2. 400042 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院野战外科研究部,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;
3. 570100 海口,海南医学院急诊创伤学院
2. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042;
3. College of Emergency and Trauma, Hainan Medical University, Haikou, Hainan Province, 570100, China
炎症是一种先天的防御机制,可保护机体免受有害的病原体和刺激物等作用的伤害。炎症是一个复杂的、重要的生物学过程,最初涉及增加血流量和免疫细胞的运动,若没有这种稳态反应,创伤和疾病后的感染、伤口或任何损坏的组织将无法治愈[1]。作为机体重要的免疫器官之一,周围淋巴结(peripheral lymph nodes, LN)驻留了大量的成熟T细胞、B细胞和天然淋巴细胞等多种免疫细胞,在机体炎症反应中发挥了重要作用[2-4],但调控LN细胞功能的关键分子仍不清楚。新近研究表明,musculin(MSC)可以影响多种淋巴细胞的功能[5-6], 而曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)则可调控MSC的表达[7]。然而,它们与LN驻留细胞功能的关系少见报道。因此,本研究拟观察TSA对LN细胞分泌功能的影响,为进一步探讨炎症反应的调控机制提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物12只鼠龄为8~12周、平均体质量20 g的C57BL/6雄性小鼠购自陆军特色医学中心实验动物中心,所有动物置于无特定病原体环境饲养。本研究于2018年10月31日获得陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会批准。
1.2 主要试剂与材料曲古抑菌素A(TSA)购自碧云天;二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma;磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自武汉博士德生物工程有限公司;脂多糖(LPS)购自Sigma;TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司;Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自日本TaKaRa公司;MSC、IL-17和IL-22引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,引物信息见表 1。TNF-α和IL-10酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
名称 | 序列 | 长度/bp |
MSC | 上游5′-CACCCTGTGAACCTGACGTG-3′ | 20 |
下游5′-AGGTCCAGAATCCAGTGGGA-3′ | 20 | |
IL-17A | 上游5′-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3′ | 22 |
下游5′-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3′ | 24 | |
IL-22 | 上游5′-CATGCAGGAGGTGGTGCCTT-3′ | 20 |
下游5′-CAGACGCAAGCATTTCTCAG-3′ | 20 | |
GAPDH | 上游5′-TGTTTCCTCGTCCCGTAGA-3′ | 19 |
下游5′-GATGGCAACAATCTCCACTTTG-3′ | 22 |
70 μg细胞筛网购自美国Corning公司,RPMI1640培养基购自Gibco公司;双抗购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司;红细胞裂解液购自碧云天,24孔细胞培养板购自NEST公司;细胞计数板购自Nexcelom公司。
1.3 取材及指标检测取C57BL/6小鼠3只,75%乙醇浸泡消毒后颈椎脱臼法处死,固定小鼠,眼科剪开腹依次取小鼠周围淋巴结(peripheral lymph nodes, LN)、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)、派伊尔结(Peyer’s patches, PP)、脾脏(spleen, SP)、骨髓(bone marrow, BM)和胸腺(thymus, Thy),充分研磨后转移至1.5 mL EP管,2 000 r/min离心5 min,弃上清(SP/BM/Thy细胞悬液需裂解红细胞),加入1 mL TRIzol裂解,实时定量聚合酶链式反应(real-time quantity polymerase chain reaction, qPCR)检测小鼠免疫器官中MSC、IL-17和IL-22的表达。
根据上述实验结果,取高表达MSC、IL-17A和IL-22的免疫组织,制备细胞悬液并计数,将培养的细胞采用完全随机试验方法分为对照组、1 μg/mL脂多糖(LPS)组、1 μg/mL LPS+10 ng/mL TSA组、1 μg/mL LPS +30 ng/mL TSA组和1 μg/mL含LPS +50 ng/mL TSA组,其中LPS使用PBS配制,而不同浓度的TSA使用DMSO配制。将细胞接种于24孔板中,培养基为含双抗(100 U/mL青霉素-0.1 mg/mL链霉素)的RPMI1640,置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养6、12 h和24 h,收集上清和细胞。ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的分泌水平;qPCR检测LN细胞中MSC、IL-17A和IL-22的mRNA水平。
1.4 统计学分析应用GraphPad 6.02进行统计和作图。不同时间点对照组和实验组以及不同浓度组均采用单因素方差分析,计量资料用
qPCR检测结果显示,与周围免疫器官(LN、MLN、PP、SP)相比,尤其是LN,中枢免疫器官(BM、Thy)中MSC、IL-17A和IL-22表达均较低,差异有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01,图 1),此结果表明小鼠周围淋巴结的LN高表达MSC、IL-17和IL-22。
2.2 LN细胞的体外培养
LN细胞以3.4×106个/孔接种于24孔板中,不同浓度的TSA处理LN细胞分别培养6、12 h和24 h,各组各时间点细胞生长状态良好,细胞呈卵圆形,边界分明,透明性好。与对照组相比,细胞培养至12 h时,随着TSA浓度的升高,细胞密度略有降低(图 2)。
2.3 TSA对小鼠LN细胞分泌功能的影响
与LPS组相比,不同浓度TSA处理不同时间点的TNF-α和IL-10的分泌水平均降低(P < 0.05, P < 0.01)。针对TNF-α,随着TSA浓度的升高,TNF-α的分泌水平逐渐下降;针对IL-10,不同浓度TSA处理组之间IL-10的分泌水平无明显趋势。不同浓度TSA处理12 h时,LN细胞分泌TNF-α(P < 0.01)、IL-10(P < 0.05)的水平均低于其他时间点(图 3)。因此,本研究选择TSA作用的最佳时间点为12 h。
2.4 TSA对小鼠LN细胞MSC、IL-22和IL-17A mRNA水平的影响
qPCR检测结果显示,LN细胞培养12 h时,随着TSA浓度的升高,IL-17A和IL-22的mRNA水平显著低于LPS组(P < 0.01),MSC的mRNA水平呈逐渐上升趋势。其中,10 ng/mL TSA刺激后MSC的mRNA水平低于LPS组(P < 0.05),而50 ng/mL TSA处理组的MSC mRNA水平反而升高(P < 0.01,图 4)。
3 讨论
与体内的所有生理反应一样,炎症反应需要加以调节,尤其是与其他宿主防御系统结合发挥作用时。轻度的炎症会导致进行性和有害的组织破坏,而过度的炎症会导致多种疾病,包括过敏、自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病,甚至癌症[8]。炎症、先天免疫和疾病之间的关系被更广泛地接受;然而,许多分子和细胞机制介导这一关系仍未解决。因此,有效的从免疫系统探究新型关于控制和调节炎症的转录因子对于各种疾病的治疗是非常关键的。
淋巴结是机体重要的免疫器官,主要起着过滤淋巴液、清除细菌和异物、产生淋巴和抗体等功能,不同部位的淋巴结因其独特的微环境而表现出不同的免疫功能和特点,而周围淋巴结是机体发生免疫应答的主要场所之一[9]。MULLINS等[10]发现外源性树突状细胞和幼稚T细胞的有限浸润限制了外周淋巴结中的免疫应答。MARTÍN-FONTECHA等[11]发现机体发生炎症反应时,常规的树突细胞、浆细胞和单核细胞通过血液进入外周淋巴结进而发生免疫应答。因此,探索炎症反应与LN的功能关系极为重要。
MSC是碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子,主要由1a(201个氨基酸组成)和1b(180个氨基酸组成)两种蛋白亚型组成[12-13]。研究表明,MSC不但参与了哺乳动物骨骼肌发生、组织发育、分化和再生过程[14],而且能够在创伤和疾病发生后通过淋巴细胞免疫调控机体炎症反应,影响疾病转归[5-6, 15-16]。我们近期的研究也发现,炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)发生后,MSC缺失会引起小鼠MLN中IL-22和IL-17A分泌的细胞功能改变,可能与3型天然淋巴细胞(group 3 innate lymphoid cells, ILC3s, ILC3)有关。这说明MSC在炎症反应中发挥了重要的免疫调控作用,对炎症性肠病的防治具有重要意义和参考价值,但目前尚不清楚MSC是否影响LN的分泌功能。
TSA是一种由羟肟酸衍生的植物化学物质,最初用作抗真菌抗生素,是一种非竞争性,可逆的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)Ⅰ,Ⅱ类抑制剂[17]。研究表明TSA可以通过诱导细胞周期阻滞促进细胞凋亡,抑制血管生成或转移,从而在肿瘤中发挥重要作用[18]。此外TSA可通过抑制细胞增殖和减少炎性细胞因子的产生来治疗溃疡性结肠炎或其他炎性疾病[19]。但TSA在LN中的作用,尤其是对LN分泌功能的影响及相关机制尚不明确。
本研究在确定正常小鼠LN高表达MSC、IL17A和IL-22的基础上,初步探讨了不同浓度的TSA对模拟炎症条件下LN细胞分泌功能的影响,同时检测了TSA处理各时间段MSC、IL17A和IL-22的表达情况,我们发现不同浓度TSA能够降低LN细胞分泌TNF-α和IL-10的水平,并下调IL-17A和IL-22的表达,同时上调MSC,这反映了TSA对LPS刺激LN细胞分泌功能的作用可能与MSC等相关基因有关。结果显示,各浓度TSA作用各时间段都可抑制LN细胞分泌TNF-α和IL-10的水平,表明TSA可能具有抑制炎症反应的作用。而且,TSA对MSC的作用效果并不绝对,即在LPS刺激下,低浓度TSA(10 ng/mL)可以抑制MSC的表达,而高浓度TSA(50 ng/mL)则对MSC表达起促进作用。该结果与文献[7]报道的“TSA可能通过直接或间接的方式抑制MSC表达”不符,可作为TSA对MSC复杂作用的补充。这说明TSA是否直接调控MSC等相关基因或通过其间接抑制TNF-α和IL-10,仍有待进一步的研究。研究表明,小剂量、极低浓度TSA可降低HDAC的作用,而高浓度的TSA以浓度和时间依赖的方式抑制细胞周期,并伴有细胞凋亡[20-21]。本实验采用不同浓度的TSA刺激细胞,虽然细胞密度降低,但细胞生长状态良好,且细胞边界分明,细胞形态均呈椭圆形,并未对细胞增殖能力产生明显的影响,因此,并未产生细胞毒性。基于我们前期研究中发现“不同免疫组织和细胞中MSC、IL-17A和IL-22可能存在密切关系”的初步结论,继续关注TSA对它们的作用规律可能更有利于揭示机体炎症反应调控的机制。
然而,由于LN中免疫细胞类型的多样性以及不同免疫器官功能的异质性,现有结果还无法说明TSA作用的靶细胞,从而在一定程度上限制了TSA研究结论的科学性和广泛性。因此,进一步筛选LN驻留细胞,拓展免疫器官类型,开展TSA干预研究,以揭示TSA通过MSC调控免疫细胞功能的分子机制。
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