2. 401331 重庆, 重庆医科大学附属大学城医院眼科
2. Department of Ophthalmology, University Town Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing, 401331, China
正常角膜处于无血管状态，角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)由内皮细胞、周细胞和基底膜构成，是在炎症、感染和外伤等条件下引起的严重并发症，也是角膜移植成功与否和术后发生排斥反应的关键因素[1]。miRNAs是一类非编码小分子RNA，通过与其靶mRNAs 3′非编码区结合后，抑制mRNA翻译或促进其降解，从而影响靶基因的表达，调节多种生物过程。血管新生是一个由多种促血管miRNAs和抗血管miRNAs共同作用，引起血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)异常表达的复杂过程，研究表明，miRNAs通过靶向VEGF调节肿瘤血管生成[2]。此外，也通过调控微血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成，从而促进或者抑制血管反应[3-4]。MiRNA-200家族包括5个成员(miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141, miRNA-429)，其中miR-200b在不同肿瘤组织中表达异常，通过转录后调节蛋白质的表达以及细胞信号传导，影响肿瘤的增殖、凋亡、侵袭过程[5-8]，但其在角膜新生血管形成中的作用和机制鲜有报道。
本课题组之前采用缝线法建立SD大鼠CNV模型, 对正常和缝线后角膜进行表达谱微阵列分析, 发现miR-200b差异表达显著[9]，提示miR-200b可能是影响大鼠CNV形成的重要调控因子。因此，进一步了解miR-200b在大鼠CNV中的表达及作用机制，可能为CNV的临床治疗提供新的方向和靶点。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物及细胞24只健康、雌性、体质量180~220 g的成年SD大鼠，饲养于重庆医科大学实验动物中心，实验前均需排除角膜新生血管、前房穿孔、出血、晶状体虹膜损伤等疾患。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)从莱博斯生物技术有限公司购买。
1.1.2 主要试剂与仪器miRNA-200b mimic、miR-200b NC购自上海吉玛公司；RNAiso Plus、Mir-X miRNA First Strand Synthesis、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司; CCK-8试剂盒购自美国Bryotime公司, Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；BCA试剂盒购自碧云天公司；兔抗人单克隆抗体PI3KCA、AKT、p-AKT购自英国Abcam公司; VEGF及二抗购自美国Proteintech公司。主要仪器：酶联免疫检测仪(Thermo公司, 美国), Real-time RT-PCR仪(Applied Biosystems，美国)。
1.2 方法 1.2.1 实验动物模型制作24只SD大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠注射液(0.2 mL/100 g)进行麻醉, 选取一眼作为实验组，滴0.04%盐酸奥布卡因眼液后, 参照毛旖旎等[9]构建模型的方法诱导CNV，另一眼(对照组)不作处理。术后双眼均滴盐酸林可霉素眼液3次/d。于建模后第4、7、14天在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管的情况。
1.2.2 HE染色观察角膜组织形态学改变及炎性细胞浸润情况于造模后不同时间点(4、7、14 d)各取6只造模成功的SD大鼠，经腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉致死后摘除眼球，将角膜组织常规固定、脱水、包埋后做成5 μm连续切片，脱蜡后行苏木精-伊红染色，各时间点随机选取4个视野倒置荧光显微镜下拍照，对每个视野进行角膜炎症细胞计数分析。
1.2.3 RT-PCR检测各组大鼠角膜组织miRNA-200b、VEGF mRNA的表达建立大鼠CNV模型后第14天，用TRIzol收取实验组和对照组角膜(n=6)，超声裂解后提取总RNA，分别用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒和Mir-X miRNA First Strand Synthesis逆转录试剂盒逆转录为cDNA后，行RT-PCR检测miR-200b和VEGF的表达。2-ΔΔCt法统计和表示相对表达量。
1.2.4 HUVECs的转染及分组HUVECs用含1%双抗+10%胎牛血清的1640培养基培养，条件为37 ℃、5%CO2。按照Lipofectamine2000试剂说明书。将实验分为3组：miRNA-200b mimic组、miR-200b NC组、CON组。待HUVECs汇合度达60%~70%时按100 nmol/L浓度进行脂质体转染，6 h后吸出旧培养基，换为10%的新鲜培养基，继续培养24~48 h后，收集细胞进行下一步实验。
1.2.5 RT-PCR检测miRNA-200b在HUVECs的表达转染后24 h，根据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，按照Mir-X miRNA First Strand Synthesis逆转录试剂盒一步法逆转录为cDNA，反转录反应条件:37 ℃ 1 h；85 ℃ 5 min；稀释10倍后行RT-PCR，用2-△△Ct法计算和统计miR-200b的表达量。实验重复3次。
1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖能力将处于对数生长期的HUVECs按3 000/孔接种于96孔板。待细胞汇合度达到50%~60%时按上述分组进行干预(n=5), 24 h后更换为10%的CCK-8溶液, 37 ℃继续培养2 h, 酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度值D(450)，观察细胞增殖能力。
1.2.7 划痕实验检测HUVECs的迁移能力以50 000/孔接种HUVECs于6孔板, 待细胞汇合度达到80%~90%时, 用200 μL枪头比着直尺垂直画线, 并用PBS冲洗细胞3次，按上述分组进行转染, 于0、24 h分别在倒置显微镜下拍照记录划痕面积的变化，观察细胞迁移情况。
1.2.8 成管实验观察HUVECs的成管能力将96孔板和200 μL枪头提前预冷。取70 μL/孔Matrigel基质胶(提前4 ℃融化)，使其均匀铺在96孔板底部, 此过程不要产生气泡，37 ℃孵育1 h。将转染24 h后的各组细胞1×104/孔接种至铺有Matrigel基质胶的96孔板内。37 ℃继续培养6 h后在显微镜下拍照，观察形成管腔的个数。
1.2.9 Western blot检测VEGF、PIK3CA、AKT蛋白的表达裂解液收集转染48 h后的各组细胞, 离心后吸取上清，每组取2 μL按BCA试剂盒绘制标准曲线后测定浓度，其余加入上样缓冲液，沸水煮5~10 min，-20 ℃冰箱储存。将蛋白样品12% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜, 5%脱脂奶粉37 ℃封闭1.5 h，兔单克隆抗体4 ℃孵育过夜(GAPDH/AKT/p-AKT 1 :1 000, VEGF 1 :800，PIK3CA 1 :500)。TBST清洗条带3次，室温下孵育二抗1 h，TBST洗3次，凝胶成像系统检测。以目的条带与GAPDH的灰度比值表示所测蛋白的表达水平，实验重复3次。
1.2.10 统计学分析采用Graphpad Prism 5.0软件对数据进行分析，计量资料以x ± s表示，采用独立样本t检验比较两组间数据，3组比较用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 大鼠CNV模型构建及角膜组织形态、炎性细胞浸润情况正常大鼠的角膜透明, 无CNV生长；造模后第4天可见新生血管长入，稀少细小，垂直于角膜缘切线方向生长；第7天可见血管浓密，管径增粗，分支增多，已达缝线处；第14天时CNV超过缝线末端继续生长，角膜水肿明显(图 1)。HE染色结果显示：正常对照组角膜组织排列整齐，无炎性细胞浸润，造模后第4、7、14天可见角膜组织排列紊乱，不规则，炎症细胞浸润数在造模后第4天(123.00±14.49)、7天(170.75±29.06)、14天(223.50±26.15)逐渐增多，两组间差异均具有统计学意义(P < 0.05，图 2)。
|
|
箭头示新生血管 A:正常大鼠的角膜透明, 无CNV生长；B:造模后第4天可见新生血管长入，稀少细小，垂直于角膜缘切线方向生长; C:第7天可见血管浓密、管径增粗、分支增多，已达缝线处; D:第14天时CNV超过缝线末端继续生长，角膜水肿明显 图 1 缝线法构建大鼠CNV模型 (×20) |
|
| A:正常对照组角膜组织，排列整齐，无炎症细胞浸润；B~D:分别为造模后第4、7、14天角膜组织箭头示结构排列紊乱，不规则，炎症细胞浸润逐渐加重 图 2 HE染色观察角膜组织形态学及炎性细胞浸润情况 (×20) |
2.2 miRNA-200b、VEGF在大鼠CNV中的表达
取正常和缝线后第14天角膜组织，采用RT-PCR检测miR-200b/VEGF的表达，结果显示：缝线后第14天，角膜组织中miR-200b表达明显降低，而VEGF表达明显升高，差异有统计学意义(P < 0.01，图 3)。
|
| a：P < 0.01，与正常对照组比较 图 3 RT-PCR检测miRNA-200b、VEGF在两组大鼠CNV中的表达 |
2.3 miRNA-200b在各组细胞中的表达
与miR-NC组(1.216 1±0.811 2)、CON组(3.125 6±0.884 5)相比，miR-200b mimic组(71.759 7±15.622 1) miR-200b的表达量显著升高(P < 0.01)，而miR-NC组、CON组间无明显差异。
2.4 miRNA-200b对HUVECs增殖能力的影响转染后24 h，与miR-NC组、CON组相比，miR-200b mimic组的光密度值显著降低(P < 0.05)，而miR-NC组、CON组间无明显差异(图 4)。提示miR-200b mimic组HUVECs增殖能力被显著抑制。
|
| a：P < 0.05，与miRNA-200b mimic组比较 图 4 CCK-8检测miRNA-200b对HUVECs的增殖能力的影响 |
2.5 miRNA-200b对HUVECs迁移能力的影响
划痕实验结果显示：与miR-NC组、CON组相比，miR-200b mimic组细胞迁移率明显下降(P < 0.05)，而miR-NC组、CON组间无明显差异(图 5)。提示miR-200b mimic组细胞迁移能力被显著抑制。
|
| A:划痕实验检测HUVECs的迁移能力(× 10);B:各组迁移面积a: P < 0.05, 与miR-200b mimic组比较 图 5 miR-200b对HUVECs迁移能力的影响 |
2.6 miRNA-200b对HUVECs成管能力的影响
Matrigel胶成管实验结果显示：与miR-NC组、CON组相比，miR-200b mimic组细胞管腔形成数明显减少(P < 0.05)，而miR-NC组、CON组间无明显差异(图 6)。提示miR-200b mimic组细胞成管能力被显著抑制。
|
| A~C:分别为miR-200b mimic、miR-NC、CON组成管观察(× 20);D:管腔形成数量分析a: P < 0.05, 与miR-200b mimic组比较 图 6 Matrigel胶成管实验检测miR-200b对HUVECs成管能力的影响 |
2.7 miRNA-200b对VEGF、PIK3CA、AKT及p-AKT蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示：与miR-NC组、CON组相比，miR-200b mimic组中VEGF、PIK3CA及p-AKT蛋白表达显著降低(P < 0.05)，而miR-NC组、CON组间无明显差异(图 7)。
|
| A: Western blot检测各通路蛋白表达1~3：分别为miR-200b mimic组、miR-NC组、CON组；B:蛋白相对表达量分析a：P < 0.05，与miR-200b mimic组比较 图 7 Western blot检测miRNA-200b对各组细胞VEGF、PIK3CA、AKT及p-AKT蛋白表达的影响 |
3 讨论
缝线法是目前构建大鼠CNV模型的主要方法，相对于碱烧伤、热烧伤等具有廉价、方便、易操作、易控制等优点[10]。大量文献报道miRNAs参与调节眼部新生血管，如miR-184在缝线诱导的CNV[11]及缺血诱导的视网膜新生血管中表达下调[12]，且通过抑制内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成从而改善眼部新生血管，而miR-142[13]、miR-145[14]起着相反的作用。本研究发现miRNA-200b在大鼠CNV模型中明显下调，这验证了前期基因芯片筛选结果，表明miR-200b可能参与大鼠CNV的形成。目前，HUVECs被广泛作为眼部新生血管的研究对象[11, 13]。为了进一步研究miR-200b在HUVECs中的作用，本研究利用脂质体技术成功转染miR-200b mimic，为后续实验奠定了基础。
近几年研究表明：miR-200b是糖尿病视网膜病变中的关键调节因子，通过直接抑制VEGF信号传导，影响视网膜血管内皮细胞的生长和增殖, 从而改善糖尿病视网膜病变的进展[15-16]；此外，在缺氧条件下，miR-200b通过靶向Ets-1调控人微血管内皮细胞的结构和功能[17]。同样, 本研究发现：与阴性对照组、空白对照组相比，转染后miR-200b mimic组中HUVECs的增殖效率、迁移面积及管腔形成个数显著下降。因此，我们推测miR-200b通过影响内皮细胞增殖、迁移及管腔形成能力调控血管新生。然而，有文献报道miR-200b抑制剂能显著减弱血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力[18]，表明miR-200b对大血管的调控具有细胞特异性，相反的细胞效应表明这其中可能存在不同的分子机制，是一个错综复杂的过程。
VEGF作为血管调控的关键因子，在血管新生中起着举足轻重的作用，临床上抗VEGF药物用于治疗新生血管成效显著。VEGF通过激活下游PI3K/AKT通路调控肿瘤血管的形成及通透性[19]。PI3K主要由p110和p85两个亚基组成，PIK3CA即表示p110α亚基，激活后与p85结合形成异二聚体，从而促进Akt磷酸化驱动肿瘤的形成，进而影响细胞的增殖、凋亡、迁移和生长过程。如在非小细胞性肺癌[20]、宫颈癌[21]、乳腺癌[22]中，PIK3CA参与PI3K/AKT信号传导途径。研究证明miR-200b可通过抑制VEGF表达以及PI3K/AKT信号通路, 实现对人宫颈癌细胞血管生成的抑制[23]，这与本研究结果一致，进一步证实了miR-200b在调节新生血管形成中的分子机制。
本课题组通过Targetscan软件和NCBI Entrez Gene数据库分析得出：PIK3CA可能是miR-200b的靶基因[9]，从蛋白水平得到了验证。下一步实验可通过沉默PIK3CA基因，检测加入抑制剂前后, 参与PI3K/AKT信号通路的相应蛋白的表达以及磷酸化水平是否有改变；同时也可在体内实验中验证我们的观点；此外，研究大鼠CNV模型中miRNAs之间的相互调控作用也是下一步实验的切入点。
总之, 本研究发现miR-200b在大鼠CNV模型中表达下调，而VEGF表达上调。miR-200b的上调能显著抑制HUVECs的增殖、迁移和成管能力，miR-200b可能通过抑制PIK3CA/AKT信号通路而成为CNV的潜在治疗靶点。
| [1] |
BACHMANN B, TAYLOR R S, CURSIEFENV C. Corneal neovascularization as a risk factor for graft failure and rejection after keratoplasty: an evidence-based meta-analysis[J]. Ophthalmology, 2010, 117(7): 1300-5. DOI:10.1016/j.ophtha.2010.01.039 |
| [2] |
HOU P F, LI H L, YONG H M, et al. PinX1 represses renal cancer angiogenesis via the mir-125a-3p/VEGF signaling pathway[J]. Angiogenesis, 2019, 22(4): 507-519. DOI:10.1007/s10456-019-09675-z |
| [3] |
ZHUANG Z, XIAO QIN, HU H, et al. Down-regulation of microRNA-155 attenuates retinal neovascularization via the PI3K/Akt pathway[J]. Mol Vis, 2015, 21: 1173-1184. |
| [4] |
HOU J Y, LIU L, ZHU Q, et al. MicroRNA-185 inhibits angiogenesis in humanmicrovascular endothelial cells through targeting stromal interaction molecule 1[J]. Cell Biol Int, 2016, 40(3): 318-328. DOI:10.1002/cbin.10572 |
| [5] |
LEWIS A, FELICE C, KUMAGAI T, et al. The miR-200 family is increased in dysplastic lesions in ulcerative colitis patients[J]. PLoS ONE, 2017, 12(3): e0173664. DOI:10.1371/journal.pone.0173664 |
| [6] |
FU Y X, LIU X H, ZHOU N T, et al. MicroRNA-200b stimulatestumour growth in TGFBR2-null colorectal cancers by negatively regulating p27/kip1[J]. J Cell Physiol, 2014, 229(6): 772-782. DOI:10.1002/jcp.24497 |
| [7] |
WANG Y C, YIN X H, ZHAO L, et al. MicroRNA-200b inhibits pituitary tumor cell proliferation and invasion by targeting PKCα[J]. Exp Ther Med, 2017, 14(2): 1706-1714. DOI:10.3892/etm.2017.4681 |
| [8] |
LI D F, WANG H, SONG H M, et al. The microRNAs miR-200b-3p and miR-429-5p target the LIMK1/CFL1 pathway to inhibit growth and motility of breast cancer cells[J]. Oncotarget, 2017, 8(49): 85276-85289. DOI:10.18632/oncotarget.19205 |
| [9] |
毛旖旎, 胡雁, 侯胜平, 等. 大鼠角膜缘新生血管微小RNA与血管内皮生长因子相关性分析[J]. 重庆医科大学学报, 2014, 39(8): 1090-1094. MAO Y N, HU Y, HOU S P, et al. Correlation between microRNA expression profiles and VEGF of corneal neovascularization in rats[J]. J Chongqing Med Univ, 2014, 39(8): 1090-1094. DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.000324 |
| [10] |
周小军. DATS对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的影响及机制研究[J]. 国际眼科杂志, 2017, 17(11): 2015-2018. ZHOU X J. Effect of DATS on experimental corneal neovascularization induced by corneal suture in rats cornea[J]. Int Eye Sci, 2017, 17(11): 2015-2018. DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2017.11.06 |
| [11] |
ZONG R R, ZHOU T, LIN Z R, et al. Down-regulation of MicroRNA-184 is associated with corneal neovascularization[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2016, 57(3): 1398-1407. DOI:10.1167/iovs.15-17417 |
| [12] |
SHEN J K, YANG X R, XIE B, et al. MicroRNAs regulate ocular neovascularization[J]. Mol Ther, 2008, 16(7): 1208-1216. DOI:10.1038/mt.2008.104 |
| [13] |
李化, 李彦, 周善璧. MiRNA-142-5p在大鼠角膜新生血管中的作用及机制研究[J]. 第三军医大学学报, 2018, 40(8): 699-704. LI H, LI Y, ZHOU S B. Role of miRNA-142-5p in regulation of rat corneal neovascularization and related pathways[J]. J Third Mil Med Univ, 2018, 40(8): 699-704. DOI:10.16016/j.1000-5404.201711061 |
| [14] |
LIU C H, WANG Z X, HUANG S, et al. MicroRNA-145 regulates pathological retinal angiogenesis by suppression of TMOD3[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 16: 335-347. DOI:10.1016/j.omtn.2019.03.001 |
| [15] |
CHOI Y, YOON S, JEONG Y, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor signaling by miR-200b[J]. Mol Cells, 2011, 32(1): 77-82. DOI:10.1007/s10059-011-1042-2 |
| [16] |
MCARTHUR K, FENG B, WU Y X, et al. MicroRNA-200b regulates vascular endothelial growth factor-mediated alterations in diabetic retinopathy[J]. Diabetes, 2011, 60(4): 1314-1323. DOI:10.2337/db10-1557 |
| [17] |
CHAN Y C, KHANNA S, ROY S, et al. MiR-200b targets Ets-1 and is down-regulated by hypoxia to induceangiogenic response of endothelial cells[J]. J Biol Chem, 2011, 286(3): 2047-2056. DOI:10.1074/jbc.M110.158790 |
| [18] |
LIANG D L, WANG Z X, YAN Z Q, et al. Nicotine facilitates VSMC dysfunction through a miR-200b/RhoGDIA/cytoskeleton module[J]. Sci Rep, 2017, 7: 43798. DOI:10.1038/srep43798 |
| [19] |
CLAESSON-WELSH L, WELSH M. VEGFA andtumour angiogenesis[J]. J Intern Med, 2013, 273(2): 114-127. DOI:10.1111/joim.12019 |
| [20] |
YU Q Q, WU H, HUANG X, et al. MiR-1 targets PIK3CA and inhibits tumorigenic properties of A549 cells[J]. Biomedecine Pharmacother, 2014, 68(2): 155-161. DOI:10.1016/j.biopha.2014.01.005 |
| [21] |
MA Y, WEI S, LIN Y C, et al. PIK3CA as an oncogene in cervical cancer[J]. Oncogene, 2000, 19(23): 2739-2744. DOI:10.1038/sj.onc.1203597 |
| [22] |
ISAKOFF S J, ENGELMAN J A, IRIE H Y, et al. Breast cancer-associated PIK3CA mutations are oncogenic in mammary epithelial cells[J]. Cancer Res, 2005, 65(23): 10992-11000. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-05-2612 |
| [23] |
朱晓志, 王冬梅, 王丽蓉. miR-200b-5p靶向ATAD2调控P13K/AKT信号通路参与宫颈癌血管生成的作用机制[J]. 中国性科学, 2019, 28(7): 42-46. ZHU X Z, WANG D M, WANG L R. The role of mir-200b-5p targeting ATAD2 in the regulation of P13K/Akt signaling pathway in the angiogenesis of cervical cancer[J]. Chin J Human Sexual, 2019, 28(7): 42-46. DOI:10.3969/j.issn.1672-1993.07.010 |
