2. 830011 乌鲁木齐,新疆医科大学:基础医学院生物学教研室;
3. 830011 乌鲁木齐,新疆医科大学:基础医学院生理学教研室;
4. 830011 乌鲁木齐,新疆医科大学:维吾尔医学院
2. Department of Biology, Xinjiang Medical University, Urumqi, 830011, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China;
3. Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences; Xinjiang Medical University, Urumqi, 830011, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China;
4. Uyghur Medical College, Xinjiang Medical University, Urumqi, 830011, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是免疫介导的胃肠道炎症性疾病[1]。近年来其发病率在全球呈逐年上升趋势,且与结直肠癌的发病关系密切,严重危害人类健康[2]。UC的发病机制涉及遗传易感性、免疫、感染、肠道菌群改变等方面,其中免疫调节失调是其发病的首要原因[3-4]。而T细胞所分泌的细胞因子是免疫调节的主要效应因子,可以促进免疫细胞之间的相互作用,刺激抗原特异性效应细胞的增殖[5]。当免疫调节紊乱持续存在时,细胞因子可直接或间接影响靶细胞进一步导致炎症级联的放大和局部炎症介质对组织的损伤[6-7],引起局部或全身性炎症反应。目前,促炎和抗炎细胞因子在启动、介导、维持和控制肠道炎症中受到了广泛的关注[8]。研究显示,Th17细胞存在于包括大肠和小肠在内的所有肠段[9],其分泌的细胞因子IL-6、IL-17在肠道免疫应答和炎症过程中发挥重要作用[10],且与UC的发病密切相关。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)可通过分泌和调节抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β1,抑制炎症反应的级联并维持肠道免疫反应的平衡[11],为目前UC研究的热点。
随着UC发病机制及治疗研究的深入,发现了一些新的药物和疗法,旨在寻找或研发毒副作用较小而效果肯定的药物。研究表明,没食子具有消炎、抗腐烂、除菌、止血等功效[12]。本课题组在前期的研究中为了进一步提升药物对UC的治疗效果,对没食子单用药物进行了改良而添加了具有抗炎、抗氧化等效果的其他中药材,制备了复方缓溃乐混悬剂(huankuile, HKL),然而HKL对UC的治疗作用及机制尚不清楚。基于此,本研究通过HKL干预2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的UC模型大鼠,观察HKL对UC的疗效,同时检测Th17/Treg细胞相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β1表达的变化,初步探讨HKL治疗UC的作用机制。
1 材料与方法 1.1 动物、实验试剂、仪器 1.1.1 实验动物选用SPF级Wistar雄性大鼠50只,体质量(220±20)g,购自新疆医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(新)2016-0003。
1.1.2 实验试剂及药物TNBS购自美国Sigma公司;大鼠结肠组织ELISA试剂盒购自武汉基因美公司;TRIzol RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司;核酸染料Golden ViewTM 购自北京博迈德基因技术有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自美国Therom公司;SYBRⒸGreen Real-time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;引物由上海生工合成;HKL相关药材购自新疆维吾尔医医院;5-氨基水杨酸粉剂购自北京索莱宝公司。
1.1.3 仪器-20 ℃低温冰箱购自中国海尔公司,全能型凝胶成像分析仪及梯度PCR仪购自美国Bio-Rad公司,ABI 7500 QuantStudioTMReal-Time PCR仪购自美国ABI公司,低温离心机购自美国ePPendorf公司,荧光倒置显微镜购自德国莱卡公司,酶标仪购自美国Thermo公司,超声粉碎匀浆机购自美国PRO公司。
1.2 UC大鼠模型的建立及分组将50只8~10周龄的SPF级Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为正常组(n=12)和UC组(n=38)。参照文献[1,13]用TNBS/乙醇灌肠建立UC大鼠模型,将5%的TNBS溶入等体积50%的无水乙醇中,缓慢注入UC组大鼠结肠,正常组注入相应体积的0.9%氯化钠溶液灌肠,造模结束后将大鼠放入清洁笼内,待其自行清醒,自由进食饮水。造模后第2天,从正常组和UC组分别随机选取2只大鼠,通过大鼠的一般状况及结肠组织病理学变化,综合鉴定UC模型是否构建成功。再将UC组大鼠按随机数字表法随机分为阴性对照组(n=12)、HKL组(n=12)、5-ASA组(n=12,该组为阳性对照)。
1.3 药物的制备及干预HKL:称取没食子、黄连、石榴花、琥珀、天竺黄等8种药材进行粉碎,按照不同比例混合备用;用车前草和温桲子浸泡在玫瑰花露中,准备药物提取液,将备用的药材粉末混合物以0.18 g/mL溶解在已准备好的玫瑰花露过滤液中,大鼠一次给药剂量为1 mL/100 g。药物浓度根据前期预实验确定:高浓度1.8 g/kg;中浓度0.9 g/kg;低浓度0.45 g/kg。组织学评分参照文献[14]制定的标准,根据结肠炎症程度、病变深度、隐窝破坏、病变范围进行评分,高浓度治疗效果优于中、低浓度,且从大鼠的存活数量上也能显示高剂量对大鼠的恢复存在优势。因此,本实验选取高浓度1.8 g/kg,即0.36 g/200 g作为药物治疗浓度。
给药方法:①HKL组(n=12):用HKL灌胃给药1 mL/100 g大鼠;②5-ASA组(n=12),将5 g的5-ASA粉末溶解在250 mL 0.9%的生理盐水中,即20 mg/mL,灌胃给药1 mL/200 g大鼠;③阴性对照组(n=12)给予与HKL等体积的生理盐水;正常组用生理盐水灌胃干预。各组均从造模第3天开始连续相应干预14 d,2次/d;其余饲养条件与正常组一致。
1.4 结肠组织大体形态观察、损伤指数评分及HE染色将隔夜禁食的大鼠次日用10%的水合氯醛腹腔麻醉,分离取出距离肛门8 cm处的结肠组织,沿肠系膜纵形剪开肠腔,用预冷好的生理盐水迅速冲洗干净,吸干水分,展平观察,参照文献[15]评价结肠组织损伤指数(colonic injury index,CMDI)。0分:正常无损伤;1分:结肠轻度充血水肿;2分:结肠明显水肿,粗糙呈米粒状无溃疡;3分:形成直径约0~1 cm较小溃疡灶;4分:较大溃疡,直径约1~2 cm,与肠管和周边脏器无粘连;5分:肠腔增厚,溃疡灶>2 cm,与附近脏器粘连严重。随后将组织纵切成两半,一半置于4%的多聚甲醛溶液中固定,行常规石蜡包埋,取4 μm组织切片行HE染色,镜下观察组织形态,并由病理科专业人员参考文献[14]盲法阅片,评分标准见表 1。组织病理学评分=(炎细胞浸润+炎细胞浸润深度+溃疡深度)/3。评分越高表明损伤程度越明显。
病变类型 | 病变程度 | 病变分值 |
炎细胞浸润 | 无 | 0 |
轻度 | 1 | |
中度 | 2 | |
重度 | 3 | |
炎细胞浸润深度 | 无 | 0 |
黏膜层 | 1 | |
黏膜下层 | 2 | |
结肠全层 | 3 | |
溃疡深度 | 无 | 0 |
上皮 | 1 | |
黏膜固有层 | 2 | |
黏膜肌层 | 3 |
1.5 RT-qPCR检测结肠组织IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β1 mRNA的表达水平
匀浆机充分研磨大鼠结肠组织,加入1 mL TRIzol,采用氯仿异丙醇方法提取结肠组织总RNA,用NanoDrop超微分光光度计测定RNA样品浓度和260 nm/ 280 nm,并经Bio-Rad凝胶成像仪鉴定后参照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒取1 μg RNA反转录成cDNA。在GenBank数据库中查询大鼠IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β1 mRNA序列,利用IDT引物设计网站设计引物,并由上海生工合成,引物序列见表 2。最后在ABI 7500(QuantStudioTM Real-Time PCR System)系统下取2 μL cDNA进行PCR扩增。预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 5 s,退火30 s,延伸72 ℃ 34 s,共40个循环,保持4 ℃。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 扩增产物 长度/bp |
退火温 度/℃ |
IL-6 | 上游:GCCAGAGTCATTCAGAGCAATA | ||
下游:TTAGGAGAGCATTGGAAGTTGG | 109 | 60 ℃ | |
IL-17 | 上游:GCAACAATTCCTGGCGTTAC | ||
下游:GTATTCCGTCTCCTTGGTTCAG | 120 | 62 ℃ | |
IL-10 | 上游:AGCTGAAGACCCTCTGGATA | ||
下游:TGGCCTTGTAGACACCTTTG | 129 | 60 ℃ | |
TGF-β1 | 上游:GCAACAATTCCTGGCGTTAC | ||
下游:GTATTCCGTCTCCTTGGTTCAG | 120 | 62 ℃ | |
β-actin | 上游:CTTCCTTCCTGGGTATGGAATC | ||
下游:CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT | 105 | 62 ℃ |
1.6 ELISA检测结肠组织IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β1蛋白的表达
切割标本后称量,加入一定量的PBS(pH=7.4),保持2~8 ℃。用匀浆机将标本充分研碎,2 500离心20 min,收集上清。严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作,Th17细胞相关细胞因子IL-6 (cat. No. JYM0646Ra)、IL-17(cat. no. JYM0480Ra)、Treg细胞相关细胞因子IL-10 (cat. no. JYM0651Ra)、TGF-β1(cat. no. JYM0123Ra),加完终止液并在15 min内用酶标仪在450 nm波长处测定光密度值,根据标准品已知的浓度及所对应测定的D(450)值绘制标准曲线及直线回归方程,将待测样品的D(450)值代入回归方程中计算出待测样品的浓度。
1.7 统计学处理采用SPSS 21.0统计软件,数据以x±s表示,方差齐时,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD法。病理学评分分级多组比较采用非参数检验Kruskal-Wallis H检验,两组间比较用两独立样本的Mann-Whitney U检验。
2 结果 2.1 大鼠一般状态一般症状:14 d的干预过程中,正常组大鼠饮食水量、活动度、毛发、体温均正常,无腹泻便血,体质量逐渐增加;阴性对照组、HKL组及5-ASA组大鼠从造模后第2天开始饮食饮水量明显减少,逐渐出现不同程度的腹泻以及便血、拱背、毛发稀疏不洁、消瘦、虚弱、懒动、体温降低等症状。相应药物治疗的第5天开始,HKL和5-ASA组大鼠以上情况均有不同程度的改善。
2.2 结肠组织大体形态变化及损伤评分正常组大鼠结肠组织表面光滑、无出血、炎性水肿、渗出及增生;阴性对照组大鼠结肠表现为凹凸不平、结肠明显缩短、肠壁增厚、水肿、坏死、形成较大溃疡、颜色发黑、有糜烂与肠粘连(图 1)。结肠组织损伤(CMDI)评分结果显示,阴性对照组CMDI评分为(4.00±0.75),显著高于正常组(0.00±0.00,Z=-3.626,P < 0.01)。
与阴性对照组相比,HKL组和5-ASA组大鼠的结肠炎症明显改善,结肠表面较光滑,纹理较清晰,无粘连,个别大鼠结肠组织轻度至中度水肿、增生及糜烂(图 1)。HKL组和5-ASA组CMDI评分分别为(2.25± 0.70)、(2.50±0.53)。CMDI评分阴性对照组>5-ASA组>HKL组,三组间比较差异有统计学意义(χ2=13.657,P < 0.01)。进一步组间多重分析显示,HKL组和5-ASA组CMDI评分均较阴性对照组显著降低(Z=-3.142,P=0.002;Z=-3.070,P=0.002);HKL组与5-ASA组比较差异无统计学意义(Z=-0.707,P=0.480)。
2.3 组织病理学观察正常组大鼠结肠黏膜腺体排列规则,隐窝结构正常,无炎性细胞浸润,未见溃疡及糜烂。阴性对照组大鼠结肠黏膜充血水肿,不同程度的腺体结构消失,大面积的黏膜坏死脱落形成的溃疡深达肌层,黏膜及黏膜下层可见大量的炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞和中性粒细胞,表层可见纤维素样渗出物(图 2)。组织病理学(His)评分显示,阴性对照组的评分为(2.50±0.59),显著高于正常组(0.08±0.29,Z=-3.522,P < 0.01)。
与阴性对照组相比,HKL组和5-ASA组大鼠结肠黏膜上皮结构破坏程度减轻,腺体排列较规则,黏膜下可见轻度至中度炎细胞浸润。个别大鼠结肠可见出血点、糜烂及溃疡面,主要累及黏膜及黏膜下层,肌层无明显改变(图 2)。His评分结果显示,HKL组和5-ASA组评分分别为(1.30±0.70)、(1.70±0.57);阴性对照组>5-ASA组>HKL组,三组比较差异有统计学意义(χ2=9.428,P < 0.01)。进一步组间多重分析显示,HKL组及5-ASA组His评分均较阴性对照组显著降低(Z=-2.704,P=0.007;Z=-2.197,P=0.028);HKL组与5-ASA组比较差异无统计学意义(Z=-1.447,P=0.148)。
2.4 qRT-PCR结果与正常组比较,阴性对照组大鼠结肠组织IL-6、IL-17、IL-10 mRNA的表达水平均明显上调(P < 0.05),TGF-β1 mRNA的表达水平有下调趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与阴性对照组比较,HKL组和5-ASA组中IL-6、IL-17 mRNA的表达水平明显下调,TGF-β1 mRNA的表达水平明显上调,IL-10 mRNA的表达水平在HKL组中明显下调,差异均有统计学意义(P < 0.05)。HKL组和5-ASA组各指标差异均无统计学意义(P>0.05),见表 3。
组别 | IL-6 | IL-17 | IL-10 | TGF-β1 |
正常组 | 1.00±0.28 | 1.00±0.42 | 1.00±0.28 | 1.00±0.31 |
阴性对照组 | 2.37±0.74a | 4.82±2.74a | 2.45±0.91a | 0.43±0.20 |
HKL组 | 1.39±0.38b | 1.91±1.13b | 1.54±0.56b | 1.22±0.65b |
5-ASA组 | 1.49±0.64b | 1.60±1.25b | 2.21±0.76b | 1.24±0.62b |
a: P < 0.05, 与正常组比较;b: P < 0.05, 与阴性对照组比较 |
2.5 ELISA结果
与正常组比较,阴性对照组大鼠结肠组织中IL-6、IL-17、IL-10蛋白质的表达水平均明显上调,TGF-β1蛋白质的表达水平明显下调,差异均有统计学意义(P < 0.05);与阴性对照组比较,HKL组和5-ASA组中IL-6、IL-17、IL-10蛋白质的表达水平明显下调,TGF-β1蛋白质的表达水平在HKL组中明显上调,且差异均有统计学意义(P < 0.05);HKL组和5-ASA组各指标差异均无统计学意义(P>0.05),见表 4。
组别 | IL-6 | IL-17 | IL-10 | TGF-β1 |
正常组 | 16.01±2.52 | 25.74±2.94 | 12.40±1.85 | 42.35±5.00 |
阴性对照组 | 29.36±3.34a | 45.76±4.97a | 19.86±2.74a | 28.02±2.54a |
HKL组 | 16.70±4.21b | 26.23±3.20b | 15.56±1.08ab | 35.55±3.64ab |
5-ASA组 | 17.48±2.39b | 27.90±2.89b | 15.68±1.72ab | 32.18±3.02a |
a: P < 0.05, 与正常组比较;b: P < 0.05, 与阴性对照组比较 |
3 讨论
UC是一种难治性的慢性肠道免疫性疾病,其发病机制主要与宿主的肠黏膜免疫功能障碍、遗传易感性、共生的肠道菌群紊乱等有关[16-17]。研究发现,细胞因子是肠道炎症中适应性免疫反应的关键介质[18],参与免疫反应和炎症过程。细胞因子间的失衡可以促进免疫细胞间的相互作用,刺激抗原特异性效应细胞的增殖,并引起局部或全身炎症反应[19]。因此,细胞因子平衡被紊乱认为是UC发生肠道非特异性炎症反应的关键环节[20]/sup>, 而针对细胞因子已成为治疗UC的新策略。
IL-6是由肠黏膜固有层T细胞产生的、可以调节免疫反应及多种细胞增殖与分化的一种细胞因子[12],它的过度表达会使中性粒细胞浸润到炎症部位。小鼠体内外实验证实,IL-6与低浓度的TGF-β1共同诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞[21],分泌IL-17、IL-6等具有强烈促炎反应活性的炎症细胞因子,促进自身免疫和炎症的发生[22]。而初始CD4+T细胞在高浓度TGF-β1单独诱导下分化为Treg细胞,Treg细胞通过分泌和调节细胞因子TGF-β1和IL-10抑制炎症反应级联并维持肠道免疫应答的平衡[23]。其中IL-10是细胞免疫反应的负性调节因子,能够下调IL-6等促炎因子的转录和分泌,抑制抗原提呈,从而抑制T细胞介导的免疫反应,在维持肠道上皮完整性中发挥重要作用[24-25]。由此可见,IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β1的交互作用,从而维持抗炎与促炎细胞因子之间的平衡。因此,上述4种细胞因子的异常分泌在肠道黏膜损伤及UC的发生、发展中至关重要,并可能为药物作用的重要靶点。
本研究中动物一般状态、结肠组织大体形态、CMDI评分、病理学评分及HE染色结果均显示,HKL对大鼠UC具有较好的治疗效果。分子实验结果显示,TNBS诱导的UC大鼠结肠组织中IL-6、IL-17 mRNA和蛋白质的表达水平均明显上调,TGF-β1蛋白质的表达水平明显下调而其mRNA的表达水平有下调趋势,与文献[26-27]报道一致。提示UC大鼠结肠组织中IL-6与低浓度的TGF-β1共同作用促进幼稚T淋巴细胞偏向Th17细胞分化,进而上调下游的促炎细胞因子IL-6、IL-17的分泌。随着Th17细胞的分化发育,Treg细胞的分化发育被抑制,减少TGF-β1的分泌,细胞因子间平衡受到破坏,最终可能导致UC的发生。此外,本研究发现UC大鼠结肠组织IL-10 mRNA的表达水平上调,与文献[2, 28]结果一致,重度肠道炎症部位IL-10 mRNA表达高于低炎症部位[29],且与UC的严重程度亦密切相关,活动期明显高于缓解期[30]。同时,本实验中IL-10蛋白质的表达水平也上调,表明在该模型中IL-10的转录活性增强,促进mRNA的表达,随着mRNA的表达升高其蛋白质的表达水平也相应增加。相关研究显示,UC患者高水平的IL-10也可能促进浆细胞的分化,促使UC自身抗体的产生[30],提示IL-10在UC中起着多重而复杂的作用。因此,本模型中IL-10表达的上调可能进一步引起了细胞因子平衡紊乱,加速肠道非特异性炎症的发生。经HKL干预后发现,HKL能够有效降低TNBS诱导的UC大鼠结肠组织促炎因子IL-6、IL-17 mRNA和蛋白质的表达,并提高抗炎因子TGF-β1 mRNA和蛋白质的表达,同时HKL可以降低UC大鼠结肠组织IL-10的过度分泌,缓解细胞因子平衡紊乱所导致的恶性循环,恢复细胞因子之间的平衡状态,促进UC大鼠结肠黏膜组织的愈合。
综上所述,复方缓溃乐混悬剂对大鼠UC具有较好的疗效,在此基础上,应继续研究HKL对IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β1等与其相关T细胞亚群的变化以及对上游信号转导通路的影响,进一步深入探究并新药研发。
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