靶点[14-15]。而目前针对乳腺癌CXCR4位点进行靶向治疗的研究较少，AMD070是针对CXCR4的小分子拮抗剂，已进入临床前试验阶段，具有与CXCR4特异性结合的能力[16]。由此本研究构建携载AMD070的纳米级超声微泡，即诊疗一体化的靶向纳米泡(targeted nanobubbles，TBs)，探讨靶向纳米泡与CXCR4阳性的乳腺癌结合能力，并优化UTMD参数，初步探索靶向纳米泡对CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞是否具有生长抑制作用。
本研究成功构建了携载AMD070的纳米泡，质谱检测结果显示，通过碳二亚胺法将AMD070连接于纳米脂质外壳DSPE-PEG2000-COOH上，所制备的靶向纳米泡具有粒径小、分布均匀的优点，在电镜下呈圆形，大小匀称。在体外乳腺癌细胞靶向结合实验中，靶向纳米泡能与CXCR4阳性表达的乳腺癌特异性结合，相较于普通空白纳米泡，靶向纳米泡大量分布于细胞膜表面，表明靶向纳米泡对CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞具有良好的靶向结合能力。
研究证实，超声辐照能使超声纳米泡定向爆破，但是超声辐照的参数(包括声强、辐照时间、超声纳米泡浓度)需要进一步优化。这是由于超声辐照本身对细胞具有一定的损伤作用，在适宜范围内表现能改变细胞的通透性，使药物更好的进入细胞，而超声辐照参数过大将会使细胞直接破碎，无法探究靶向纳米泡对肿瘤细胞是否有生长抑制作用，所以对超声辐照的参数进行筛选优化是十分必要的[17]。为了确保携载AMD070的靶向纳米泡在超声辐照下发挥最佳的治疗效果，本研究进行了超声辐照参数的筛选实验，结果显示，超声声强为1.0 W/cm2、辐照时间10 s、纳米泡浓度为5×106~2×107个/mL为最佳辐照参数。在这个参数条件下，既能使靶向纳米泡充分爆破，又确保肿瘤细胞的结构改变是可逆的，从而确保纳米泡上的AMD070顺利释放进入肿瘤细胞内。在靶向纳米泡联合UTMD抑制乳腺癌细胞生长的实验中，随着靶向纳米泡浓度的升高，MCF-7细胞的生存率逐渐降低，且TBs联合UTMD组细胞生存率比同浓度下的TBs组更低，显示靶向纳米泡在UTMD的作用下集中爆破，能提高肿瘤细胞局部药物浓度，AMD070更容易进入细胞内部发挥作用，使CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞生长受到抑制。而靶向纳米泡联合UTMD在各个浓度下对CXCR4阴性表达的MDA-MB-468细胞的生长抑制无明显差异，与MISRA等[18]和ZHOU等[19]的研究结果一致，表明对于携载AMD070的靶向纳米泡，结合超声辐照能对细胞产生声孔效应，即肿瘤细胞在两者作用之下胞膜出现可逆性的断裂和穿孔，细胞膜的通透性明显提高，AMD070能顺利进入细胞内部从而抑制细胞生长；而对于空白纳米泡，联合我们所筛选的超声辐照参数，对肿瘤细胞通透性改变是可逆性的[20]。由于空白纳米泡并未携载药物，最终空白纳米泡联合UTMD对乳腺癌细胞生长无明显影响。由此可见靶向纳米泡联合UTMD能明显抑制CXCR4阳性表达的乳腺癌细胞生长，具有较好的治疗作用。
综上所述，本研究将CXCR4的新型小分子拮抗剂AMD070连接于纳米泡的脂质外壳上，构建了一种同时具备靶向显像和治疗的纳米泡，观察靶向纳米泡具有与CXCR4阳性表达乳腺癌细胞的结合能力，并且在优化UTMD参数的基础上，联合UTMD对乳腺癌细胞具有较好的生长抑制效果，表明携载AMD070的靶向纳米泡对乳腺癌细胞有显著的治疗作用。本研究不仅为构建肿瘤诊疗一体化的靶向纳米泡提供了新的思路，还为乳腺癌的靶向诊断和治疗提供了翔实的体外实验基础。本研究尚存在不足之处，比如未探究靶向纳米泡与乳腺癌细胞结合后进入肿瘤，抑制肿瘤细胞生长的机制，下一步将在体内实验中研究靶向纳米泡穿过肿瘤血管与肿瘤细胞结合，在UTMD协同下释放AMD070抑制肿瘤生长，促进凋亡的过程及其机制。
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