2. 710032 西安，空军军医大学附属第一医院急诊科
2. Department of Emergency, First Affiliated Hospital, Air Force Medical University, Xi'an, Shaanxi Province, 710032, China
脑生发基质出血(germinal matrix hemorrhage，GMH)是指未成熟脑组织室管膜下区或脑室周围区域的胚性出血[1]。早产儿(< 37周)和低体质量儿(< 1 500 g) GMH发生率约为3.5‰，是新生儿严重的神经系统疾病之一。出血性脑积水(post-hemorrhagic hydrocephalus，PHH)是新生儿GMH最常见、最严重的并发症，可引起严重的、长期的精神运动和认知功能障碍，预后不良[2]。目前，脑室分流术是脑积水的主要临床治疗方法，但其治疗效果还远不能令人满意[3]。炎症在PHH中起重要作用[4]。GMH后炎症因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1上调，促进神经胶质增生，引起血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)损伤和蛛网膜下腔广泛纤维化，增加水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表达，最终加重脑积水[5-6]。作为目前发现的最强促炎因子，脑卒中后，补体C3能够促进小胶质细胞活化和中性粒细胞浸润，从而增强炎性反应，加重脑水肿，预后不良[7]。另外，补体C3在正常压力脑积水患者的脑脊液中被发现激活[8]。众多权威研究表明：脑组织中C3主要表达于星形胶质细胞，C3aR主要表达于小胶质细胞[9-10]。然而，GMH后C3是否上调？星形胶质细胞表达的C3与小胶质细胞表面的C3aR的交互作用是否加重PHH？目前尚不清楚。本研究以新生大鼠GMH模型为基础，探索补体C3/C3aR信号在GMH后脑积水的作用，希望能为GMH后脑积水提供新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 实验动物出生第7天SD大鼠由陆军军医大学实验动物中心提供的大鼠繁殖获取，体质量为15~17 g。实验均按照陆军军医大学动物伦理委员会批准的动物保护指南实施。每组使用同等数量的雄性和雌性幼鼠。除6只大鼠在注射胶原酶(Ⅶ-S型)后24 h内死亡外，其余144只被用于本研究。
1.2 GMH模型建立和实验分组GMH模型由胶原酶(Ⅶ-S型)注射到大脑右侧基底神经节诱导[11]。用3%异氟醚麻醉动物后，俯卧位固定于立体定位仪。头皮区域消毒，暴露前囟。以前囟为参照点向前1.8 mm、向右1.5 mm在颅骨钻孔(1 mm)，直至硬脑膜。Hamilton微量注射泵吸入3个单位胶原酶(Ⅶ-S型，美国Sigma公司)，然后以1 mm/min的速度插入硬脑膜下2.8 mm深，以0.05 μL/min的速度推注胶原酶。注射后保持针头在位10 min，以防止药物返流。取出针后，用骨蜡封住钻孔，缝合切口，37 ℃复温箱复温后放回母鼠身边。
为检测C3aR拮抗剂(complement C3 receptor antagonist，C3aRA)的效果，将新生大鼠按随机数字表法分为假手术组、安慰剂组和C3aRA组，每组每个时间点6只。C3aRA组于GMH后6 h开始腹腔注射1 mg/kg C3aRA(Merck Millipore公司，德国，SB 290157-CAS 1140525-25-2-Calbiochem)，每日1次，连续1周[12]，安慰剂组接受等量的磷酸盐缓冲液(PBS)，假手术组动物只进针不给胶原酶。
1.3 免疫荧光染色和细胞计数麻醉大鼠后，先用0.9%生理盐水心脏灌注，接着用4%多聚甲醛灌注。剥离脑组织并浸泡于4%多聚甲醛，4 ℃条件固定24 h，转入30%蔗糖溶液脱水3~5 d。冰冻切片机将脱水后的脑组织沿冠状位切成层厚30 μm的切片，放入预先配好的防冻液中，置于-20 ℃存储备用。游离切片在PBS中广泛洗涤后，用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，然后用如下一抗孵育，4 ℃过夜：兔来源Iba-1抗体(Wako公司，日本，019-19741)与小鼠来源C3aR抗体(Thermo Fisher公司，美国，MA5-17473)共标；鸡来源GFAP抗体(Abcam公司，美国，ab81355)与C3aR抗体双标；GFAP抗体与兔来源AQP4抗体(Abcam公司，ab81355)共标。第2天用PBS清洗切片，对应二抗室温下孵育1 h。最后用DAPI对细胞核进行染色。共聚焦荧光显微镜(Zeiss，LSM780)观察染好的切片，每个随机视野统计细胞数(荧光显微镜×200)。
1.4 Western blot分析取大鼠各时间点脑室周围组织100 mg，在加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中匀浆(13 000 r/min，20 min)。收集上清液，然后用紫外分光光度法测蛋白浓度。提取蛋白按比例加入上样缓冲液，在95 ℃条件下煮5 min，分装后-80 ℃储存备用。将30 μg蛋白样品用移液枪注入SDS-PAGE凝胶孔，电泳后转移到聚偏氟乙烯膜，然后用5%的脱脂奶粉封闭1 h。封闭后的膜分别用如下一抗孵育，4 ℃摇床过夜：鸡来源GFAP抗体(Abcam公司，ab4674)；兔来源C3抗体(Abcam公司，ab200999)；小鼠来源C3aR抗体(Thermo Fisher公司，MA5-17473)；兔来源AQP4抗体(Abcam公司，ab81355)；兔来源IL-1β抗体(Gene Tex公司，美国，55675)；小鼠来源IL-6抗体(Santa Cruz公司，美国，sc-57315)；兔来源TNF-α抗体(Affinity公司，美国，AF7014)；兔来源TGF-β1抗体(Abcam公司，ab92486)。洗膜缓冲液(TBST)洗膜后37℃条件下用对应的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育1 h，TBST再洗膜3次。ECL+化学发光试剂盒(Thermo Fisher公司，32106)显影目的条带。Image Lab软件对条带进行密度定量。
1.5 MRI检查GMH后1 d和28 d的大鼠麻醉后俯卧位置于MRI球管中，7.0 T/200 mm Varian核磁共振扫描仪(Bruker公司，美国)中，采用T2快速自旋回波序列(TR/TE=3 000/45 ms)扫描。扫描视野为3.5 cm×3.5 cm，矩阵是256×256。取11个冠状面切片(厚度1.0 mm)覆盖整个侧脑室轴。将血肿、侧脑室和海马区勾画出来，用ImageJ软件测量其面积。所有切片的面积和乘以层扫厚度计算体积[13]。每张包含侧脑室的MRI照片中，测量6个固定位置软脑膜表面到皮质下白质的距离，得到平均值，即皮质厚度。图像分析均采用双盲法观察。
1.6 水迷宫实验大鼠在GMH后第23~28天接受Morris水迷宫测试，以评估学习和记忆功能。从测试前5 d起，每天2次，将大鼠放在1个水迷宫池(深50 cm，直径200 cm)装满水(25 ℃)，训练120 s内从4个象限的任意起始点中找到水下平台(直径15 cm)。跟踪监测，记录找到平台前的逃避潜伏期时间和距离。测试当天撤掉水下平台，进行120 s探针实验，每只大鼠测试2次，统计其穿越平台次数和目标象限内的时间和距离百分比。
1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，数据以x±s表示。组织学染色和细胞计数由2名不知分组及给药情况的研究人员进行。采用单因素方差分析或独立样本t检验，然后进行post hoc检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 新生大鼠GMH后3 d脑室周围补体C3、C3aR表达上调免疫荧光染色结果显示：GMH后3 d脑室周围小胶质细胞和星形胶质细胞被激活，数量显著增加。C3aR主要表达在小胶质细胞表面，但几乎不与GFAP共标(图 1A)。统计C3aR/Iba-1共标记细胞的数量，发现GMH后，C3aR/Iba-1共标细胞数量显著增加，3 d达到高峰，并逐渐回归，28 d时与假手术组差异无统计学意义(图 1B)。C3aR的Western blot检测结果与免疫荧光结果一致(图 1C)。在不同时间点对C3进行Western blot检测，结果显示：C3在GMH后显著上调，在3 d达到峰值，然后缓慢下降，28 d时恢复(图 1D)。说明GMH后补体C3和C3aR明显上调，在3 d达到高峰。
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| A:免疫荧光染色；B：细胞计数；C：Western blot检测C3aR表达；D：Western blot检测C3表达 a：P < 0.01，b：P < 0.05，与假手术组比较；V示侧脑室 图 1 补体C3和C3aR在新生大鼠GMH后脑室周围的表达趋势 |
2.2 C3aRA能够减轻新生大鼠GMH后脑积水
GMH后1 d，安慰剂组和C3aRA组血肿体积基本一致，差异无统计学意义(图 2A、B)，3组动物的侧脑室均未见扩张。GMH后28 d，C3aRA组侧脑室扩张程度明显小于安慰剂组(P < 0.01，图 2C)。C3aRA干预可减轻脑积水对海马体积(P < 0.01，图 2D)和皮层厚度(P < 0.01，图 2E)的压迫。
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| A：MRI表现 T2WI图像(冠状位)，黄色虚线表示血肿，白色虚线表示海马，白色实线表示皮层厚度；B：血肿体积；C：侧脑室体积；D：海马体积；E：大脑皮层厚度 a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与安慰剂组比较 图 2 C3aRA对新生大鼠GMH后脑积水的影响 |
2.3 C3aRA能改善GMH新生大鼠的认知功能障碍
Morris水迷宫实验结果显示：在连续5 d的学习中，C3aRA治疗显著降低了潜伏期的时间和距离(图 3，图 4A、B)，说明C3aRA可以减轻GMH引起的学习障碍。探针试验中，C3aRA组比安慰剂组在目标象限穿越平台的次数更多(P < 0.05，图 4C)，花费时间更多(P < 0.05，图 4D)，游泳距离更长(P < 0.05，图 4E)。表明C3aR拮抗剂能够改善GMH诱导的神经功能缺陷。
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| 图 3 各组新生大鼠Morris水迷宫实验 |
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| A：潜伏期时间；B：潜伏期距离；C：穿越平台次数；D：目的象限时间百分比；E：目的象限距离百分比 a：P < 0.01，b：P < 0.05，与假手术组比较；c：P < 0.01，d：P < 0.05，与安慰剂组比较 图 4 C3aRA对新生大鼠GMH后认知功能的影响 |
2.4 C3aRA可以减轻新生大鼠GMH后脑室周围的神经炎症
Western blot结果显示：与安慰剂组比较，GMH后假手术组脑室周围IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的表达明显增加(P < 0.01)，C3aRA能够减少这些炎症因子表达(P < 0.01，图 5)。
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| A：Wester blot检测炎症因子表达；B：半定量分析 1:假手术组；2：安慰剂组；3：C3aRA组；a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与安慰剂组比较 图 5 C3aRA对新生大鼠GMH后急性炎症的影响 |
2.5 C3aRA可以降低GMH后急性期AQP4的表达，抑制GMH后慢性期AQP4异位表达
免疫荧光结果显示：GMH后3 d，脑室周围星形胶质细胞和AQP4表达明显增加(P < 0.01)，C3aRA有效抑制了AQP4(P < 0.05，图 6A、B)和星形胶质细胞(P < 0.05，图 6A、E)表达增加。Western blot检测结果显示了相似的结果(图 6C、D、F、G)。GMH后第28天，3组间AQP4表达差异无统计学意义(图 6A~D)。星形细胞增多、胶质瘢痕、AQP4异位表达导致脑脊液循环受阻，可能在GMH后脑积水形成中发挥重要作用。GMH后28 d时脑室周围可见明显的星形细胞增多症、胶质瘢痕和AQP4表达错位，即血管周围AQP4表达明显降低，而非血管区域AQP4表达增加，C3aRA可以减少上述改变。
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| A：免疫荧光染色 ↑示血管壁AQP4，▲示胶质瘢痕；B荧光强度分析；C：Western blot检测AQP4表达；D：AQP4表达半定量分析；E：GFAP细胞计数；F：Western blot检测GFAP表达；G：GFAP表达半定量分析 a：P < 0.01，b：P < 0.05，与假手术组比较；c：P < 0.05，与安慰剂组比较；V示侧脑室 图 6 C3aRA对新生大鼠GMH后3、28 d时脑室周围星形胶质细胞增殖及其表达AQP4的影响 |
3 讨论
GMH患儿常出现脑瘫、认知障碍、脑积水等严重并发症，其中PHH最常见，且最严重[2]。脑室分流术是目前临床上治疗脑积水的主要方法。但由于脑室分流术的频繁阻塞和感染，脑积水的复发率较高[14]，常需再次手术。其他方法，如连续腰椎穿刺、脑室外引流、脑室内接入装置、脑室帽状腱膜下分流术、内镜下脉络膜丛凝固术等治疗效果均不佳[15]。因此，迫切需要一种非侵入性治疗方法来改善GMH患者的长期生活质量。
炎症反应与PHH形成密切相关。文献[16-17]报道IL-1β、IL-6和TNF-α能够增加反应性星形胶质细胞增生，过量的TGF-β可直接导致PHH[18]。本研究发现C3aRA能显著降低GMH后脑室周围炎性因子的表达，这或许可以解释GMH后C3aRA干预可减轻脑积水。补体C3作为目前公认的最有效的促炎因子，能够促进IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子的表达，诱导中性粒细胞浸润，导致脑出血急性期促炎反应加重[19]。另外，补体C3在常压脑积水患者的脑脊液中被发现激活[13]，提示补体C3可能参与PHH的形成和发展。有研究报道C3和C3aR分别在星形胶质细胞和小胶质细胞中表达[9-10]。LIAN等[9]研究发现阿尔兹海默症模型小鼠中星形胶质细胞和小胶质细胞通过C3/C3aR信号交互作用损害了小胶质细胞吞噬β-淀粉样蛋白(Aβ)的能力。本研究结果表明：GMH后小胶质细胞C3aR表达增加与星形胶质细胞C3表达上调趋势一致，提示星形胶质细胞-小胶质细胞通过C3/C3aR信号交互作用可能在PHH中发挥重要作用，需要进一步研究。
AQP4是脑内最丰富的水通道蛋白，主要表达于星形胶质细胞足突，参与脑脊液循环调节[20-21]。在GMH后急性期，炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α通过NF-κB或MAPK信号通路调控AQP4的表达[22-23]。AQP4表达增加可促进炎症反应，加重脑水肿[24]。在GMH后慢性期，反应性星形胶质细胞增多可导致AQP4异位表达(从足突转移到整个胶质细胞膜)，组织液清除受阻，脑脊液潴留，脑积水形成[25]。本研究中，GMH后3 d，AQP4在脑室周围星形胶质细胞中的表达显著增加，28 d时AQP4的分布发生改变，这与前期研究一致[26]。C3aRA干预显著降低了GMH后急性期(第3天)星形胶质细胞中AQP4的表达，降低了AQP4慢性期(第28天)异位表达，可能在减轻GMH后脑积水中发挥重要作用。
本研究结果表明：脑室周围星形胶质细胞-小胶质细胞交互作用是GMH后脑积水发生、发展的关键过程；C3/C3aR信号是星形胶质细胞和小胶质细胞之间交互作用的一个新的“桥梁”；C3aR拮抗剂可抑制C3/C3aR信号，改善GMH后脑积水及神经功能障碍。本研究为新生儿GMH后脑积水的治疗提供了新的靶点和治疗策略。
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