2. 409099 重庆,重庆市黔江中心医院检验科
2. Department of Clinical Laboratory, Chongqing Qianjiang Central Hospital, Chongqing, 409099, China
在过去的10年中,随着碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)临床分离率不断增加,碳青霉烯酶介导的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenemase-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CP-CRE)感染成为医务工作者关注的热点问题[1]。临床发现的碳青霉烯酶主要包括A类酶(如KPC)、B类酶(如IMP、NDM)及D类酶(如OXA-48)[2-3]。由于新型β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合物(如头孢他啶/阿维巴坦、美罗培南/法硼巴坦)及正在研发的新药(亚胺培南西司他丁/瑞来巴坦)对大多数丝氨酸碳青霉烯酶(A类和D类)有效,但对金属β-内酰胺酶(B类)无效[4],同时针对这些新药的药敏试验没有被广泛应用。因此,临床需要一种快速、经济、准确的方法来检测碳青霉烯酶并区分碳青霉烯酶类型而指导临床用药。近年来,已有报道多种用于检测碳青霉烯酶基因型和表型的分析方法[3, 5]。相较于基因型检测,表型检测更方便和经济。改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method, mCIM)主要用于CRE碳青霉烯酶表型检测,同时该试验具有较高的灵敏度和特异性[6],但它不能区分碳青霉烯酶类型。EDTA碳青霉烯灭活试验(EDTA-carbapenem inactivation method, eCIM)是利用EDTA抑制金属酶的原理,并结合mCIM结果,在产碳青霉烯酶菌株中可进一步区分金属酶和丝氨酸酶。而目前针对mCIM联合eCIM在临床中的应用评价尚无系统性研究报道。因此,本研究采用多中心标本数据资料,涵盖多种肠杆菌科细菌及菌株来源类型,对mCIM和eCIM碳青霉烯酶的检测能力进行临床评价,为流行病学研究和临床治疗提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源收集重庆市16家区县医院2017年1月至2018年9月临床分离的碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌85株及碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌51株,剔除重复菌株。菌株鉴定采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922及肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、ATCC BAA-1705、ATCC BAA-2146均购自重庆索特公司。
1.1.2 仪器及试剂Vitek 2 Compact及配套鉴定卡购自法国生物梅里埃;PCR扩增仪购自ABI公司;电泳仪购自北京六一仪器厂;凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司;血平板和M-H平板购自重庆庞通公司,胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth, TSB)购自杭州滨和公司;美罗培南药敏纸片及厄他培南、亚胺培南、美罗培南抗生素均购自Oxoid公司;MH肉汤(mueller-hinton broth, MHB)购自北京奥博公司;DNA marker DL2000、Taq酶购自TaKaRa公司;琼脂糖购自Hydragene公司;引物由上海生工生物公司合成。
1.2 方法 1.2.1 微量肉汤稀释法MHB配制:参照培养基配制比例,称取2.1 g MHB粉末于100 mL超纯水中,混匀后高压灭菌,放于4 ℃保存备用。抗生素溶液配制:电子天平称取抗生素粉末51.2 mg,各加2.5 mL对应溶剂溶解混匀,溶剂选择参照美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)2018年标准[7],使其浓度达到20 480 μg/mL,滤菌器除菌备用。将20 480 μg/mL抗生素用MHB稀释至2 048 μg/mL,并继续倍比稀释从1 024 μg/mL到1 μg/mL共11个浓度梯度抗生素溶液。菌液配制及加样:从培养18~24 h的血平板上挑取单个菌落,生理盐水调浊度为0.5麦氏浓度菌悬液(1×108 CFU/mL),并用MHB稀释100倍得到1×106 CFU/mL的菌悬液,将各梯度浓度抗生素及菌悬液各50 μL加至96孔板中,使菌悬液终浓度为5×105 CFU/mL,并做好抗生素名称、浓度和细菌编号标记。待加样完成后,轻轻摇晃混匀放入5%CO2孵箱37 ℃培养18~24 h。结果判读:能够完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度即为菌株对该抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值,药敏折点参照CLSI-2018标准[7]。
1.2.2 mCIM和eCIM检测经TSB肉汤管制备、待测菌株接种、10 μg美罗培南纸片浸没及M-H琼脂板药敏等步骤,读取抑菌圈直径结果,操作步骤均参照CLSI-2018[7]要求。①mCIM:抑菌圈直径为6~15 mm或直径为16~18 mm但抑菌圈内有针尖状菌落,则碳青霉烯酶阳性;若抑菌圈直径≥19 mm,则碳青霉烯酶阴性;若抑菌圈直径为16~18 mm或直径≥19 mm但圈内有针尖状菌落,则碳青霉烯酶不确定。②eCIM:当mCIM结果为阳性时,若eCIM纸片与mCIM纸片抑菌圈直径之差Δd≥5 mm,则金属β-内酰胺酶阳性;若Δd≤4 mm,则判为金属β-内酰胺酶阴性,报告检测到丝氨酸碳青霉烯酶。当mCIM结果不确定时,eCIM结果不作解释。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146作为金属碳青霉烯酶阳性对照,以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705作为丝氨酸碳青霉烯酶阳性对照,以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706作为碳青霉烯酶阴性对照。
采用37 ℃过夜培养18~24 h制备纯菌落,DNA提取按照DNA抽提试剂盒说明书进行。依据GenBank上已注册耐药基因序列设计blaKPC、blaIMI、blaSME、blaNDM、blaIMP、blaVIM及blaOXA-48碳青霉烯酶基因引物,引物序列见表 1。PCR反应体系(20 μL):premix Taq酶10 μL,上下游引物各0.4 μL(浓度10 μmol/L),DNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、退火30 s(退火温度见表 1)、72 ℃延伸30 s共35个循环,最后72 ℃延伸10 min。扩增完毕,PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,选取阳性产物送测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 长度/bp | 退火温度/℃ |
blaKPC | 上游AACCATTCGCTAAACTCG 下游TTGACGCCCAATCCC |
781 | 50 |
blaIMI | 上游GCGACAATGGTGCTACTA 下游CTGCGATTACTTTATCCTCA |
453 | 54 |
blaSME | 上游AGACTTTGATGGGAGGAT 下游GCATAATCATTCGCAGTA |
630 | 52 |
blaNDM | 上游GGTTTGGCGATCTGGTTTTC 下游CGGAATGGCTCATCACGATC |
621 | 55 |
blaIMP | 上游CTACCGCAGCAGAGTCTTTG 下游AACCAGTTTTGCCTTACCAT |
587 | 52 |
blaVIM | 上游TCGCATATCGCAACGCAG 下游GTGGGCCATTCAGCCAGA |
500 | 58 |
blaOXA-48 | 上游CCGACCCACCAGCCAATCT 下游AAACGGGCGAACCAAGCA |
494 | 60 |
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件进行分析。CRE菌株产碳青霉烯酶阳性组和阴性组药敏结果差异采用χ2检验,P < 0.05为差异有统计学意义。以PCR结果为标准,计算mCIM和eCIM的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值,置信区间为95%(95%CI),Kappa值>0.750(P < 0.05),说明一致性程度较好。
2 结果 2.1 临床分离菌株的鉴定及药敏试验136株临床分离的肠杆菌科细菌中,碳青霉烯耐药菌株85株(肺炎克雷伯菌49株、阴沟肠杆菌16株、大肠埃希菌15株、弗氏柠檬酸杆菌4株、产气肠杆菌1株),碳青霉烯敏感菌株51株(肺炎克雷伯菌29株、阴沟肠杆菌10株、大肠埃希菌12株)。分离菌株主要来源于痰液(65株)、尿液(44株)、血液(23株)、伤口分泌物(3株)和胸水(1株)。85株CRE中,MIC值表现出高水平耐药,其中碳青霉烯酶阳性组厄他培南MIC50为128 μg/mL,亚胺培南和美罗培南MIC50为64 μg/mL。除厄他培南外,碳青霉烯酶阳性菌株较碳青霉烯酶阴性菌株对碳青霉烯类抗生素耐药率差异有统计学意义(P < 0.001,表 2)。
抗生素 | 菌株(n=85) | 碳青霉烯酶阳性菌株(n=79) | 碳青霉烯酶阴性菌株(n=6) | P值 | ||||||||
R(%) | R(%) | MIC50 | MIC90 | 范围 | R(%) | MIC50 | MIC90 | 范围 | ||||
厄他培南 | 85(100.0) | 79(100.0) | 128 | 512 | 4~512 | 6(100.0) | 4 | 64 | 4~64 | - | ||
亚胺培南 | 81(95.3) | 79(100.0) | 64 | 128 | 4~512 | 2(33.3) | 1 | 32 | 0.5~32 | < 0.001 | ||
美罗培南 | 79(92.9) | 77(97.5) | 64 | 128 | 1~256 | 2(33.3) | 0.5 | 8 | 0.5~16 | < 0.001 | ||
R:根据药敏折点判定为耐药1.2.3碳青霉烯酶基因检测 |
2.2 耐药基因检测结果
85株CRE中,79株检出产碳青霉烯酶基因,6株碳青霉烯酶基因阴性。79株碳青霉烯酶基因阳性菌株中,8株同时携带A类和B类碳青霉烯酶基因,占比10.13%(8/79)。79株碳青霉烯酶阳性菌株具体分布为blaKPC-2 30株、blaNDM-1 24株、blaNDM-5 13株、blaIMP-4 3株、同时携blaNDM-1和blaIMP-8 1株、携带blaKPC-2和blaNDM-1 6株及同时携带blaKPC-2和blaIMP-4 2株,未检出携带blaIMI、blaSME、blaVIM、blaOXA-48耐药基因菌株,结果见表 3。49株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌中,59.19%(29/49)携带blaKPC-2,12.25%(6/49)携带blaNDM-1,8.16%(4/49)携带blaNDM-5,8.16%(4/49)携带blaKPC-2+ blaNDM-1,4.08%(2/49)携带blaKPC-2+ blaIMP-4,8.16%(4/49)未检出产酶基因。15株碳青霉烯耐药大肠埃希菌中,60.00%(9/15)携带blaNDM-5,20.00%(3/15)携带blaNDM-1,13.33%(2/15)携带blaIMP-4,6.67%(1/15)未检出产酶基因。16株碳青霉烯耐药阴沟肠杆菌中,6.25%(1/16)携带blaKPC-2,75.00%(12/16)携带blaNDM-1,6.25%(1/16)携带blaIMP-4,6.25%(1/16)携带blaKPC-2+ blaNDM-1,6.25%(1/16)未检出产酶基因。51株碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌均未检出上述耐药基因。各碳青霉烯酶基因电泳结果见图 1。
Ambler分类 | 碳青霉烯酶基因 | 细菌种类(n) | OMPs | MIC/μg·mL-1 | mCIM | eCIM | ||
ETP | IPM | MEM | ||||||
A | blaKPC-2 | 肺炎克雷伯菌(24) | + | 128~512 | 64~256 | 64~512 | + | - |
肺炎克雷伯菌(3) | + | 8~16 | 4~16 | 4~16 | + | - | ||
肺炎克雷伯菌(2) | + | 128~256 | 32~64 | 32~64 | + | + | ||
阴沟肠杆菌(1) | + | 128 | 32 | 16 | + | - | ||
B | blaNDM-1 | 阴沟肠杆菌(11) | + | 32~256 | 16~128 | 16~128 | + | + |
阴沟肠杆菌(1) | + | 32 | 16 | 16 | Ind | N | ||
肺炎克雷伯菌(6) | + | 8~64 | 8~32 | 4~8 | + | + | ||
大肠埃希菌(3) | + | 16~128 | 4~256 | 4~128 | + | + | ||
弗氏柠檬酸杆菌(3) | + | 16~128 | 16~64 | 8~64 | + | + | ||
blaNDM-5 | 大肠埃希菌(9) | + | 4~256 | 8~128 | 1~128 | + | + | |
肺炎克雷伯菌(4) | + | 64~256 | 32~64 | 32~64 | + | + | ||
blaIMP-4 | 大肠埃希菌(2) | + | 16~64 | 8~16 | 4~16 | + | + | |
阴沟肠杆菌(1) | + | 32 | 8 | 8 | + | + | ||
blaNDM-1+ blaIMP-8 | 弗氏柠檬酸杆菌(1) | + | 512 | 64 | 128 | + | + | |
A+B | blaKPC-2+ blaNDM-1 | 肺炎克雷伯菌(4) | + | 256~512 | 32~128 | 64~128 | + | - |
产气肠杆菌(1) | + | 256 | 64 | 64 | + | - | ||
阴沟肠杆菌(1) | + | 128 | 32 | 32 | + | + | ||
blaKPC-2+ blaIMP-4 | 肺炎克雷伯菌(1) | + | 32 | 32 | 64 | + | - | |
blaKPC-2+ blaIMP-4 | 肺炎克雷伯菌(1) | + | 256 | 64 | 128 | + | + | |
- | Neg | 大肠埃希菌(1) | - | 64 | 32 | 8 | - | N |
Neg | 阴沟肠杆菌(1) | - | 4 | 2 | 2 | - | N | |
Neg | 肺炎克雷伯菌(4) | - | 4~64 | 0.5~32 | 0.5~16 | - | N | |
Neg:碳青霉烯酶基因阴性; OMPs:大肠埃希菌膜孔通道蛋白为OmpF和OmpC, 阴沟肠杆菌膜孔通道蛋白为Omp35和Omp 36, 肺炎克雷伯菌膜孔通道蛋白为OmpK35和OmpK36; ETP:厄他培南; IPM:亚胺培南; MEM:美罗培南; Ind:结果不确定; N:结果不解释 |
2.3 表型筛选试验
79株碳青霉烯酶基因阳性的CRE中,mCIM阳性78株,结果不确定1株。78株mCIM阳性菌株中,eCIM阳性44株。其中2株A类碳青霉烯酶阳性菌株通过mCIM/eCIM被筛选为表达B类碳青霉烯酶,值得注意的是8株同时携带A类和B类碳青霉烯酶基因的菌株(6株携带blaKPC-2+blaNDM-1,2株携带blaKPC-2+blaIMP-4)被筛选为表达A类碳青霉烯酶6株、B类碳青霉烯酶2株(eCIM阴性6株,阳性2株)。6株未检出碳青霉烯酶基因的CRE菌株mCIM均为阴性。51株碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌mCIM结果均为阴性。同时,对不同标本来源菌株进行基因型和表型结果分类,未发现不同标本来源菌株对表型筛选试验结果有影响。结果见图 2和表 3、4。
菌株来源 (n) |
PCR方法基因分类(n=136) | mCIM/eCIM联合检测(n=136) | |||||||||
CRE(n=85) | 非CRE (n=51) |
CRE(n=85) | 非CRE (n=51) |
||||||||
A | B | A+B | - | 产A类酶 | 产B类酶 | 不产碳青霉烯酶 | |||||
痰液(65) | 19 | 15 | 0 | 4 | 27 | 17 | 17 | 4 | 27 | ||
尿液(44) | 5 | 15 | 6 | 2 | 16 | 9 | 17 | 2 | 16 | ||
血液(23) | 5 | 9 | 1 | 0 | 8 | 6 | 8 | 1a | 8 | ||
伤口分泌物(3) | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 | ||
胸水(1) | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | ||
-:为碳青霉烯酶基因阴性; a: mCIM结果不确定 |
2.4 mCIM结果分析
对136株肠杆菌科细菌mCIM结果进行分析,mCIM灵敏度为98.7%,特异性为100.0%,阳性预测值100.0%,阴性预测值98.3%,Kappa值为0.985(P < 0.05,表 5),提示与基因检测结果一致性高。
表型试验 | 结果 | PCR | 灵敏度 [%(95%CI)] |
特异性 [%(95%CI)] |
阳性预测值 [%(95%CI)] |
阴性预测值 [%(95%CI)] |
Kappa值 | |
+ | - | |||||||
mCIM | + | 78 | 0 | 98.7(92.2~99.9) | 100.0(92.1~100.0) | 100.0(94.2~100.0) | 98.3(89.5~99.9) | 0.985 |
- | 1a | 57 | ||||||
a:包含mCIM表型试验结果不确定菌株 |
2.5 eCIM结果分析
eCIM检测金属碳青霉烯酶灵敏度85.7%,特异性94.4%,阳性预测值95.5%,阴性预测值82.9%;检测丝氨酸碳青霉烯酶灵敏度89.5%,特异性100.0%,阳性预测值100.0%,阴性预测值92.2%。Kappa值均大于0.750(P < 0.05,表 6),与基因检测结果一致性较好。
表型试验 | 碳青霉烯酶 | 结果 | PCR | 灵敏度 [%(95%CI)] |
特异性 [%(95%CI)] |
阳性预测值 [%(95%CI)] |
阴性预测值 [%(95%CI)] |
Kappa值 | |
+ | - | ||||||||
mCIM/eCIM | 金属酶 | + | 42 | 2 | 85.7(72.1~93.6) | 94.4(80.0~99.0) | 95.5(83.3~99.2) | 82.9(67.4~92.3) | 0.787 |
- | 7a | 34 | |||||||
丝氨酸酶 | + | 34 | 0 | 89.5(74.3~96.6) | 100.0(90.6~100.0) | 100.0(87.4~100.0) | 92.2(80.2~97.5) | 0.904 | |
- | 4 | 47a | |||||||
a:包含mCIM表型试验结果不确定菌株 |
3 讨论
本研究136株多中心收集的肠杆菌科细菌包含5种常见肠杆菌科细菌,分离自5种不同标本类型,含CRE 85株,非CRE 51株。79株CP-CRE对厄他培南、亚胺培南和美罗培南3种碳青霉烯抗生素MIC50分别为128、64、64 μg/mL,较JIA等[8]报道的高,呈现高水平耐药;同时碳青霉烯酶介导的CRE菌株较非碳青霉烯酶介导的CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药率高,差异有统计学意义。在79株碳青霉烯酶介导的CRE菌株中,分离到8株菌(10.13%)同时携带A类和B类碳青霉烯酶基因,较马玉兰等[9]报道的3.10%高。6株非碳青霉烯酶介导的CRE膜孔蛋白基因均缺失,推测其耐药机制为膜孔蛋白缺失伴超广谱β内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)或AmpC头孢菌素酶(AmpC)表达,从而导致对碳青霉烯类抗生素耐药。同时也有报道患者感染CP-CRE可能比非CP-CRE结局更差[1]。因此,碳青霉烯酶的检测和分型显得尤为重要。
碳青霉烯酶常见的表型筛选方法有碳青霉烯灭活试验(carbapenem inactivation method, CIM)、改良Hodge试验、Carba NP试验等,但存在灵敏度低、试剂成本高等缺点[10]。而采用mCIM和eCIM对碳青霉烯酶进行筛选,操作简便且结果较理想。本研究中,mCIM检测灵敏度为98.7%、特异性为100%,与基因检测结果一致性高,与TAMMA等[11]报道相似。eCIM筛选金属酶的灵敏度为85.7%,特异性为94.4%,灵敏度较CLSI-2018的评价低,主要与本研究中有8株同时携带A类和B类碳青霉烯酶基因菌株相关。8株同时携带A类和B类碳青霉烯酶基因菌株中,有2株经eCIM筛选判定为检测到金属酶,有6株经eCIM筛选判定为检测到丝氨酸酶。6株经eCIM筛选判定为检测到丝氨酸酶可能的原因是虽然EDTA抑制了B类碳青霉烯酶,但其同时携带有A类丝氨酸酶,同样可以水解美罗培南药敏纸片造成Δd≤4 mm至结果判定为金属酶阴性,而报告检测到丝氨酸酶。即本研究发现随着共表达A类和B类碳青霉烯酶基因菌株分离率的增加,eCIM筛选金属酶的灵敏度会降低。而另外2株共表达A类和B类碳青霉烯酶基因菌株经eCIM筛选判定为金属酶阳性可能的原因为EDTA对丝氨酸酶也产生了抑制作用。本研究eCIM试验筛选丝氨酸酶的灵敏度为89.5%,特异性为100.0%,灵敏度较马玉兰等[9]报道的低,主要由2株同时携带A类和B类碳青霉烯酶菌株及2株单产blaKPC-2菌株经eCIM筛选判定为金属酶阳性引起。推测主要原因同样与EDTA对丝氨酸酶产生了抑制作用相关,导致被抑制的丝氨酸酶无法完全水解美罗培南药敏纸片造成Δd≥5 mm而报告金属酶阳性。同时已有报道EDTA对部分丝氨酸碳青霉烯酶存在抑制现象[12],从而导致出现上述结果。因此,当临床分离到高MIC值CRE菌株时,应警惕共表达A类和B类碳青霉烯酶菌株存在,导致mCIM联合eCIM方法筛选金属酶的能力降低。
虽然CLSI尚不要求对CRE菌株进行mCIM和eCIM常规检测,但随着CP-CRE在全球范围的流行,A类和B类碳青霉烯酶抑制剂新药的开发和应用,临床医师迫切需要筛查出产碳青霉烯酶菌株,并对碳青霉烯酶类型进行区分。因此联合mCIM和eCIM对CRE进行碳青霉烯酶表型筛选和类别区分对CRE感染的治疗意义会越来越受到重视。但另一方面,因抗生素的不合理使用及耐药基因的水平传播,CRE检出率及共表达A类和B类碳青霉烯酶的CRE菌株分离率逐年增加,会造成eCIM对金属酶筛选的灵敏度降低,而错误指导碳青霉烯酶抑制剂药物种类的选择,应引起微生物工作者和临床医生的警惕。
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